Review
Molecular Design Based on Conformational Analyses
Keywords:
molecular design,
conformational analysis,
structure–activity relationship,
distance mapping
2023 Volume 143 Issue 4 Pages 369-375
Details
2023 Volume 143 Issue 4 Pages 369-375
Today computational chemistry has become an established tool for medicinal chemists. However, softwares are becoming more sophisticated, and in order to master the tools, a wide range of fundamental competency such as thermodynamics, statistics, and physical chemistry are required in addition to chemical creativity. As a result, a software might be used as a black box. In this article, I would like to introduce what a simple computational conformation analysis can do and my experience of using it in actual wet research.
今日では計算化学は身近なツールになったようにみえる．しかし，ソフトウエアは高度化しており，そのツールを使いこなすためには化学的な発想力に加えて，熱力学，統計学，物理化学などの幅広い基盤が必要になってきていて，逆にブラックボックス化しているようにも思われる．本稿では，簡単な計算化学でできること，そしてそれを実際のウエットな研究に使ってきた経験をご紹介したいと思う．
本稿の研究で使用したsystematic searchは分子モデルの回転結合を一定の角度で刻んで回転させ，しらみつぶしに配座を発生させるツールである（Fig. 1）．発生配座の中から不安定配座を除去する一般的な方法は，その配座のポテンシャルエネルギーを見積もることだが，systematic searchでは発生した配座モデルにおいて原子間の衝突がないというシンプルな基準で絶対に不安定な配座は排除する方法が標準である．
Torsion angles in (S)-1-methoxypentan-3-amine that are systematically rotated are marked with rounded arrows. Four rotatable bonds with 10° increament produce 364=1.6 million conformers. Two rotatable bonds with gray arrows could be regarded as rotatable if the rotation of the terminal methyl groups were important.
配座発生ツールは一つの分子の可能な配座を出力するツールだが，分子の方向づけやファーマコフォアの共通配置の探索などに応用できる．例えばNarutoらは酵素の活性中心の中で阻害剤のドッキングポーズの探索に利用した（Fig. 2）．1） 4本の結合（うち2本は阻害剤分子を回転させるためのもので長さは0.01 Å）を探索空間の中心，x軸，y軸，z軸方向に連結し，それらを回転することで酵素ポケット内の阻害剤分子の配向を決めるというアイデアであった．
The inhibitor molecule was connected to the enzyme through three dummy atoms. Dummy atom 1 was placed in the middle of two nitrogen atoms that form hydrogen bonds with the carbonyl oxygen atom of the inhibitor. Bonds 1–2, 2–3 and 3-oxygen atom were orthogonal each other. Bond length of N-1 and 1–2 were determined so that the carbonyl oxygen locates 2.85 Å from the two nitrogen atoms. Bond length of 2–3 and 3-O are 0.01 Å. Rotation of the four bonds produced possible docking poses of the inhibitor keeping hydrogen bondings with the nitrogen atoms. Adapted with permission from J. Am. Chem. Soc., 107(18), 5262–5270 (1985) . Copyright 1985 American Chemical Society.
NaylorとMayerらはangiotensin converting enzyme（ACE）阻害剤はカルボン酸，カルボニル，金属配位子の三つのファーマコフォアを使ってACEに結合するという考えから，この三つの官能基の距離が共通になる配座が活性配座であるとして，28個の阻害剤の活性配座とファーマコフォアの位置を決定した（Fig. 3）．2） 回転結合を一定幅で刻んで捻っていくだけのツールだが，分子動力学などのようにエネルギー障壁，サンプリング密度などの問題はないので案外とその応用幅は広く，かつ，曖昧さがない．
Two ACE inhibitors (a) and (b) have three and five rotatable bonds. Their pharmacophores are the carboxyl group, the central carbonyl group and the sulfinyl group which is a coordination ligand to the zinc atom in the catalytic pocket of ACE. A dummy atom connected to the sulfur atom represents the zinc atom. Five distances d1 to d5 describes the relative orientation of the pharmacophores (distance mapping). Extracting common mapping between the multiple active molecules identified active conformations.
