2025 Volume 145 Issue 4 Pages 313-349
Diterpenoid alkaloids are major pharmaceutically active constituents of Aconitum plants. In phytochemical investigations on Aconitum japonicum subsp. subcuneatum, Aconitum yesoense var. macroyesoens, and Delphinium elatum cv. Pacific Giant (Ranunclaceae), the structures of isolated C19- and C20-diterpenoid alkaloids were elucidated. Three aconitine-type C19-diterpenoid alkaloids, jesaconitine, aconitine, and mesaconitine, which are main components of A. japonicum subsp. subcuneatum, are significantly toxic to the central nervous system. However, lycoctonine-type C19-diterpenoid alkaloids and C20-diterpenoid alkaloids are less toxic. Several diterpenoid alkaloids from the genera Aconitum and Delphinium and their derivatives exhibited slight cytotoxic activity against several human tumor cell lines [A549 (lung carcinoma), DU145 (prostate carcinoma), MDA-MB-231 (triple-negative breast cancer), MCF-7 (estrogen receptor-positive, HER2-negative breast cancer), KB (identical to cervical carcinoma HeLa derived AV-3 cell line), and multidrug-resistant (MDR) subline KB-VIN]. In our course of studies on synthetic derivatives of the C19-diterpenoid alkaloids delcosine and delpheline and the C20-diterpenoid alkaloids lucidusculine, pseudokobusine, and kobusine, we found several derivatives showing significant cytotoxic activity and, thus, providing promising new leads for further development as antitumor agents. Notably, several diterpenoid alkaloids were more potent against MDR subline KB-VIN cells than the parental drug-sensitive KB cells. Among non-cytotoxic synthetic analogues, several lycoctonine-type C19-diterpenoid alkaloid derivatives effectively and significantly sensitized MDR cells to three anticancer drugs, paclitaxel, vincristine, and doxorubicin.
ジテルペノイドアルカロイドは漢方処方に配合される附子の基原植物のキンポウゲ科（Ranunclaceae）トリカブト（Aconitum sp.）の主要成分で，ジテルペノイドアルカロイドaconitine（1）やmesaconitine（2）は強い毒性を示すことより，漢方処方には減毒した日本薬局方収載「加工ブシ」が用いられている．1）日本国内には多種類のトリカブトが自生しており，北海道小樽市銭函に自生するオクトリカブト［Aconitum japonicum THUNB. subsp. subcuneatum（NAKAI）KADOTA］は，古来アイヌ民族が狩猟の矢毒として用いられたことが知られ，強毒性ジテルペノイドアルカロイドaconitine（1）やmesaconitine（2），jesaconitine（3），hypaconitine（4）が主要成分である（Fig. 1）．2）私は，元北海道薬科大学薬学部（現北海道科学大学薬学部）の薬化学教室に配属になり，故 網谷 孝先生のご指導の下で，大学院及び助手時代に大学近隣（小樽市銭函）に自生するオクトリカブトや札幌市定山渓に自生するテリハブシ［Aconitum yesoense var. macroyesoense（NAKAI）TAMURA］の成分探索研究を開始した．それ以来，トリカブトの主要成分であるジテルペノイドアルカロイドを中心に研究を行ってきたが，本編では，成分探索により単離したジテルペノイドアルカロイドの構造とジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞に対する細胞毒性に関する研究を中心に述べる．
ジテルペノイドアルカロイドはキンポウゲ科（Ranunculaceae）のトリカブト属（Aconitum sp.）やデルフィニウム属（Delphinium sp.），バラ科（Rosaceae）シモツケ属（Spiraea sp.）などから単離され，化学構造は大きくC18-型，C19-型，C20-型と二量体型に分類されている（Fig. 2）．3）さらに，C18-型ジテルペノイドアルカロイドは4種類（lappaconitine, ranaconitine, seco, rearranged type）に，C19-型ジテルペノイドアルカロイドは6種類（aconitine, lycoctonine, pyro, lactone, seco, rearranged type）に，C20-型ジテルペノイドアルカロイドは38種類（例えばatisine, denudatine, hetidine, hetisine, vakognavine, actaline, veatchine, napelline typeなど）に，また，二量体型ジテルペノイドアルカロイドは9種類（例えばhetidine-atisine, denudatine-denudatine typeなど）に分類される（Fig. 2）．