Changes in Test Methods for Internationalization in the Japanese Pharmacopoeia (Part 3): Establishment of a Quantitative Method for Sodium Cromoglicate and Trihexyphenidyl Hydrochloride Using HPLC Analysis

Summary

The Japanese Pharmacopoeia (JP) is an official normative publication for establishing the authenticity and properties and maintaining the quality of pharmaceutical products in Japan. The JP is revised every five years and partially revised in order to respond to the progress of science and technology, the demand for medical care, and international harmonization. Thus, “Internationalization of the JP” is one of the most important issues to address for the revision of the JP, which is also referred to the basic principles for the preparation of the JP 19th edition. For instance, the incorporation of the test methods that have been used in other pharmacopeias, such as the European Pharmacopoeia (EP) and the United States Pharmacopeia (USP), into the JP is one of promising approaches. From this perspective, we have recently reported changes in test methods, establishment of a quantitative test method for the JP-listed clonidine hydrochloride as well as lorazepam from using a potentiometric titration method to using HPLC method. As our ongoing study to change test methods for internationalization, we selected sodium cromoglicate and trihexyphenidyl hydrochloride. Each pharmaceutical product is analyzed using a potentiometric titration method as listed in the 18th JP; however, both the EP and the USP use HPLC method for quantitative analysis of these drugs. In this study, we synthesized the related impurities of sodium cromoglicate and trihexyphenidyl hydrochloride listed in the EP and determined their purities using quantitative NMR. The separation conditions of these compounds were examined using HPLC and simultaneous analyses were performed.

緒言

日本薬局方（Japanese Pharmacopoeia: JP）は，日本の医薬品の性状及び品質の適正を図るために定められた公的な規範書である．そのため，JPで規定される医薬品の試験法には普遍性が要求される．^1） JPは5年毎に改正が行われており，科学技術の進展，医療需要並びに国際調和に対応するため，適宜部分改定等が行われている．^2）われわれはこれまでにJPの品質向上を目的とし，局方試験法における有害試薬の可及的排除について検討してきた．^3）すなわち，局方試験法で使用される有害性の高い溶媒（クラス1若しくは2溶媒）をより安全な溶媒（クラス3）で代替するための検討を実施し，JP17第二追補では旋光度測定法が，^4） JP18では確認試験の他，性状の項目等で改正が行われた．^5）今日では医薬品規制調和国際会議（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use: ICH）で合意された品質ガイドライン^6）のJPへの取り込みも進んでおり，JP17第二追補では化学合成医薬中に含まれる不純物の種類とその管理についての記載が行われたことからも，国際的な品質保証の考え方が重要視されている．このような背景から，われわれはJP19作成基本方針の5本の柱^2）である，「保健医療上重要な医薬品を優先して収載することによる収載品目の充実」，「最新の学問・技術の積極的導入による質的向上」,「医薬品のグローバル化に対応した国際化の一層の推進」，「必要に応じた速やかな部分改正及び行政によるその円滑な運用」，「日本薬局方改正過程における透明性の確保及び日本薬局方の国内外への普及」のうち，「最新の学問・技術の積極的導入による質的向上」及び「医薬品のグローバル化に対応した国際化の一層の推進」として，米国薬局方（United States Pharmacopoeia: USP）や欧州薬局方（European Pharmacopoeia: EP）など他局で規定されているより優れた試験方法について，JPでの採用の可能性を検討してきた．具体的には，JP18収載品目であり，定量法として電位差滴定法が設定されているクロニジン塩酸塩，^7）ロラゼパム^8）について，HPLCを用いた定量法への変更に向けた検討を報告した．定量において電位差滴定法とHPLC法はいずれも汎用測定法であるが，不純物に対する選択性を考慮すると，HPLCによる分析がより適していると考えられる．また，上記の試験法の変更のための検討は，将来的な薬局方の調和を図るためにも重要である．本研究では，JP18収載品目であり定量法として電位差滴定法が設定されているクロモグリク酸ナトリウム^9）及びトリヘキシフェニジル塩酸塩^10）について，HPLCによる定量法設定を目的とし，各類縁物質の化学合成，定量NMR（quantitative NMR: qNMR）による類縁物質の純度決定及び各化合物のクロマトグラム上における完全分離条件について検討を行った．