一般的に生理活性ペプチドはそのままでは医薬品にはなり難い．特に経口投与には向いていない．いわゆる脱ペプチド戦略が必要で，その一つの方策はアミド結合を別の構造で置き換えることである．Figure 4に示す例では，cis-アミドをテトラゾール環で代用する戦略の合理性を計算で示すためにsystematic searchを利用した．テトラゾールがcis-アミドと類似する結合長や結合角を持つことは明らかであるが，cis-アミドペプチドとテトラゾールで置き換えた類似体の間に「ファーマコフォア配置の立体的な互換性」があるかという点が本質的に重要である．そこで，cis-アミドペプチドとテトラゾール置換体におけるコンフォーメーションの三次元的類似性を評価するため，両者の一番目のアミノ酸のCα–Cβベクトルの位置の共通性を比較した．その類似性は88%，つまり，cis-アミドペプチドに可能な配置の88%がテトラゾール誘導体で再現できることを示した．3）この論文の成功の影には基盤となる研究がある．先に述べたようにsystematic searchでは原子間の衝突がない，つまり二つの原子間距離と両原子のvan der Waals半径の和のよりも大きいという基準で，不安定な配座を排除する．このことは，「現実を再現できる最大の半径」を決定しておくことが重要であることを意味する．ペプチド用の原子半径のパラメーターセットは，タンパク質及びペプチド結晶構造にみられる立体構造を正確に反映するように調整して導いたものである．4）
Plots of Cα–Cβ bond vectors (arrows) for a tetrazole peptide mimic (top) and a cis-bond peptide (bottom) at 10° increments. Atoms marked with gray circle denotes fixed coordinates of methylamide portions used as common frame of reference. Adapted with permission from J. Am. Chem. Soc., 110(17), 5875–5880 (1988). Copyright 1988 American Chemical Society.
NMRによる溶液状態のペプチドの配座解析では，一般的にはNOEやカップリング定数などを満たすように原子座標が数学的に算出される．11残基からなる環状ペプチドであるシクロスポリンA（cyclosporin A: CsA）についてはNMRデータから，distance geometry法と分子動力学法で立体構造モデルが示され，CsAはβΙΙ′型のターンを持つとされていた．5） CsAは主鎖に22個の回転結合を持つ（ペプチド平面は固定）ので，これを二つの直鎖ペプチドに分け，それぞれの直鎖構造で発生させた配座の末端同士の距離を記録し，二つの距離マップを作成した（Fig. 5）．環状に結合できる配座は，二組のマップで共通の距離を持つ配座だけのはずである．結果，βΙΙ′型のターンに加えβI型の構造も可能であることを示せた．広く使われている計算手法では見落とす構造も見い出せる点でしらみつぶし配座探索の効果が発揮された．6）
(A) Cyclosporin A is an eleven-residue cyclic peptide. Two amide planes indicated in bold bonds were defined as the gluing tags. (B) The molecule was divided into two fragments. The fragments included the gluing tags. (C) Conformers were generated by rotating 10 bonds, and a distance map between the “gluing tags” was recorded. A dummy atom was added at the Si-side of the amide plane. This dummy atom is necessary to maintain the chirality of the system.
二本のペプチド鎖からなる植物由来の甘味タンパク質は重量当たりの甘味が砂糖の3000倍である．天然のモネリンの結晶構造が明らかにされ，B鎖のC末端とA鎖のN末端が逆平行β-シートであることがわかった．7）そこで既知タンパクの構造からB鎖のC末端とA鎖のN末端の相対配置に類似した構造を探し出し，その配列を参考に一本鎖に融合した（Fig. 6）．二つの分子フラグメントの相対配置の一致するものを探すという手法はCsAの研究で使った距離マッピングの応用である．一本鎖化したモネリンは熱安定性が大きく向上し，100°Cで処理しても甘味を失わなくなった．熱変性によりほどけたポリペプチド鎖の自己巻き戻し能力の向上によるものである．この性質を利用してKondoらは，酵母に分泌型で生産させ，その培養液を熱処理，更に酸沈殿処理するだけで高純度に精製できることを示した．8）
(A) Structure of monellin. PDB id. 3MON. Monellin is composed from two peptide chains. The C-terminal of one chain is close to the N-terminal of the other chain. The four residues were designated as a–d and 1–4. (B) Distance map that describe the relative orientation of the two terminals. This matrix is used as the query to search the structures in Protein Data Bank to find “parts” that could link postions 1 and a of monellin. (C) The result of the 3D-structure similarity search. Several fragments were compatible with monellin. (D) Crystal structure of single chain monellin (MNEI). Two structures from different crystal conditions were superimposed. PDB id: 1IV7 and 1IV9.
タンパク質の主鎖の座標が与えられた場合，タンパク質の内部にあるアミノ酸残基の側鎖の配座を求める手法を開発した．N末端から一残基ずつ，側鎖の二面角（χ1, χ2, …）について配座を発生させ，遺伝アルゴリズムで最適化しながら延長して全長にする（Fig. 7）．計算で発生するモデルはvan der Waals衝突をまず優先し，順位づけを露出面積による溶媒和エネルギーで評価した．9）主鎖の構造が正しければタンパク内部にある残基の側鎖配座は複雑な分子動力学計算などを使わずに，van der Waals接触のみで推定できることを確認できた．ここでもタンパクペプチド用に最適化した原子半径が大いに貢献した．
(A) Structure of a gene. One gene is an array of sidechain torsional angles. (B) Algorithm. Sidechain conformation was elongated by residue wise, one residue by one residue. (C) Mutation or cross-over of the gene was operated to double the population of a generation and half of them were eliminated by evaluating van der Waals contacts. This step was repeated until any member had no van der Waals violation.