Aconitine type及びlycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドは構造的特徴から4つのサブタイプ［amine（I），N,O-mixed acetal（II），imine（III），amide（IV）］に分類され，更に4つのサブタイプ（I–IV）はそれぞれ4つのグループ（a–d）に，aconitine type（Fig. 3）ではnon-oxygenation at C-6（a），oxygenation at C-6/non-oxygenation at C-15（b），oxygenation at C-6 and C-15（c），lipo-alkaloids（d）に，lycoctonine type（Fig. 4）では7,8-diol（a），7-hydroxy/8-methoxy（b），7,8-methylenedioxy（c），7,8-diol/18-anthranoyl（d）に分類される．4）トリカブト属やデルフィニウム属の主要成分は，おおよそC19-型とC20-型ジテルペノイドアルカロイドである．単離されたC19-型ジテルペノイドアルカロイドの多くはaconitine typeあるいはlycoctonine typeであり，aconitine typeはaconitine（1）やmesaconitine（2），jesaconitine（3），hypaconitine（4）など，lycoctonine typeはlycoctonine（5）やdelcosine（6），delpheline（7）（Fig. 5）などが報告されている．2–4）また，C20-型ジテルペノイドアルカロイドの多くはatisine type, hetidine typeとnapelline typeであり，atisine（8）やkobusine（9），pseudokobusine（10），napelline（luciculine, 11），lucidusculine（12）（Fig. 5）が報告されている．2–4）
ジテルペノイドアルカロイドの研究の歴史は古く，1819年，delphinine（13）（Fig. 5）がDelphinium staphisagria L. より単離されたのが始まりで，5）ついでaconitine（1）がAconitum napellus L. より単離されている．6）日本産トリカブトの研究は真島・杉野目を中心に行われ，マンシュウトリカブト（A. manschuricum NAKAI）よりmesaconitine（2）が単離され，7）その後の研究で日本産トリカブトは猛毒性のaconitine（1）類が主要成分であることが報告されている．8）トリカブトのジテルペノイドアルカロイド含量は，原植物の種類，産地及び採集時期などにより変化が著しく，9）生薬の薬理活性や毒性へ大きな影響を与えるので，トリカブトのaconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドのガスクロマトグラフィー9）や液体クロマトグラフィー（HPLC: UV検出）10–16）による定量法が報告されている．しかし，C20-型ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9）やpseudokobusine（10），lucidusculine（12）はHPLC（UV検出）法が適用できないことから，筆者らは液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）による定量法を開発した．LC-大気圧化学イオン化マススペクトロメトリー［LC-atmospheric pressure chemical ionization（APCI）-MS］は様々なジテルペノイドアルカロイドを感度よく検出することができ，選択イオン検出（selected ion monitoring: SIM）法によりトリカブトのジテルペノイドアルカロイドを定量した．17,18）また，マススペクトルのフラグメンテーションの解析は有機化合物の構造解析の重要な手段であり，LC-APCI-MSによるジテルペノイドアルカロイドの立体異性体の解析を報告した．19–21）
ジテルペノイドアルカロイドの生理作用は，鎮痛作用や抗炎症作用，不整脈作用，強心作用，抗がん作用などが報告されている．22,23）トリカブトの主要成分であるaconitine（1）は強毒性であり，嘔吐や痙攣，呼吸困難，心臓発作を引き起し，22）この猛毒性からトリカブトを狩猟の矢毒として用いられたことが知られている．24） Aconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドの薬理作用は詳細に検討されており，25）鎮痛活性及び毒性に関する構造活性相関からC-8位のアセチルオキシ基が毒性及び鎮痛活性発現に対して大きく係わっていることが示された．26）さらに，C20-型ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9）やpseudokobusine（10），ignavine（14），hypognavine（15）（Fig. 5）の鎮痛作用の報告がある．27,28）これらより附子の鎮痛作用は，ジテルペノイドアルカロイドに由来すると考えられる．また，附子が配合されている漢方薬の牛車腎気丸及び桂枝加朮附湯に皮膚温上昇作用を認め，血管拡張作用が末梢循環の改善に有効であると考えられる．この血管拡張作用は，C20-型ジテルペノイドアルカロイドlucidusculine（12）が末梢血管及び冠状血管拡張作用を有し，用量によっては降圧作用が認められること29–31）や，筆者らのトリカブトエキスやジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6）やkobusine（9），pseudokobusine（10）が末梢血流量の増加作用32–34）を示すことより，附子の成分であるジテルペノイドアルカロイドが関与していると推察する．
本編では，北海道小樽市銭函に自生するオクトリカブト［Aconitum japonicum THUNB. subsp. subcuneatum（NAKAI）KADOTA］，札幌市定山渓に自生するテリハブシ［Aconitum yesoense var. macroyesoense（NAKAI）TAMURA］と栽培品種であるデルフィニウムパシフィックジャイアント（Delphinium elatum cv. Pacific Giant）の成分探索と単離成分のヒトがん細胞に対する細胞毒性について述べる．さらに，数種のC19-型とC20-型ジテルペノイドアルカロイド［delcosine（6），delpheline（7），kobusine（9），pseudokobusine（10），lucidusculine（12）］の誘導体のヒトがん細胞に対する細胞毒性について述べる．