実験方法

1. 試料

化合物合成用の溶媒としては，富士フイルム和光純薬社（大阪）製を用いた．クロモグリク酸ナトリウム及びトリヘキシフェニジル塩酸塩の類縁物質の合成のための試薬として，3-クロロプロピオフェノン（東京化成，東京），ピペリジン（Sigma-Aldrich, St. Louis），塩化水素・1,4-ジオキサン溶液（約4 mol/L）（富士フイルム和光純薬），水酸化ナトリウム（富士フイルム和光純薬）を使用した．合成用及びqNMR測定用の試薬として，クロモグリク酸ナトリウム［for Pharmacology Research，富士フイルム和光純薬，Code No.193-15231, Lot. APM2019，純度98.0+%（calculated on the dried basis）］，2′,6′-ジヒドロキシアセトフェノン（東京化成工業，Code No. D1716, Lot.JCFFG-MM，純度 >97.0+%），トリヘキシフェニジル塩酸塩（東京化成工業，Code No. T3303, Lot.PW4KD-JI，純度 >98.0+%）を使用した．

qNMR用基準物質としては，認証標準物質［（national metrology institute of Japan: NMIJ）（certified reference material: CRM）］であるdioctyl sodium sulfosuccinate（DSS）-d₆［Sodium 3-（trimethylsilyl）-1-propane-1,1,2,2,3,3-d₆-sulfonate, molecular weight（MW）=224.36, Lot. KPE1040，純度92.3%］，若しくは1,4-bis（trimethylsilyl）benzene-d₄［（1,4-BTMSB-d₄），MW=226.50, Lot. TWN2900，純度99.9%］（富士フイルム和光純薬）を使用した．qNMR測定用の重溶媒には，重ジメチルスルホキシド［dimethyl sulfoxide（DMSO）-d₆］［Acros（Geel），Lot.A0401114］及び重アセトン（Acetone-d₆）［Acros（Geel），Lot.A0413052］を用いた．

2. 器具及び装置

反応の追跡は薄層クロマトグラフィー（TLC）（60 F254, Merck, Darmstadt）を使用し，スポットの可視化はUVランプ（254/365 nm）（UVP, Upland）による紫外線照射，及びヨウ素蒸気により行った．カラムクロマトグラフィー用のシリカゲルには，中圧カラムクロマトグラフィー装置（Smart Flash）（山善，大阪），及び中圧カラムクロマトグラフィー用充填カラム（Inject column/Hi-Flash column, 40 µm）（山善）を使用した．融点（melt point: mp）の測定はMP-500V（ヤナコ計測，京都）を使用し，補正せずに測定を行った．高分解能質量分析（high resolution mass spectrometer: HR-MS）はShimadzu IT-TOF MS（島津，京都）にて，エレクトロスプレーイオン化法にて測定した．HPLCシステムとしては，PDA検出器（MD-4015），ポンプ（PU-4100），カラムオーブン（CO-4060），オートサンプラー（AS-4050）を備えたEXTREMA（日本分光，東京）を使用した．分析用のocta decylsilyl（ODS）カラムとして，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の分析には，JASCO Vario ASB C18（C18, 4.6×250 mm, 5 µm）（日本分光），またトリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質の分析には，Mightysil RP-18 GP II（C18, 4.6×150 mm, 5 µm）（関東化学，東京）を使用した．HPLC分析の移動相溶媒としては，蒸留水（関東化学，Code No. 11307-2B）及びアセトニトリル（Sigma-Aldrich, Code No. 34888-2.5L）を使用した．

3. 類縁物質合成の際のNMR測定

¹H-NMR及び¹³C-NMRスペクトルは重水素化溶媒（関東化学）を使用して，ECZ 600R spectrometer（日本電子，東京）で測定した．化学シフト値（ppm）は溶媒シグナルを内部標準として補正した（DMSO-d₆: 2.50 for ¹H-NMR, 39.5 for ¹³C-NMR; MeOH-d₄: 3.31 for ¹H-NMR, 49.0 for ¹³C-NMR）．シグナルの分裂様式は以下に示す通りである［singlet（s），doublet（d），triple（t），double of doublets（dd），doublet of doublets of doublets（ddd），multiplet（m），broad（br）］．

4. qNMRにおける秤量及びNMR測定

天秤は，ウルトラミクロ天秤XPR2UV（Mettler Toledo, Columbus）（最小表示値0.0001 mg）を使用した．サンプル秤量の際の風袋としては，アルミニウム製計量ボート（Sigma-Aldrich, Code No. W1126-100EA）を使用した．¹H-qNMRは，JNM-ECA600（600 MHz）及びECZ600（600 MHz）（Super Cool probe）（日本電子）を使用し，化学シフト値は，qNMR用基準物質を基準シグナル（0 ppm）とし，δ値をppm単位で表した．NMR試料管はWilmad-LabGlass（Vineland）製535-ppを使用した．

