誌上シンポジウム
日本薬局方における定量NMRの実装における道のり
2024 年 144 巻 4 号 p. 347-352
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2024 年 144 巻 4 号 p. 347-352
Quantitative NMR (qNMR) is employed to determine the purity of reagents used as standards for HPLC quantification in the Japanese Pharmacopoeia (JP) and has become recognized as a new absolute quantification method in various fields such as pharmaceuticals, foods, and food additives. This report outlines how and why qNMR has been adopted as an official method in the JP and introduces its progression from JP16 to JP18. The results of a survey of companies in the Japan Pharmaceutical Manufacturers’ Association regarding how and when to use qNMR from development to manufacturing stages are introduced. The issues involved in the expansion of the use of qNMR in the field of chemical pharmaceuticals in 2017 are discussed and how these were resolved.
定量NMR（quantitative NMR: qNMR）は，標準物質を参照する一次標準比率法である絶対定量法である．第18改正日本薬局方（日局18）では，2022年12月告示の第一追補（日局18-1）までに，qNMRで純度値付けされた22の定量用試薬が収載されており，これらの試薬は48の「生薬等」各条においてHPLC用標準物質として利用されている．さらに，また，現在の日局の原案作成要領にも，qNMRで値付けされた標準品について，どのような情報が求められるか具体的に書き込まれ，実際にqNMRを利用して定量を行った日局標準品の採用が可能となっている．われわれは2008年よりqNMRをどのように公的規格に組み込んでいけるか産官での検討を開始し，2012年の日局16-1で参考情報に「核磁気共鳴（NMR）法を利用した定量技術と日本薬局方試薬への応用」が収載された．本稿では，まず生薬分野においてqNMRを日本薬局方（日局）に導入した経緯と経過についてのべ，ついで具体的に導入を目指して様々な検討を行った結果，定量用標準物質を準備する際見えてきた問題点と，問題解決のため行ってきた研究成果について触れる．さらに，化学薬品分野でのqNMRの積極的な利用に向けて，業界のアンケート結果に基づき様々な対応を行ってきており，現段階における到達点について概説する．
日局では，多くの医薬品の定量の際，純度を公的に保証した日本薬局方標準品を日局標準品とし，標準品を利用した検量線に基づくクロマトグラフ法で分析する規格となっている．この場合，化学薬品では，主に先発メーカーの協力により日局標準品を規格化し，一定の機関を通じて供給するシステムを取ってきた．一方，天然物由来の生薬，漢方処方エキスで指標成分の定量値を規定する場合，指標成分が天然物であるため，化学医薬品と同様に日局標準品を設定し用意するには，以下のような課題があった．
①化学薬品と異なり先発メーカーがある訳ではないので，標準品の製造元を考えることが難しい．②生薬・漢方処方エキスは非常に多くの化合物の混合物であり，医薬品（生薬・漢方処方エキス）中の0.1–数%程度の含量の化合物を定量指標成分として設定する必要がある．しかしながら多くの場合，これらの化合物の合成は容易ではない．したがって，標準品の製造元が天然物より十分な純度を持つ化合物を精製，単離しなければならい．この場合，多大な労力が必要となり，経済的コストが多大となる．③原料の差，抽出，精製，単離行程の差により，不純物の構成が異なることからロット間格差が合成品と比較して大きく，公的標準品として純度コントロールが難しい．④最大の不純物は水である場合が多いが，厳密に水分含量を測定しようとすると，カールフィッシャー法を利用することになり，水分含量規定のために貴重な化合物を別途消費することになる．