α-ガラクトシルセラミド（α-galactosylceramide: α-GalCer）は，沖縄に生育する海綿から抽出したエキスから，混合リンパ球反応を強化する活性物質として単離された．10）マウスにおいて，α-GalCerは抗原提示細胞（樹状細胞）のCD1分子に結合してnatural killer T（NKT）細胞を活性化することで，強い抗腫瘍活性を示す．その構造活性相関［Fig. 8（A）］に基づいて，脂肪酸側鎖を除いた部分の活性配座を求めた［Fig. 8（B）, （C）］．11）その結果，7つの異なる配座を算出できた．おりしもCD1の結晶解析座標が公開された．12）そこでCD1の抗原提示ポケットにある極性残基と，重要な水酸基が相互作用すると仮定した．前述の構造活性相関から算出した配座において，Fig. 8（D）に示すように，水酸基酸素，エーテル酸素の先2.8 Åにダミー原子をつけ，これらダミー原子間の距離が，CD1上の極性残基と一致するものを探索した．一致した場合，その配向をもってリガンドをCD1にドッキングし，van der Waals接触を評価した．つまり，7つの配座のうち，CD1にドッキングし得る配座を探したのである．その結果，α-GalCer/CD1複合体モデルを構築できた［Fig. 8（E）］．13） Burdinらがこのモデルに従って予測された相互作用残基をAlaに置き換えたところ，変異CD1d細胞ではα-GalCerによるNKT細胞の活性化能力が失われた．14）この一連の研究は，最初に定性的な構造活性相関で求めた候補配座の中から，CD1dの結晶構造との相互作用を距離制限として，CD1dとの複合体構造を探し出すという二段階の配座探索で行われたことになる．エネルギー評価を一切含まないドッキング計算という特徴がある．7年後，結晶構造が報告された．15）
(A) Structure–activity relationship of glycosyl ceramides. (B) To find conformations that share the arrangement of the important oxygen atoms (i.e., 2′- and 4′- oxygen on the hexose ring and the hydroxy group of the main chain), distance maps were generated by rotating the designated bonds. Seven arrangements were identified. Dashed lines indicate the distances used in the mapping. (C) An example of conformation of α-galactosyl ceramide and α-glucosyl ceramide. The oxygen atoms of the molecules that are relevant for the activity overlap. Adapted with permission from Bioorg. Med. Chem., 6, 1905–1910 (1998). Copyright 1998 Elsevier Science Ltd. (D) Conformation of the glycosyl ceramides were fixed in one of the seven conformations. Dummy atoms were added to the important oxygen atoms. The dummy represents hydrogen bond partner of the CD1d. Distances were recorded and the one that match the arrangement of the polar amino acid residues on the surface of CD1d is selected. (E) An example of the docking model. Adapted with permission from Int. Immunol., 13(7), 853–861 (2001). Copyright 2001 Oxford University Press.
Rho Kinaseは細胞骨格形成を制御する重要なkinaseである．Rho kinase阻害剤は細胞運動が関与する様々な生体現象，例えば，血管収縮，細胞遊走などの抑制に役立つと考えられる．in vitroの酵素反応系を構築し，社内化合物ライブラリ（7万化合物）のスクリーニングを実施したが，強いヒット化合物は得られなかった．その矢先，Rho kinaseにホモロジーがあるc-AMP dependent protein kinase（PKA）の結晶構造が公開された16）ので，ホモロジーモデリングを行い，このモデルの活性ポケットの構造を基に考えられる合成可能な阻害剤を多数設計した．活性ポケットという空間に入る（キナーゼに結合する）という条件の基では，化合物の類似性は二次元構造の類似性とは異なる．Figure 9にその一例を示した．TakamiとIwakuboらは，合成展開が行い易い候補分子の仮想化合物ライブラリから，Rho kinaseモデルへのドッキングシミュレーションを行い，有望な構造を選定すると同時に活性がないと予測できる類似体も合成し，自分たちのモデルの妥当性も確認した．17）不活性であることを積極的に予測モデルの検証に使った点は特徴的だと思う．このドッキングにはFlexidockというツールを使用した．ドッキングツールというとドッキングを目的にその利用を考えるが，このツールに備わっていた指定したアミノ酸残基の側鎖の配座探索機能は，どの程度の分子体積が酵素のポケットにおいて許容されるかを推定することに有用であった．極めて短期間に，構造的に独立した阻害剤展開の基本骨格を複数種類（pyridine, 1H-indazole, isoquinoline, phthalimide, benzoamine）を見い出すことに成功した．この中からin vivoでのプロパティ（代謝安定性，吸収性）のよい骨格としてindazoleに絞りこみ，18）最適化をした．19）
In spite of 2D similarity of compound 2 with compound 1, binding conformations were not alike (bottom left: Compound 1 is in white.). Docking pose of 1 and 3 were similar (bottom right).