5. qNMRの試料溶液の調製及び測定条件

各試薬約5 mg, qNMR用基準物質約1 mgをそれぞれ精密に量り採り，風袋毎同一の容器に入れNMR測定溶媒1 mLに溶解した．この溶液0.6 mLをNMR試料管に封入したものを試料溶液とした．観測スペクトル幅は20 ppm，デジタルフィルタを使用し，スペクトル中心は5 ppmの位置に設定，パルス幅は90度パルスとなる時間に設定し，取り込み時間4秒，デジタル分解能（Resolution）0.25 Hz，遅延時間60秒，オートFGシムによるシム調整，測定温度は室温（21–24°C）とし，MPF8による¹³Cデカップル実施，ダミースキャン2回とし，積算回数はS/N>200になる回数として8回又は16回行った．内部標準法（accurate quantitative NMR with internal reference substance: AQARI）により，原則として各試料について3回秤量，調製した後，非連続に3回測定を行った．NMRデータの処理は，日本電子（株）製Purity Proを使用，qNMR用基準物質のトリメチルシリルシグナルを0 ppmとし，マニュアル法で位相補正，オートベースライン補正を行い，マニュアル法で各シグナルの積分範囲を決定した．また，本報告では積分値は，すべて純度換算（%）により表示した．既報^11）を参考に，試薬の純度は以下のEq.（1）を用いて算出した．

  

(1)

• I=シグナル強度（積分値），H=プロトン数（官能基の水素の数），
• W=質量（秤量値），M=分子量，P=純度（%），
• std, sample=qNMR用基準物質およびサンプル

DSS-d₆の特定基のプロトン数（DSS-d₆=CH₃×3, 1,4-BTMSB-d₄）の特定基のプロトン数（1,4-BTMSB-d₄=CH₃×6），分子量（MW）；DSS-d₆: MW 224.36, 1,4-BTMSB-d₄: MW 226.50，クロモグリク酸ナトリウム：MW 512.33，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質A: MW 152.15，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質B: MW 524.48，トリヘキシフェニジル塩酸塩：MW 337.93，トリヘキシフェニジル塩酸塩A: MW 217.31．

6. HPLC測定における試料の調製及び分析条件

6-1. クロモグリク酸ナトリウム類縁物質

各試料をTable 1に記載の移動相AとBの混液（1 : 1, v/v）にて溶解（終濃度；クロモグリク酸ナトリウム：1 mM，類縁物質A: 5 mM，類縁物質B: 0.3 mM）させ，0.45 µmのシリンジフィルターでろ過した溶液を分析用の試料溶液とした．試料導入量は10 µLとし，カラム①を使用して分析を行った．測定条件はTable 1に記載のとおりである．

Table 1. Comparison of HPLC Conditions for Sodium Cromoglycate between EP (Ph. Eur. 10.0) Method and the One Used in This Study

	EP condition	Modified condition (This study)
Column	ODS (base-deactivated end-capped), 4.6×150 mm, 3 µm	ODS (resistant to acidic pH ~2), 4.6×250 mm, 5 µm
Column temperature	n/a	40°C
Mobile phase	A: acetonitrile, 10 g/L solution of tetrabutylammonium hydrogen sulfate (5 : 95, v/v)　 B: acetonitrile, 10 g/L solution of tetrabutylammonium hydrogen sulfate (50 : 50, v/v)	A: 20 mM sodium phosphate (adjust to pH 2.0 with phosphoric acid)　 B: acetonitrile
Gradient program (Solution B conc.)	0 to 100% (0–15 min), 100 to 0% (15–20 min)	0 to 20% (0–5 min), 20 to 100% (5–10 min), 100% hold (10–30 min)
Flow rate	1.0 mL/min	1.0 mL/min
Detection	330 nm	240 nm

n/a: Not available

6-2. トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質

各試料をTable 2に記載の移動相Aにて溶解（終濃度：トリヘキシフェニジル塩酸塩：0.6 mM，類縁物質A: 0.2 mM）させ，0.45 µmのシリンジフィルターでろ過した溶液を分析用の試料溶液とした．試料導入量は10 µLとし，カラム②を使用して分析を行った．測定条件はTable 2に記載のとおりである．

