Development of Enantioselective Imaging Method for Chiral Molecules by on-Tissue Chiral Derivatization and Ion Mobility Mass Spectrometry

Summary

Bioactive molecules are mostly chiral, and their enantiomers often exhibit different biological properties, including pharmacological effects and toxicity. Recent biochemical studies have revealed that certain trace-level chiral metabolites are associated with specific pathological conditions, including chronic kidney disease and metabolic disorders. This finding highlights the importance of enantioselective imaging techniques that can help visualize the spatial distribution and dynamic behavior of individual enantiomers. Although enantioselective biochemical analyses, such as those based on chromatography or electrophoresis, have proven effective in separating enantiomers, progress in enantioselective imaging methods has been limited. Ion mobility spectrometry/mass spectrometry imaging (IMS/MSI) has emerged as a powerful tool with the potential to enable the enantioselective imaging of minor chiral metabolites. However, suitable chemical structures that can achieve both sufficient resolving power for the target enantiomer in IMS and high ionization efficiency in MSI remain unclear. This review highlights the development of enantioselective imaging methods based on on-tissue chiral derivatization and IMS/MSI. After exploring suitable chiral derivatization reagents, we designed a new charged chiral tag that enabled complete separation of a pair of enantiomers by IMS, sensitive detection of D,L-2-hydroxyglutaric acid by mass spectrometry, and the visualization of their distribution in the mouse testis by IMS/MSI. This approach can be further expanded to analyze other chiral molecules and has great potential for unveiling the enantioselective distribution and dynamics of minor chiral metabolites in biological tissues.

1. はじめに

生理活性分子の多くはキラルであり，そのエナンチオマーは異なる生物学的性質を示す．薬効を示す分子のエナンチオマーが重篤な毒性を示す場合もあるため，それらの分離は創薬における重要課題の一つである．また，生体内でマイナーな立体構造を持つキラル分子の存在量が種々の疾患（糖尿病やがん，慢性腎臓病など）に関連することも見い出されており，未知の重要分子を探索できる分析法の開発が進められている．^1,2）

クロマトグラフィーや電気泳動等の開発と対照的に，キラル分子のエナンチオ選択的イメージング法の開発は長く滞っている．組織のスライス標本を解析する組織学的解析法に着目すると，オートラジオグラフィー（autoradiography: ARG）や免疫組織化学（immunohistochemistry: IHC）により重要知見の多くが得られたものの，^3–5）詳細な解析は進んでいない．例えばARGは外部からの放射性同位体（radioisotope: RI）標識体投与を要し，生体内で合成される分子を直接検出できない．また，投与後にRI標識体が受ける異性化や化学修飾を捉えられない．IHCは，優れた認識能を有する抗体に加えて化学固定や洗浄等の操作を要するため，容易に流出する低分子の本来の分布を捉え難い．

質量分析イメージング（mass spectrometry imaging: MSI）は，標本中の各位置に含まれる成分をレーザー等の照射によりイオン化して質量分析する手法であり，^6）特に低分子のイメージング法として有用な手法である．一度に数多くの分子を検出できるため，ヒトを対象とする大規模研究における空間メタボロミクスにも利用されている．^7）近年では，イオン移動度分析（ion mobility spectrometry: IMS）やタンデム質量分析における特殊な解離法を利用することで，一般的に異性体の識別が困難なものも検出できるようになってきた．^8,9）エナンチオマーの識別も徐々に可能となってきているが，^10）どのような化学構造がIMSによる分離に適するかを明らかにする研究は進んでいない．また，既報のキラル分離法で分離可能なイオン種の大半はその生成効率が低く，多量の夾雑成分存在下で検出する必要があるイメージングには適していなかった．^11）