このような隘路のため，グリチルリチン酸やベルベリン塩酸塩などわずか10品目だけが，日局標準品として設定され，一部の生薬や漢方処方エキスの規格において利用され，これらの標準品が利用できない生薬や漢方処方エキスでは，便宜上その時点で市販されている試薬，あるいは市販可能な試薬の規格を局方の試薬・試液の項で定め，その物質を分析用標品と規定し，定量法と定量規格を規定してきた．ところがこのような試薬は，クロマトグラム上の純度は一定レベル以上保証されているものの，水分も含めて他の不純物量の規格が定められておらず，厳密に議論した場合，試験値に矛盾が生じる可能性が指摘されていた．例えば，局方「サンシシ」では，指標成分geniposideの含量をHPLC分析に基づき3.0%以上と規定しているが，標準物質となる定量用geniposideとして使用可能な試薬についてqNMRを実施すると，水が不純物として観察され，絶対純度は92.0%であることが判明した．1）したがって，この試薬の純度を100%と仮定して定量分析用標品としHPLCを実施し定量値が3.0%と導かれる場合，実際の含量は，2.8%であることになる．また，公的検査機関で得られた分析値と医薬品メーカーでの分析値が異なり，その原因を探ると，分析に使用した定量分析用標品のロットが異なったためとの話も伝わっていた．
このような天然物に由来する試薬の純度の問題は，試薬の純度についてqNMRで測定を測定し，その値を市販の試薬に表示していくことで解決する．われわれは，2008–2009年頃より，qNMRを利用して，日本薬局方で使用する生薬成分含量測定用試薬を定量規格化し，qNMRで値付けされた試薬が，実際に公定規格で利用できるようにするための検討について，企業を含む複数の機関と共同で行ってきた．
まず行ったのは，qNMR測定の際のqNMR用（内）標準物質の確立である．最終的に日本の国家計量機関である独立行政法人産業技術総合研究所計量標準総合センター（National Institute of Advanced Industrial Science and Technology National Metrology Institute of Japan: AIST NMIJ）より供給される認証標準物質（NMIJ certified reference material: NMIJ CRM）である1,4-dichlorobenzneを用い国際単位系（international system of units: SI）トレーサブルな値付けをされ，取り扱いの容易な固体化合物で，1H NMRで特異的な化学シフトに鋭い1本のピークを示す有機溶媒用の1,4-bis（trimethylsilyl）benzene-d4（BTMSB-d4），メタノール及び水系用の3-（trymethylsilyl）-1-propanesulfonic acid-d6 sodium salt（DSS-d6）が，共同研究先の富士フイルム和光純薬より市販されることとなった．
次に，qNMR測定の際の定量用シグナルの選択のための原則について研究班で考察した．その結果，以下の方針を原則とすることとした．不純物が入っている可能性があるシグナルは選択しない．スピン系が単純で積分範囲が狭く，S/Nもよくなることを考慮して，なるべく単純なシグナルを選択する．構造情報から考えて，理由が不明で明らかに積分値が異なるときは，定量値が大きいシグナルの下に不純物が入っている可能性を考え，より積分値が小さいシグナルを選択する．純度が十分高く不純物が入っていると考えられないシグナルが複数ある場合には，それらのシグナルをすべて選択，定量値は，これらの積分値の平均値で算出する．
さらに日局の「生薬等」に応用を図るため，具体的に日局のHPLC定量用試薬として使用されていたmagnololとgeniposideを利用して，バリデーション実験を実施した．その結果，10 mg程度を正確に秤量し3回qNMRを測定すれば，有効数字3桁目まで，ほぼ正確に絶対定量できることが判明した．2）誤差について詳しく述べると，magnololについて異なった5機関の400–800 MHzの機器qNMRを測定した場合，機器の繰り返し誤差0.10%，調液誤差0.08%，室間誤差0.20%（5実験室において，3個の非同一サンプルについてそれぞれ3回測定して得られた値の平均のS.D.）であり，通常のクロマトグラフィーにおける併行精度の目標値，すなわちS.D. 2%以下，0.2%程度だと良好という基準を十分満たしていることが判明した．この測定では，複数のシグナルの値の平均値を定量結果として利用した．クロマトグラフィーでは分子全体から1つのシグナルしか得られないが，NMRでは一つ一つのプロトンのシグナルを独立してみており，不純物が入っていないシグナルを探すことができ，それらのシグナルについて平均値を求めることにより，より高い精度が得られたことが推定された．
このような準備を経て，まず，2012年の10月に告示された日局16-1において，参考情報に「核磁気共鳴（NMR）法を利用した定量技術と日本薬局方試薬への応用」を収載（日局17で「定量NMRに使用する機器の性能の管理」を追加），2014年2月の日局16-2で，生薬試験法に「核磁気共鳴（NMR）法を利用した生薬及び漢方処方エキスの定量指標成分の定量」を収載（日局18で同収載を改正し，更に内部基準物質の記載をqNMR用基準物質に変更），qNMRで値付けされた生薬定量用試薬（HPLC用の定量用標品）を収載開始した．日局16-2では，同試薬は4品目であり，利用する各条は10であったが，以後順調に収載数を増やし，現在では，冒頭で述べた収載数と利用各条数となっている．また，2016年3月告示の日局17では，一般試験法NMRで定量NMRに関する項を追加（日局18でNMRにおけるS/N比を追記）した．