Table 2. Comparison of HPLC Conditions for Trihexyphenidyl Hydrochloride between EP (Ph. Eur. 10.0) Method and the One Used in This Study

	EP condition	Modified condition (This study)
Column	ODS, 4.6×150 mm, 5 µm	ODS, 4.6×150 mm, 5 µm
Column temperature	n/a	40°C
Mobile phase	0.1% triethylamine in water (adjust to pH 4.0 with phosphoric acid), acetonitrile (20 : 80, v/v)	A: 0.1% triethylamine in water (adjust to pH 4.0 with phosphoric acid)B: acetonitrile
Gradient program (Solution B conc.)	isocratic	20 to 55% (0–20 min)
Flow rate	1.0 mL/min	1.0 mL/min
Detection	210 nm	210 nm

n/a: Not available

結果及び考察

1. 類縁物質の化学合成

1-1. クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の合成

EP記載のクロモグリク酸ナトリウム類縁物質B（2, Fig. 1）は，エタノール中，塩化水素・1,4-ジオキサン溶液（約4 mol/L）を添加し加熱還流してエチルエステル化することで調製した（Scheme 1）．以下に詳細な手順と化合物のデータを記載する．

Fig. 1. Chemical Structures of Sodium Cromoglycate and Its Impurities A (1) and B (2) in EP

Scheme 1. Chemical Synthesis of Sodium Cromoglycate Impurity B (2)

Diethyl 5,5′-［（2-hydroxypropane-1,3-diyl）bis（oxy）］bis（4-oxo-4H-chromene-2-carboxylate）（2）  クロモグリク酸ナトリウム（5.12 g, 10.0 mmol）のエタノール懸濁液（160 mL）に4 M塩酸-1,4-ジオキサン溶液（40 mL）を加えて，80°Cにて36時間加熱撹拌した．反応液を室温に冷却後，乾固するまで溶媒を減圧留去した．残渣を熱エタノール（250 mL/g）から再結晶し，無色綿状結晶固体として得た（4.77 g, 91%）．この化合物の一部に対して更に再結晶を行い，得られた固体をサンプルとして使用した．

¹H-NMR（DMSO-d₆）δ: 7.70（2H, dd, J=8.4, 7.8 Hz, H-7），7.17（2H, dd, J=8.4, 0.6 Hz, H-8），7.10（2H, d, J=7.8 Hz, H-6），6.71（2H, s, H-3），5.37（1H, d, J=3.6 Hz, OH），4.38–4.34（2H, m, H-7, H-11），4.36（4H, d, J=7.2 Hz, H-14），4.31–4.29（3H, m, H-11, H-12），1.33（6H, t, J=7.2 Hz, H-15）; ¹³C-NMR（DMSO-d₆）δ: 176.6（C-4），160.1（C-13），158.5（C-2），157.2（C-5），150.2（C-9），135.4（C-7），115.4（C-3），114.6（C-10），110.3（C-6），109.1（C-8），70.2（C-11），67.1（C-12），62.7（C-14），13.9（C-15）; ESI-HRMS m/z 525.1394（Calcd for C₂₇H₂₅O₁₁［M+H］⁺: 525.1391）; mp（EtOH）: 182–185°C.

1-2. トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質の合成

EP記載のトリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質（3, Fig. 2）の合成は，3-クロロプロピオフェノンに対してピペリジンを求核剤として反応させることで行った（Scheme 2）．得られた3は油状物質であったが，秤量など取り扱いの観点からは固体として取り扱えることがより望ましいと考えられた．そこで，遊離アミンである3を塩化水素・1,4-ジオキサン溶液で処理して塩酸塩4とすることで，固体化することができた．以下に調製の詳細な手順と化合物のデータを記載する．

Fig. 2. Chemical Structures of Trihexyphenidyl Hydrochloride and Its Impurities A (3) and A-HCl (4) in EP

Scheme 2. Chemical Synthesis of Trihexyphenidyl Hydrochloride Impurity A (3) and Its Hydrochloride Salt (4)