筆者は，MSI関連技術の開発と応用を進めるとともに，液体クロマトグラフィー質量分析による生体内キラル分子のエナンチオ選択的分析法の開発を進めてきた．^12–16）例えば，標的分子の分離に適した構造を持つ誘導体化試薬を選択することで，生体中に含まれる8種のアミノ酪酸異性体（D,L-アミノイソ酪酸など）の一斉分離分析を実現した．^17）また，スライス標本に誘導体化試薬を塗布する手法と内標準法を組み合わせてモノアミンの定量的イメージング法を構築し，モノアミンが共集積する神経核の同定や脳内モノアミンの動態解析を実現した．^18,19）これらの経験を基に，IMSにおける分離能とイオン化効率を両立するキラル誘導体化法を開発すべく，種々の検討を進めてきた．本稿では，D体とL体がそれぞれ異なる疾患に関与するD,L-2 hydroxyglutarate acid（D,L-2HG）に着目して行った研究について，その内容を紹介する．

2. イオン移動度質量分析に適したキラル誘導体化法の開発^20）

IMS/MSIによりキラル分子をエナンチオ選択的にイメージングするには，IMSにおける分離能とイオン化効率を両立することが必要となる．これを満たすと考えられる化学構造情報は研究開始時点において皆無であったため，筆者はまず，IMSにおける分離に適した化学構造を探索することとした．様々な構造をキラル分子とキラル誘導体化試薬をそれぞれ反応させて得られるジアステレオマー誘導体をイオン化し，生じる種々のイオン型について移動度と分離度を調べた結果，いくつかの組み合わせで良好な分離度が得られることを見い出した．特にD,L-2HGに対して（S）-1-（4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl）pyrrolidin-3-amine［DMT（S）A］を反応させたとき，得られるジアステレオマー誘導体が生成効率の高いプロトン付加イオンとして分離可能なことを見い出した（Fig. 1）．2つのジアステレオマーをプロトン付加イオンとしてIMSで分離した例は乏しく，この結果は稀な例と考えられる．いずれの誘導体もnano electrospray ionization-MSにより8–500 nMの範囲で良好な直線性を示し，クロマトグラフィーや電気泳動なしに高感度かつエナンチオ選択的な分析に適用可能と考えられた．また，matrix-assisted laser desorption/ionization（MALDI）やdesorption electrospray ionization（DESI）によるイオン化が可能であったため，イメージングにも有用と考え検討を進めたが，生体組織中D,L-2HGを検出するのに十分な強度を得ることはできず，イメージングへの適用は困難であった．

Fig. 1. Compensation Voltage Spectra of D,L-2-hydroxyglutaric Acid (2HG) and Their Diastereomeric Derivatives

a, b. CV spectra of [M+H]⁺ of DMT(S)A-DL-2HG (a) and DMT(S)A-D-2HG (b). c, d. CV spectra of [M−H]⁻ of DL-2HG (c) or DATAN-DL-2HG (d). e. CV spectra of [M+2H]²⁺ of OAc-DMT(S)A₂-2HG. CV: compensation voltage; DMT(S)A: (S)-1-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)pyrrolidin-3-amine; DATAN: diacetyl-L-tartaric anhydride. The two-peak resolution Rs=1.18(CV_L−CV_D)/(FWHM_L+FWHM_D) (CV_L; The optimum CV value for the L-form; CV_D; The optimum CV value for the D-form; FWHM_L: full width at half maximum for the peak of L-form; FWHM_D: full width at half maximum for the peak of D-form). Reproduced from Fukui S., et al., J. Sep. Sci., 44, 3489–3496 (2021)²⁰⁾ with permission from the John Wiley and Sons.