qNMRで純度が値付けされる定量用標品は，実際の純度が低くても，定量対象となるNMRのシグナルが不純物由来のものと分離していれば純度値付けが可能となる．一方で，日局において定量用標品として使用される試薬の場合HPLCにおいて使用されることを考慮すれば，HPLCのクロマトグラム上，NMRではシグナル分離している不純物が，HPLCでは試薬の対象ピークの下に隠れる可能性も考えられた．その結果，試薬の規格のひとつとして，qNMRの測定条件だけでなくHPLC条件下でのピークの単一性試験を組み込むことになった．3）
日局17の段階では，qNMRで値付けされた8化合物が試薬として採用されたが，その内saikosaponin b2の規格検討過程において，同化合物の吸湿性が問題となった．4）すなわち，試薬が吸湿性を持つと，秤量時の湿度によって，試薬中の水分含量が変化するため，qNMRで値付けしたときの試薬の純度と，実際のHPLC用の検量線作成のために改めて秤量する際の湿度が異なると，値付け時と検量線作成時後の純度が異なることになる．当初，従来どおり，完全に試薬を乾燥させ定量することを試みたが，秤量の段階で吸湿し重量が変動することが確認された．一方qNMRは，正確に言えば，秤量した試薬の純度を決める手法ではなく，秤量しNMRチューブ中にある試薬のモル数を決める手法である．したがって，秤量時とqNMR溶液調整時の湿度が同じであれば，そこで吸湿が起こらないと考え，値付けされた試薬を販売する際には，水分含量に影響を受けない絶対量（モル数）を表示して販売することを考えた．saikosaponin b2そのものは，溶液中で安定であることが判明している．そこで試薬の供給形態として，秤量後，直ちにqNMRで値付けするとともに，同試料を同じ湿度条件で定量的に溶解し分注，乾燥した後，水／メタノール混液を加えHPLC標準溶液として販売する形態について，バリデーションを実施した．その結果，ばらつきが販売許容範囲にあることが明らかとなった．本検討結果に基づき，同化合物は，溶液形態で値付け，バイアル内で乾燥し，一定量の溶液を入れると，qNMRで値付けされたHPLC標準溶液が調製される形で販売されることになった．
さらに，吸湿性試薬においては，秤量時並びにqNMR測定試料調製時の湿度が，qNMRで決定した試薬の純度再現性に強い影響を与えることが明確になったため，精密恒温恒湿秤量装置について，日本電子と共同で検討を行った．5）その結果，装置内にウルトラミクロ並びにミクロ天秤を設置でき，その場所でqNMR試料も調製できる精密恒温恒湿装置の開発に成功した．同装置は，輻射により温度と室内湿度より少し高い湿度を保つ装置で温度24–27度，湿度40–70%の範囲で，±0.1%の条件で温度，湿度をコントロールできる装置であり，本装置を用いれば，吸湿性が高い試薬であったとしても，純度変化なしに再現性よく秤量でき，HPLC用の標準溶液の調製が可能になることが明らかとなった．
これまで吸湿性試薬においての秤量でも，試薬を完全に乾燥させてから秤量を行うことが，秤量上のルールとして考えられていたが，実際には，ドライボックス中での秤量は非現実的である．例えば，日局標準品として，ginsenoside Rb1とRg1が既に販売されているが，これらには，水分含量が表示（カールフィッシャー法によるものと推定される）されて販売されており，水分含量の変化を避けるため，試料採取は，容器開封後速やかに行うべきであることが表示されている．一方で，われわれの実験結果では，これらの試薬は従前に秤量した場合と異なる温湿度状態で秤量すると，これらの標準品の水分含量も変化することが判明している．したがって，これらの標準品でも，前述したsaikosaponinと同様に瓶に含まれる絶対量を表示するか，あるいはHPLC分析用標準液を本標準品から調製する際，標準品の水分含量を測定した際と同じ温湿度条件で秤量する必要性が考えられた．また，このことは，生薬の指標成分だけでなく，吸湿性の一般の化学薬品の標準品においても，同様の課題を抱えていることを示しているものと考えられた．
われわれは，2017年に化学薬品の分野でのqNMRの利用について，日本製薬工業会所属7社のNMR部門に対しアンケート調査を実施した．まず医薬品の開発ステージ毎におけるqNMRの利用について問うたところ，企業により利用ステージが異なることが判明した．すなわち，開発ステージの全般で利用するのが3社，前半で利用するのが2社，後半が1社（HPLCとの併用，感度係数の算出），対象物により変わるのが1社となった．さらに，利用目的としては，原薬の定量だけでなく，副生成物の定量，代謝物の定量，分解物の定量，潜在的発がんリスク物質を提言するための医薬品中DNA反応不純物の定量，中間体の定量，製剤における添加剤の定量，標準物質の定量，残留溶媒の定量，合計収率の計算のための定量など，多岐にわたっていることが判明した．さらに社内における具体的な定量試験法として7社中，5社が採用していることが明らかとなったが，その内3社は，マスバランス法と併用と回答があった．さらにまた，qNMRがより利用されるための課題点について問うたところ，最大の課題は行政当局におけるqNMRを利用した定量法の受容との回答が得られた．この問題を解決するため，われわれは，複線的な活動を行い，qNMRが社会における普遍的な定量法として受容される道筋を付けることとした．ひとつはqNMR法のJapanese Industrial Standards（JIS）化，International Organization for Standardization（ISO）化であり，有機化合物の新しい絶対定量法として，qNMRは2018年日本工業規格へ採用され，JIS K 0138として発出された．さらに2022年12月にISO化されたが，この活動については本シンポジウムのオーガナイザーの一人である杉本博士の誌上シンポジウム総説を参考にされたい．もうひとつの柱は，日本薬局方原案作成要領におけるqNMR関連の記載の整備である．