オクトリカブト［A. japonicum THUNB. subsp. subcuneatum（NAKAI）KADOTA］の成分は，真島や杉野目らがaconitine（1）とjesaconitine（3）の単離を報告しているのみである．35,36）筆者らは，北海道小樽市銭函で採取したオクトリカブトの塊根をメタノール冷浸により抽出し，得られた粗アルカロイドをアルミナ，又はシリカゲルカラムクロマトグラフィー，prep. TLC及びHPLCにより分離精製し，54種のジテルペノイドアルカロイドを単離した．単離したジテルペノイドアルカロイドの構造は，NMR（1D及び2D），IR, MS［high-resolution（HR）MS］及び単結晶X線構造解析，また，既知化合物から得た誘導体とスペクトルデータを比較することにより同定あるいは決定した．オクトリカブトの成分探索において，C19-型及びC20-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し，aconitine（1），mesaconitine（2）及びjesaconitine（3）が主要成分であることを明らかにした．
2-1-1. オクトリカブト由来のC19-型ジテルペノイドアルカロイドの構造オクトリカブトより35種のaconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し（Fig. 6），そのうち14種の新規ジテルペノイドアルカロイドの構造を決定した．新規ジテルペノイドアルカロイド3-hydroxykaracoline（16）37）及び既知ジテルペノイドアルカロイドkaracoline（17），38–40） isotalatizidine（18），38,41） talatizamine（19）38,42）は，aconitine type amine subtype non-oxygenation at C-6 group（AIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 6）．4種の新規ジテルペノイドアルカロイド10-hydroxychasmanine（20），37） 14-benzoylneoline（21），39） subcumine（22），43） subcusine（23）43）及び5種の既知ジテルペノイドアルカロイドezochasmaconitine（24），43,44） anisoezochasmaconitine（25），43,44） foresticine（26），37,45） neoline（27），38,39,46） neolinine（28）37,47）は，aconitine type amine subtype oxygenation at C-6/non-oxygenation at C-15 group（AIb）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 6）．新規ジテルペノイドアルカロイド14-benzoylneoline（21）の構造は，neoline（27）をトリフルオロ酢酸存在下塩化ベンゾイルで処理すると1-benzoate（29）及び1,14-dibenzoate（30）とともに14-benzoylneoline（21）が得られ（Scheme 1），誘導体21と天然物21のスペクトルデータがよく一致したことより決定した．39）なお，neoline（27）をピリジン中塩化ベンゾイルで処理すると1-benzoate（29）のみが得られ（Scheme 1），39）空間的に障害の少ないC-1位が優先的にエステル化された（Fig. 7a）．しかし，酸性下ではN原子にプロトン化が起こり，C-1位水酸基との間に分子内水素結合が生じ（Fig. 7b），C-14位のエステル化が進行したと考えられる．新規ジテルペノイドアルカロイドsubcumine（22）の構造はX線結晶構造解析により構造を決定し，43）多くのaconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドではC-6位の置換基がα配位であるのに対して，subcumine（22）はβ配位であった．また，subcumine（22）を加水分解するとsubcusine（23）が得られたことより，新規ジテルペノイドアルカロイドsubcusine（23）の構造は14-deacetylsubcumineと決定した．43） Subcusine（23）はneoline（27）のC-6位異性体の構造であった．
7種の新規ジテルペノイドアルカロイドdeoxyjesaconitine（31），48,49） aljesaconitine A（32），15） aljesaconitine B（33），15） N-deethylaljesaconitine A（34），38） 14-anisoyllasianine（35），38） 14-anisoylaconine（36），50） 14-anisoyl-N-deethylaconine（37），38）及び10種の既知ジテルペノイドアルカロイドaconitine（1），46,48,49） mesaconitine（2），46,48,49） jesaconitine（3），38,46,48,49） hypaconitine（4），2,48,49） aconifine（38），46,51） deoxyaconitine（39），2,48,49） hokbusine A（40），15,38,52） aconine（41），38,46） penduline（42），39,53） 15α-hydroxyneoline（43）38,54）は，aconitine type amine subtype oxygenation at C-6 and C-15 group（AIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 6）．既知ジテルペノイドアルカロイドaconitine（1），mesaconitine（2），jesaconitine（3）はオクトリカブトの主要成分であり，3,13,15-トリヒドロキシ-8,14-ジエステルの特徴的な構造を有し，強毒性ジテルペノイドアルカロイドとして知られる．2,26）ジテルペノイドアルカロイドの毒性については3-1節で詳述するが，毒性発現にはC-3位水酸基とC-8及び14位のエステルが大きく関与している．新規ジテルペノイドアルカロイドdeoxyjesaconitine（31），既知ジテルペノイドアルカロイドhypaconitine（4）及びdeoxyaconitine（39）は，それぞれjesaconitine（3），mesaconitine（2）及びaconitine（1）のC-3位デオキシ体であった．