Comparative molecular field analysis（CoMFA）20）は，活性物質が作用する受容体を想定し，化合物の周りに格子点を配置し，各格子点と分子の間に働く非共有結合性相互作用（分散力と静電相互作用）を計算し，どの格子の相互作用が活性をよく説明するかを判別することで，仮想的な受容体ポケットを構築する方法である（Fig. 10）．具体的には，各格子点にsp3炭素カチオンプローブ原子が配置されている．化合物とプローブ原子との相互作用エネルギーを計算する．算出した分子相互作用場と生理活性をpartial least squares regression（PLS）回帰により相関付けし，相互作用に重要な領域（格子点）を見い出す．CoMFAでは，比較すべき類縁体の構造を重ね合わせておくことが重要で，「正しい重ね合わせ」を導けるかが本質的な課題と言っても過言ではない．解析する薬物分子には受容体が存在し，少なくとも大多数の分子は受容体に認識されるポーズで重ね合わされているという前提である．また相互作用に重要な格子点とは活性の変化とその格子点でのエネルギーの偏差が相関する点のことであるので，活性値にはダイナミックレンジが必要とされる．つまり「強いものを既に手持ちであり，弱いものの活性を正確に測ってある」ことが必要で，探索研究初期でこの条件を満たすデータセットを得ることは実は容易ではない．
Daikonyaらは肥満細胞からの一酸化窒素（nitric monoxide: NO）産生を抑制する活性物質をチベットの複数のシソ科の植物から得た［Fig. 11（A）］．21）このデータセットの構造式をみると偶然にもB環の3′, 5′-位の置換基（Rm）に対称性があった．さらにベンゼン環上のメトキシ基には，ベンゼン環同一平面にあるか，直角かの二通りの配座しかないことが知られている．これにより，分子の重ね合わせが簡単になった．それでも重ね合わせは32通りあるが，そのすべてについてCoMFAを実施し，最も統計的に有望なモデルを選んだ．22）さらにこのモデルに基づいて，Jiangらはフラバノノールの合成を行った．合成展開の基本骨格にフラバノノールを選んだ理由は，この骨格には活性化合物が一つも見い出されていなかったこと，合成ならば立体異性体の活性も調べられることであった．高い活性（IC50=17 µM）を有する非天然型のフラバノノール7（2-R, 3-R）を見い出すことができた（Fig. 11C）．その立体異性体（2-S, 3-S）は不活性（IC50>100 µM）であった．23,24）フラボノノール誘導体では，（2-R, 3-R）の阻害活性が高くなるにつれ，対応する（2-S, 3-S）体の活性が低くなるという構造活性相関が見い出されたことからも，フラボノイドのNO産生抑制活性の発現には生体標的分子を介する可能性が考えられた．残念なことはその標的の同定には至っていないことである．
(A) Structure and inhibitory activity on nitrogen monoxide production by macrophage cells of the initial set of flavonoids. Distribution of inhibitory activity were shown on the indictor. Note that four flavanonols were tested but all of them were inactive (IC50>100 µM). (B) CoMFA explained the activity difference of flavanone 5 (IC50>100 µM) and 6 (IC50=15 µM). Presence of 5-OH on the ring A is important for the van der Waals contact. Electrostatic interaction is important for the B ring. Presence of 3′, 4′, 5′-hydroxy groups in 5 is disadvantageous, presumably due to the presence of an intra molecular hydrogen binding. Adapted with permission from Bioorg. Med. Chem., 25(2), 779–788 (2017). Copyright 2017. Elsevier Science Ltd. (C) Synthetic flavanonol with high activity.
計算機支援の分子設計を実際の自分の実験研究に役立ててきた例として拙い研究をご紹介した．これらの研究は1985年から2017年にかけて行われたもので，技術的には古いものであるが，原理がシンプルで現場応用し易い技術ではないかと思われる．老兵の経験が特に若いメディシナルケミストのご参考になればと思う．
東京大学薬学部・大学院において研究者としての基礎をご指導頂いた三川潮先生，海老塚豊先生，本稿の主体となる分子設計についてご指導下さったMarshall先生に深く感謝いたします．本稿の一部の研究は筆者がキリンビール（株）で行ったものです．一緒に研究して下さった多くの方々に感謝いたします．助教・専任講師として研究を支えてくれた髙宮知子先生，日本大学薬学部の教職員の方々に感謝いたします．お名前をあげきれませんが，学内学外の共同研究者の方々，学生諸氏，そして定年まで支えてくれた家族に感謝いたします．
開示すべき利益相反はない．
本総説は，2021年度退職にあたり在職中の業績を中心に記述されたものである．
