抄録
本研究では、リアルタイムRT-PCR法を用いた河川水中のクリプトスポリジウムオーシストの高感度定量法を開発した。はじめに、これまでに報告された複数のリアルタイムPCR系に着目し、感度や特異性等の比較を行った。Millerらによって報告されたPCR系は非特異産物を生成せず、感度も良好であったため、最も実用的であると考えられた。次に、Millerらによって報告されたリアルタイムPCR系に逆転写反応を組み合わせたリアルタイムRT-PCR法を構築し、定量感度の向上を試みた。逆転写反応によって、1オーシストあたり約27,000コピーのcDNAが生成されることがわかり、またリアルタイムRT-PCR法の定量下限は7.5×10－4 oocysts/tubeと判断され、極めて低濃度のクリプトスポリジウムオーシスト由来の核酸を定量可能であることがわかった。最後に、構築したリアルタイムRT-PCR法を水環境サンプル中のクリプトスポリジウム濃度の測定に適用し、顕微鏡観察を基本とする従来法と比較した。その結果、新しく構築したリアルタイムRT-PCR法は、特異性の問題を生じることなく、実河川試料からクリプトスポリジウムオーシストを定量することが可能であり、顕微鏡観察による推定オーシスト数と同様の結果が得られた。