Deoxyjesaconitine（31）の構造は，jesaconitine（3）を塩化チオニルで処理するとanhydrojesaconitine（44）が得られ，更に化合物44を酸化白金存在下接触還元することによりdeoxyjesaconitine（31）が得られ，誘導体31と天然物31のスペクトルデータがよく一致したことより決定した（Scheme 2）．49） 3種の新規ジテルペノイドアルカロイドaljesaconitine A（32），aljesaconitine B（33），N-deethylaljesaconitine A（34），及び既知ジテルペノイドアルカロイドhokbusine A（40）は，C-8位アルコキシの構造を有するジテルペノイドアルカロイドであった．Aljesaconitine A（32）及びaljesaconitine B（33）の構造は，jesaconitine（3）を室温でメタノールあるいは60°Cでエタノールと反応させることにより，それぞれaljesaconitine A（32）及びaljesaconitine B（33）が得られ，誘導体32及び33はそれぞれ天然物32及び33のスペクトルデータとよく一致したことより決定した（Scheme 3）．15）同様に，hokbusine A（40）はmesaconitine（2）を60°Cでメタノールと反応させることにより得られ，誘導体40と天然物40のスペクトルデータがよく一致したことより構造を同定した．15）また，mesaconitine N-oxideを60°Cでメタノールと反応させても原料回収のみであったことより，これらの反応はScheme 3に示す機構により進行すると考えられる．15,55）また，新規ジテルペノイドアルカロイド14-anisoyllasianine（35）はC-8位アミノ基を有する構造であり，このジテルペノイドアルカロイドの生合成はScheme 3に示す機構により，主要成分であるjesaconitine（3）より生成したと考えられる．56）既知ジテルペノイドアルカロイドpenduline（42）の構造は，aconitine（1）を無水トリフルオロメタン硫酸で処理すると13-trifluoromethansulfonate（45）が得られ，更に化合物45を室温中2537 Åのランプを用いた光反応により13-deoxyanhydroaconitine（46）が得られ，続いて，化合物46を酸化白金存在下接触還元するとpenduline（3,13-dideoxyaconitine; 42）が得られたことにより同定した（Scheme 4）．39）
新規ジテルペノイドアルカロイドlipojesaconitine（47）37）及び2種の既知ジテルペノイドアルカロイドlipoaconitine（48）38,57）とlipomesaconitine（49）38,57）は，aconitine type amine subtype lipo-alkaloids group（AId）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 6）．これらのジテルペノイドアルカロイドの生合成はScheme 3に示す機構により，主要成分であるjesaconitine（3），aconitine（1）及びmesaconitine（2）よりそれぞれ生成したと考えられる．57）既知aconitine type N,O-mixed acetal subtype non-oxygenation at C-6 group（AIIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであるnevadenine（50）38,58）は，isotalatizidine（18）のC-1-C-19エーテル構造であった（Fig. 6）．新規seco type amine subtype oxygenation at C-6 and C-15 group（EIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであるsecojesaconitine（51）38,59）はX線結晶構造解析により構造を決定し，C-3,17-エポキシ及びC-7,17が開裂した特異な構造であった（Fig. 6）．ピリジン中無水酢酸によるsecojesaconitine（51）のアセチル化では，3-acetyljesaconitine（52）及び3,15-diacetyljesaconitine（53）が得られた（Scheme 5）．59）しかしながら，3,15-diacetyljesaconitine（53）は，通常14位芳香環のシールド効果を受ける15位水酸基を有するjesaconitine（3）のアセチル化では得られない．一方，secojesaconitine（51）を酢酸で処理すると，jesaconitine（3）が得られた（Scheme 5）．これらのsecojesaconitine（51）の反応は，窒素のローンペアを介した機構によりaconitine骨格へ変換されることを示した（Scheme 5）．55,59）
続いて，5種のlycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイド（Fig. 8）をオクトリカブトより単離し，3種の既知ジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6），15,38,60） 14-acetyldelcosine（54），39,61） virescenine（55）38,62）はlycoctonine type amine subtype 7,8-diol group（BIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった．また，lycoctonine type N,O-mixed acetal subtype 7,8-diol group（BIIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドである新規ジテルペノイドアルカロイドN-deethylnevadensine（56）38）の構造を決定し，既知ジテルペノイドアルカロイドnevadensine（57）38,58）を同定した．