1-Phenyl-3-（piperidin-1-yl）propan-1-one（3）及び1-Phenyl-3-（piperidin-1-yl）propan-1-one hydrochloride（4）  3-クロロプロピオフェノン（1.0 g, 5.93 mmol）のジクロロメタン溶液（12 mL）にピペリジン（294 µL, 2.97 mmol）を加えて，室温にて20時間撹拌した後，反応液を減圧留去した．残渣をジエチルエーテルに懸濁させ，濾取，洗浄して真空乾燥することで無色固体として得た（710 mg）．得られた固体に2 M水酸化ナトリウム水溶液を加えてジクロロメタンで3回抽出し，合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥，濾過して減圧留去した．得られた油状物質をNH（アミノ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル=100 : 0 to 15 : 85）に付すことで遊離のアミン体3を淡黄色油状物質として得た（979 mg, 76%）．

¹H-NMR（MeOH-d₄）δ: 8.00（2H, dd, J=8.4, 1.2 Hz, H-2′ and 6′），7.60（1H, t, J=8.4 Hz, H-4′），7.50（2H, dd, J=8.4, 8.4 Hz, H-3′ and 5′），3.25–3.23（2H, m, H-3），2.78（2H, t, J=7.5 Hz, H-2），2.49（4H, br, H-4），1.62（4H, ddd, J=16.8, 10.8, 5.4 Hz, H-5），1.48（2H, br, H-6）; ¹³C-NMR（MeOH-d₄）δ: 200.7（C-1），138.2（C-1′），134.4（C-1′），129.8（C-2′），129.1（C-3′），55.5（C-4），54.8（C-3），36.5（C-2），26.6（C-5），25.1（C-6）; ESI-HRMS m/z 218.1540（Calcd for C₁₄H₂₀NO: 218.1539［M+H］⁺）

遊離のアミン体3（2.12 mmol）を4 M塩酸-1,4-ジオキサン溶液に溶解させ，溶媒を減圧留去して生じた固体をジエチルエーテルに懸濁させ，濾取，洗浄して真空乾燥することで塩酸塩4を無色固体として得た（536 mg, 96%）．

¹H-NMR（DMSO-d₆）δ: 10.0（1H, brs, N-HCl），8.02（2H, dd, J=7.8, 0.9 Hz, H-2′ and 6′），7.69（1H, t, J=7.8 Hz, H-4′），7.58（2H, dd, J=7.8, 7.8 Hz, H-3′ and 5′），3.64（2H, d, J=5.1 Hz, H-3），3.49（2H, d, J=12.0 Hz, H-4），3.38（2H, d, J=5.1 Hz, H-2），2.93（2H, dd, J=10.8, 10.8 Hz, H-4），1.82–1.80（2H, m, H-5），1.74–1.69（3H, m, H-5, H-6），1.41–1.37（1H, m, H-6）; ¹³C-NMR（DMSO-d₆）δ: 196.7（C-1），135.9（C-1′），133.7（C-4′），128.8（C-2′），128.0（C-3′），52.3（C-4），51.1（C-3），32.8（C-2），22.5（C-5），21.3（C-6）; mp: 199–201°C.

2. 化合物のqNMRによる純度決定

2-1. クロモグリク酸ナトリウム類縁物質のqNMRによる純度決定

HPLC分析に使用した試薬及び合成した化合物（Fig. 1）は¹H-qNMRによって純度を決定した（Table 3）．例として，類縁物質B（2）のNMRチャートをFig. 3に示している．各試料の定量シグナルは，不純物由来のシグナルなど妨害ピークが観測されないシグナルを選択した．クロモグリク酸ナトリウムにおいては芳香環のプロトン［7位（7.65 ppm, t），8位（7.16 ppm, d），6位（7.04 ppm, d）及び3位（6.50 ppm, s）］を定量シグナルとして選択し純度を求めた結果，絶対純度は83.93±0.46%と算出された．今回使用したクロモグリク酸ナトリウムは試薬会社から購入した試薬（純度98%）であり，¹H-NMR測定の結果，水以外の不純物は検出されなかったことから測定に供したサンプルは吸湿していたことが考えられた．JP18記載の方法（乾燥減量；減圧，105°C, 4時間）^9）でサンプルを乾燥させて重量を測定したところ，乾燥前後で本来の純度（98%）と測定で得られた絶対純度の差分に相当する水分が含まれていることがわかった．このことから，クロモグリク酸ナトリウムのqNMRでの純度の値付けが適切に実施できていることが確かめられた．また類縁物質A（1）については4位（7.27 ppm, t）及び3,5位（6.39 ppm, d）を定量シグナルとした結果，絶対純度は99.29±0.34%であった．類縁物質B（2）については7位（7.75 ppm, t）及び15位メチルプロトン（1.34 ppm, t）を定量シグナルとした結果，絶対純度は94.90±0.39%であった．