既にアンケート調査の段階で，外国資本の化学薬品メーカーから日局標準品候補の絶対定量法としてqNMRが提示されていたため，局方の原案作成要領の標準品品質標準の作成方法の様式に，qNMRで絶対定量を行った際のデータ提出様式（記載例）を検討する必要性が生じていた．そこで，日局の標準品委員会に，標準品委員会，化学薬品委員会，生薬等委員会，理化学試験法委員会，総合小委員会，東薬工，関薬協，試薬協会等業界団体，医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団所属の委員からなる定量NMRの適用拡大に関するqNMRワーキンググループを設置し，そこで議論を行い日本薬局方原案作成要領の整備に務めた．その結果，第18改正日本薬局方原案作成要領において，「6. 核磁気共鳴スペクトル測定法による定量NMR（qNMR）を用いる場合の記載例」が整備され，局方においても，日局18でJISと同様にqNMR用基準物質といった用語を用い，化学シフト基準物質との用語の使い分けを図るなど対応が行われた．これらは，言い換えれば，医薬品の承認申請書類における，qNMR関連の情報の要求内容と，その書き方を明確に示すもので，前述した最大の課題を克服したものと考えられた．
さらに，アンケート調査で課題として，システム適合性やバリデーションの項目及び実施方法が明確でない点があげられたが，これらについては，JIS化，ISO化により明確化されたものと考えている．また，装置の性能確認と測定時の適格性認定についても，JISでの記載及び日局でのシステム適合性試験の実施により，拠りどころが明確になった．なお，作業者による標準試料を用いた使用前点検では，われわれは幅広い領域でシグナルが検出される日局標準品があるbutyl 4-hydroxybenzoate，あるいは試薬メーカーから容易に入手できるvinclozolin標準品を用いて，S/N比算出，分解能（線幅）の確認，積分値の確認等を行うことを推奨している．さらに，アンケート調査では，qNMRにおける今後の課題として，化合物の純度と構造に起因するシグナルの重なりや複雑さのため，定量シグナルの選択が難しい場合が存在することが挙げられていたが，現在，他核，すなわち31P NMRや19F NMRシグナルを利用したqNMR測定について検討しており，問題解決に向けて有効な手法であることが明らかになりつつある．6,7）本件については今回の誌上シンポジウム総説において内山博士から詳しい紹介がある．また，アンケート調査時，日局ではqNMRでの定量時，ウルトラミクロ天秤の使用を推奨していたが，使用天秤について制限がかかるとの指摘があり，最小計量値以上の秤量であれば，SIトレーサブルとなり得るので，その事実に対応した記載変更を日局18で行っている．
日局18の告示の段階で，アンケート調査時課題として挙げられていた項目は，現在，ほぼ解決されたと考えている．もう一点，日局18におけるqNMR関係のトピックとしては，相対モル感度（relative molar sensitivity: RMS）法の採用が挙げられる．本法は，qNMRにより分析対象物質とそれとは別の基準物質の正確なモル量又はモル比を決定後，クロマトグラフ装置に導入することにより，検出器の応答の比，すなわち，分析対象物質のそれとは別の基準物質に対するRMSが精確に算出可能できることを利用し，別な基準物質の検量線から，分析対象物質の定量をRMSを用い算出する方法で，分析対象物質と同一の定量用標品を必要としないクロマトグラフィー定量法である．日局18では，本法を，qNMRで定量値付けが可能であるが，酸化等の影響を受け易く安定な保存が難しいperillaldehydeのソヨウ中の定量に利用している．RMS法を用いることで，保存の難しい定量用標品を使用することなく，正確な定量が可能となった．RMS法は，本シンポジウムのオーガナイザーである杉本博士らの研究グループの提唱した手法であり，本誌上シンポジウム総説においても，杉本博士から紹介がある．
以上のように，qNMRの利用における様々な課題は確実に解決され，幅広い分野で利用できるSIトレーサブルな絶対定量法としてqNMRが社会に確実に実装化されつつある．現在，日局18-2に向けて一般試験法における天秤・分銅の項の改正作業が終了し，そこでは，最小計量値等の言葉の定義が日局で明確に定義されることになっている．したがって，日局18-2の告示後は，SIトレーサブルなqNMRの利点がより明確になるものと考えている．
開示すべき利益相反はない．
本総説は，日本薬学会第143年会シンポジウムS34で発表した内容を中心に記述したものである．