3. イオン移動度質量分析イメージングに適したキラル誘導体化法の開発^21）

筆者は，MSIにおいて安定なカチオン構造を付与する誘導体化法が有効であること^16,19,20）に着目し，DMT（S）Aの試薬構造を改変することにした．新たな試薬（S）-1-（4-（bis（2,4,6-trimethoxyphenyl）methyliumyl）-3,5-dimethoxyphenyl）pyrrolidine-3-amine［BTMD（S）A］は，安定なカルボカチオンを中心とする構造を有し，MALDIにより効率よくイオン化される．^22） BTMD（S）Aを用いて得られるD,L-2HG誘導体のシグナル強度は，イオン化にプロトン付加を要するDMT（S）Aを用いた場合と比べて10倍以上の高値を示した．またD,L-2HGのBTMD（S）A誘導体はtrapped ion mobility spectrometry（TIMS）により良好に分離し，その分離度は1.8であった（Fig. 2）．そこで，種々の条件を検討後，D,L-2HGを含むことが知られているマウス精巣の新鮮凍結切片にBTMD（S）Aを塗布してIMS/MSIを行った．D,L-2HGは完全に分離して検出され，既報と一貫してL体がD体より高強度に検出された．また，各エナンチオマーが精巣組織において異なる分布を示す様子を可視化することに成功した（Fig. 3）．本研究より以前にIMS/MSIによる生体組織中キラル分子のエナンチオ選択的イメージングに成功した例は見当たらない．さらなる研究により，様々な構造を持つキラル分子を選択的にイメージングすることが可能とすることで，各分子の体内動態に関する新知見や種々の病態に対する新規創薬標的を見い出すことが可能になると考えられる．

Fig. 2. Separation and Imaging of D,L-2HG Using BTMD(S)A and IMS/MS

A: Scheme of diastereomeric derivatization of D,L-2HG using BTMD(S)A. B: Mobilogram of BTMD(S)A derivatives of D-2HG (upper), L-2HG (middle), and DL-2HG (racemate, lower). C: Visualization of BTMD(S)A derivatives in the dried droplets. Upper: optical image; Lower: ion images of BTMD(S)A-D-2HG (green) and BTMD(S)A-L-2HG (red). The images were prepared with a mass window of 0.01 Da and a 1/K₀ window of 0.01 V∙S/cm². Scale bar=1 mm. Reproduced from Sugiyama E., et al., Chem. Commun., 59, 10916–10919 (2023)²¹⁾ with permission from the Royal Society of Chemistry.

Fig. 3. Enantio-selective Detection and Visualization of Endogenous D,L-2HG in the Mouse Testis by On-tissue Charged Chiral Derivatization with BTMD(S)A and MALDI/IMS/MS

A: Signal intensities of the BTMD(S)A derivatives of D,L-2HG obtained from the measured area. Each dot shows the intensity obtained at each measured point. B: Bright image of the mouse testis section after the imaging and H&E staining (left) and the ion images of D,L-2HG (right). Scale bar=100 µm. Reproduced from Sugiyama E., et al., Chem. Commun., 59, 10916–10919 (2023)²¹⁾ with permission from the Royal Society of Chemistry.

4. おわりに

現在，上記研究を基に構造を改変した新規誘導体化試薬を用いてキラルアミンを対象とするIMS/MSI法の開発を進めており，良好な結果を集積している．一方，装置の性能は飛躍的な進歩を続けており，近年ではキラル分子の直接分離が可能なIMSも発表されているため，今後の動向に大きな変化が生じる可能性がある．^23,24）実用性の高い手法を確立するためには，汎用性の高いイオン化法やイオン移動度分離部，質量分離部の原理を見極めていく必要があると考えられる．

謝辞

本研究の遂行にあたり建設的な御助言や御支援を賜りました，静岡県立大学の豊岡利正先生，轟木堅一郎先生，名城大学の水野　初先生に心より感謝申し上げます．また，イオン移動度分析に関する技術的支援を頂いた，沖縄科学技術大学院大学の飯沼賢輝先生にも感謝申し上げます．そして，化学合成に関する支援を頂いた，静岡県立大学の濱島義隆先生，山下賢二先生に深謝いたします．本研究は，JSPS科研費（課題番号20K15972及び22K15264）及び公益財団法人薬学研究奨励財団の支援を受けて実施されたものであり，関係各位の皆様に感謝申し上げます．

利益相反

開示すべき利益相反はない．

Notes

本総説は，2024年度日本薬学会東海支部学術奨励賞の受賞を記念して記述したものである．

REFERENCES

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