Table 3. Purity (%) of Sodium Cromoglycate, Its Impurities A (1) and B (2) Determined by ¹H-qNMR

Sample	NMR solvent	Internal standard	Target signals (ppm)	Average±standard deviation (S.D.) (%) of target signals
Sodium cromoglycate	DMSO-d6	DSS-d6	H-7 (7.65, t)	83.93±0.46
			H-8 (7.16, d)
			H-6 (7.04, d)
			H-3 (6.50, s)
Impurity A (1)	DMSO-d6	DSS-d6	H-4 (7.27, t)	99.29±0.34
			H-3,5 (6.39, d)
Impurity B (2)	DMSO-d6	DSS-d6	H-7 (7.75, t)	94.90±0.39
			H-15 (1.34, t)

Fig. 3. ¹H-qNMR Spectrum of Sodium Cromoglycate Impurity B (2) in DMSO-d₆

2-2. トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質のqNMRによる純度決定

HPLC分析に使用した試薬及び合成した化合物（Fig. 2）は，¹H-qNMRによって純度を決定した（Table 4）．代表例として，類縁物質A（3）のNMRチャートをFig. 4に示している．トリヘキシフェニジル塩酸塩については，2′,6′位（7.40 ppm, d），3′,5′位（7.34 ppm, t）及び4′位（7.24 ppm, t）を定量シグナルとして選択し絶対純度を算出した結果，99.46±0.26%であった．類縁物質A（3）では，2位（2.91 ppm, t）を定量シグナルとして選択した結果，絶対純度は96.92±0.41%であった．今回，類縁物質A（3）は塩酸塩4とすることで固体化できたため，保存や秤量における取り扱いが容易となった．しかしながら，NMR測定の結果から4は溶液中での経時的な分解が観測され，Fig. 5に示す化合物［1-Phenyl-2-buten-1-one（5）］が生成していることがわかった（Fig. 5：室温，2時間）．この経時的な分解反応は重ジメチルスルホキシドのほか，複数の測定溶媒中においても確認されており，少なくとも溶液調製後30分以内で観測されたことから，qNMR測定で正確な純度を決定することが困難であった．一方で，遊離のアミン体である3においてこのような分解は観測されなかったことから，この顕著な分解反応はアミン塩の溶液中における特有の現象であることがわかった．Fig. 5の¹H-NMRで観測された結果から，Fig. 6に示すような反応が起こっていることが推測された．この反応ではα位のプロトンが塩基により引き抜かれ，同時にピペリジンが脱離することによってFig. 5で観測された化合物5が生成する．アミン塩酸塩4では脱離基となるピペリジンの窒素がプロトン化を受けるため，より脱離反応が進行しやすくなっていると考えられ，実際に類似の基質によって同様の反応が起こることが報告されている．^11）そのため今回はトリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質Aについては遊離のアミン3を分析用サンプルとして使用した．

Table 4. Purity (%) of Trihexyphenidyl Hydrochloride and Its Impurity A (3) Determined by ¹H-qNMR

Sample	NMR solvent	Internal standard	Target signals (ppm)	Average±S.D. (%) of target signals
Trihexyphenidyl hydrochloride	DMSO-d6	DSS-d6	H-2′,6′ (7.40, d)	99.46±0.26
			H-3′,5′ (7.34, t)
			H-4′ (7.24, t)
Impurity A (3)	Acetone-d6	1,4-BTMSB-d4	H-2 (2.91, t)	96.92±0.41

Fig. 4. ¹H-qNMR Spectrum of Trihexyphenidyl Hydrochloride Impurity A (3) in Acetone-d₆

Fig. 5. ¹H-NMR Spectrum of the Decomposition Product from 4 in MeOH-d₄

Fig. 6. HPLC Chromatograms of a Mixture of Sodium Cromoglycate, Its Impurities A (1) and B (2) Using the Modified Method

3. 各類縁物質のHPLC分析

3-1. クロモグリク酸ナトリウム類縁物質のHPLC分析

EPでは，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質のHPLC分析においてイオンペア試薬として硫酸水素テトラブチルアンモニウムが添加された移動相が規定されている（Table 1左，　EP condition）．^13）このイオンペア試薬にはクロモグリク酸ナトリウムのカルボキシアニオンとアンモニウム塩間でのイオン対を形成させてサンプルの解離を抑制し，分析カラムの充填剤に対する保持を良好にする効果がある．しかしながら，このイオンペア試薬は比較的高濃度で使用する必要があること，またHPLCに適用される純度の試薬は比較的高価であることから，イオンペア試薬を使用しない，より汎用的な条件での分析を試みた．まず，ODSカラムを使用し，蒸留水とアセトニトリルを移動相とした条件にて分析を実施した．しかしながら，この条件ではクロモグリク酸ナトリウムのピークが保持されず保持時間が安定しない結果となった．これは当初予想された通り，クロモグリク酸ナトリウムがカルボン酸構造を有することから，緩衝能のない移動相中においてはカルボキシ基のイオン形と分子系が混在しているためと考えられた．そこで，カルボキシ基のプロトン（H⁺）の解離を抑制するために，低pH条件に耐性のあるODSカラムを用いて酸性（pH 2.0）の移動相（Table 1右，modified condition）を使用して分析したところ，クロモグリク酸ナトリウムの保持を改善することができた．この際，移動相Aである酸性のリン酸緩衝液でカラムを平衡化してから分析を開始することがクロモグリク酸ナトリウムを良好に保持するために必要であった．この条件を類縁物質との一斉分析に適用することで，各化合物ピークのHPLCクロマトグラム上での完全分離（分離度1.5以上）を達成できた（Fig. 7, Table 5）．クロマトグラム上で検出されたクロモグリク酸ナトリウム及びその類縁物質の各ピーク強度について，吸収波長による違いを確認したところ，EPで規定されている330 nmよりも240 nmで検出した場合の方がすべての化合物において，ピーク強度が高いことがわかった．そのため，本研究においては検出波長として240 nmを採用した．クロマトグラム上における各化合物のピーク特異性^14）については，分離度以外にピークの単一性の評価として各化合物の分析を個別に行い，不純物シグナルなどが重なっていないことを確認した．また，クロモグリク酸ナトリウムのピークについて，多波長検出器によりピークの頂点及び頂点の前後でピーク高さの中点付近の2時点を含む3点でのピークの吸収スペクトルを比較し，スペクトル形状に差が無いことの確認を行った．

Fig. 7. HPLC Chromatograms of a Mixture of Sodium Cromoglycate, Its Impurities A (1) and B (2) Using the Modified Method

Table 5. Comparison of Retention Time and Resolution of the Specific Peaks of Sodium Cromoglycate, Its Impurities A (1) and B (2) on HPLC Chromatogram

Specific peaks	Retention time (min)	Resolution
Sodium cromoglycate	13.6	11.0
Impurity A (1)	16.8	11.5
Impurity B (2)	20.3	N/A

N/A: Not applicable

3-2. トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質のHPLC分析

トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質のHPLC分析では，まずEP（Ph. Eur. 10.0）に記載の分析条件^15）（Table 2左，EP condition）を参考にして実施した．EP記載の移動相条件（isocratic）では化合物の保持が不良であり分析が困難であったため，より緩やかな移動相グラジエントを適用した条件にて分析を検討した．Table 2右に示すグラジエント条件（modified condition）を用いてトリヘキシフェニジル塩酸塩と類縁物質A（3）の同時分析を実施した結果，HPLCクロマトグラム上で各ピークの完全分離が可能であった（Fig. 8）．トリヘキシフェニジル塩酸塩についても，ピークの特異性の確認をクロモグリク酸ナトリウムで実施した項目（分離度及びピークの単一性の評価）について同様に実施した（Table 6）．

Fig. 8. HPLC Chromatograms of a Mixture of Trihexyphenidyl Hydrochloride and Its Impurity A (3) Using the Modified Method

Table 6. Comparison of Retention Time and Resolution of the Specific Peaks of Trihexyphenidyl Hydrochloride and Its Impurity A (3) on HPLC Chromatogram

Specific peaks	Retention time (min)	Resolution
Impurity A (3)	3.6	36.9
Trihexyphenidyl hydrochloride	12.9	N/A

N/A: Not applicable

結論

われわれは，JPの国際調和を目的とし，JPにおいては電位差滴定法を用いた定量法が規定されている一方，他局においてはHPLCでの定量法が規定されている品目について，HPLCによる定量法の設定に向けた検討を行った．本研究ではクロモグリク酸ナトリウム及びトリヘキシフェニジル塩酸塩を選択し，それらの類縁物質の化学合成を実施した．合成した各化合物の純度決定は¹H-qNMRにより行い，各化合物の純度は84–99%であった．これらの化合物について，HPLC上での各類縁物質の分離条件について検討した結果，EP記載の分析条件の改変，若しくは新たに条件を検討することで，各化合物の一斉分析によるクロマトグラム上での完全分離を達成することができた．今後は，本分析条件を基にした各品目のHPLCを用いた定量法の設定，及びそのバリデーションについて実施していく予定である．その際には，JPへのICHの品質（quality: Q）ガイドラインの取込みも進んでいることを考慮し，JPの参考情報「化学合成される医薬品原薬及びその製剤の不純物に関する考え方」，ICH-Q3A/B，^16） ICH-Q2（R2）^17）や分析法開発ガイドラインであるICH-Q14^18）を参照しながら，これらのガイドラインに準拠した分析手法を開発することが重要であると考えられる．

謝辞

本研究は，AMED（課題番号22mk0101220j0501），及び医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団の支援により実施した．

利益相反

開示すべき利益相反はない．

謝辞

• 1) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “The Japanese Pharmacopoeia.”: 〈https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html〉, cited 16 September, 2022.
• 2) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “The Basic Policy for Preparation of the 19th Corrected Japanese Pharmacopoeia.”: 〈https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/000847145.pdf〉, cited 16 September, 2022.
• 3) Demizu Y., Tsuji G., Goda Y., Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science, 50, 280–285 (2019).
• 4) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “Supplement II to The Japanese Pharmacopeia, 17th Edition (English Version)” 〈https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/000597173.pdf〉, cited 16 September, 2022.
• 5) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “The Basic Policy for Preparation of the 18th Corrected Japanese Pharmacopoeia.”: 〈https://www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou-11120000-Iyakushokuhinkyoku/jp18kihonsousin.pdf〉, cited 16 September, 2022.
• 6) Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Japan. “ICH guideline (Quality; Q).”: 〈https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0068.html〉, cited 26 October, 2022.
• 7) Maniwa A., Tsuji G., Ito T., Uchiyama N., Hosoe J., Ohtsuki T., Matsufuji H., Demizu Y., Goda Y., Yakugaku Zasshi, 141, 591–598 (2021).
• 8) Maniwa A., Tsuji G., Ito T., Uchiyama N., Hosoe J., Ohtsuki T., Matsufuji H., Demizu Y., Goda Y., Yakugaku Zasshi, 141, 961–970 (2021).
• 9) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “Sodium Cromoglycate,” The Japanese Pharmacopeia, 18th Edition (English Version), pp. 1705–1706. 〈https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/000904449.pdf〉, cited 16 September, 2022.
• 10) The Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. “Trihexyphenidyl Hydrochloride,” The Japanese Pharmacopeia, 18th Edition (English Version), pp. 1870–1871. 〈https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/000904449.pdf〉, cited 16 September, 2022.
• 11) Uchiyama N., Hosoe J., Miura T., Sugimoto N., Ishizuki K., Yamada Y., Iwamoto Y., Suematsu T., Komatsu T., Maruyama T., Igarashi Y., Higano T., Shimada N., Goda Y., Yakugaku Zasshi, 140, 1063–1069 (2020).
• 12) Khanna M., Chen C.-H., Kimble-Hill A., Parajuli B., Perez-Miller S., Baskaran S., Kim J., Dria K., Vasiliou V., Mochly-Rosen D., Hurley T. D., J. Biol. Chem., 285, 43486–43494 (2011).
• 13) European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM), France. “Sodium Cromoglycate,” European Pharmacopoeia 10.0, (2019). pp. 3813–3814.
• 14) Pharmaceutical and Medical Safety Bureau, Ministry of Health and Welfare, “Text on Analytical Method Validation (Methods of Implementation),” 〈https://www.pmda.go.jp/files/000156432.pdf〉, cited 28 October, 2022.
• 15) European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM), France. “Trihexyphenidyl Hydrochloride,” European Pharmacopoeia 10.0, (2019). pp. 4098.
• 16) Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Japan. “ICH-Q3A/B (Impurities in New Drug Substances/Products).”: 〈https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0043.html〉, cited 26 October, 2022.
• 17) Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Japan. “ICH-Q2 (Validation of Analytical Procedures).”: 〈https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0068.html〉, cited 26 October, 2022.
• 18) Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Japan. “ICH-Q14 (Analytical Procedure Development).”: 〈https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0098.html〉, cited 26 October, 2022.