23種の既知ジテルペノイドアルカロイドmesaconitine（2），hypaconitine（4），delcosine（6），karacoline（17），isotalatizidine（18），talatizamine（19），ezochasmaconitine（24），anisoezochasmaconitine（25），foresticine（26），neoline（27），neolinine（28），aconifine（38），deoxyaconitine（39），hokbusine A（40），aconine（41），penduline（42），15α-hydroxyneoline（43），lipoaconitine（48），lipomesaconitine（49），nevadenine（50），14-acetyldelcosine（54），virescenine（55）及びnevadensine（57）は，オクトリカブトより初めて単離した．
2-1-2. オクトリカブト由来のC20-型ジテルペノイドアルカロイドの構造オクトリカブトより14種のC20-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し（Fig. 9），7種の新規ジテルペノイドアルカロイドの構造を決定した．3種の新規ジテルペノイドアルカロイド9-hydroxykobusine（58），50） 14-hydroxykobusine（59），50） japosubcusine（60）50）及び4種の既知ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9），37,63,64） 9-hydroxynominine（61），37,55） ryosenamine（62），38,65） torokonine（63）37,66）は，hetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった．また，2種の新規ジテルペノイドアルカロイドjaposubcumine（64），50） japosubcunine（65）50）は，vakognavine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであり，新規ジテルペノイドアルカロイドsubdesculine（66）59）及び2種の既知ジテルペノイドアルカロイドdehydrolucidusculine（67）38,67）及びdehydroluciculine（68）37,68,69）は，napelline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった．続いて，新規ジテルペノイドアルカロイドjaponicidine（69）50）及び既知ジテルペノイドアルカロイドaconicharmine A（70）37,70）は，actaline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった．C19-型ジテルペノイドアルカロイドは，C20-型ジテルペノイドアルカロイドより生合成されると考えられており71）（Scheme 6），単離したjaponicidine（69）とaconicharmine A（70）は生合成中間体と考えられ（Scheme 6），japonicidine（69）はScheme 7のような機構により生成すると考えられる．72）
7種の既知ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9），9-hydroxynominine（61），ryosenamine（62），torokonine（63），dehydrolucidusculine（67），dehydroluciculine（68），aconicharmine A（70）は，オクトリカブトより初めて単離した．
2-2. テリハブシ由来のジテルペノイドアルカロイドの構造テリハブシ［Aconitum yesoense var. macroyesoense（NAKAI）TAMURA］の成分は，真島と森尾73）や杉野目ら74–76）がdelcosine（6），kobusine（9），pseudokobusine（10），lucidusculine（12）及び14-acetyldelcosine（54）の単離を報告しているのみである．筆者らは，北海道札幌市定山渓で採取したテリハブシの塊根をエタノール冷浸により抽出し，得られた粗アルカロイドをシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びHPLCにより分離精製し，36種のジテルペノイドアルカロイドを単離した．単離したジテルペノイドアルカロイドの構造は，NMR（1D及び2D），IR, MS（HRMS）及び単結晶X線構造解析，また，既知化合物から得た誘導体とスペクトルデータを比較することにより同定あるいは決定した．
テリハブシの成分探索により，2種のlycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6），14-acetyldelcosine（54），2種のhetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9），pseudokobusine（10），napelline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドlucidusculine（12）が主要成分であることを明らかにした．
2-2-1. テリハブシ由来のC19-型ジテルペノイドアルカロイドの構造テリハブシより16種のC19-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し，そのうち3種の既知化合物は，2種のaconitine type amine subtype non-oxygenation at C-6 group（AIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドkaracoline（17），38–40,77） isotalatizidine（18）38,41,77）及びaconitine type amine subtype oxygenation at C-6/non-oxygenation at C-15 group（AIb）C19-型ジテルペノイドアルカロイドsubcusine（23）43,78）であった（Fig. 6）．新規ジテルペノイドアルカロイド9-hydroxyvirescenine（71）79）及び8種の既知ジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6），15,38,60,67,74,79） 14-acetyldelcosine（54），39,61,67,76,79） virescenine（55），38,62,77） browniine（72），64,79） 14-acetylbrowniine（73），61,77,79） 14-dehydrodelcosine（74），46,80） macrocentridine（75），78,81） delphinifoline（76）79,82）はlycoctonine type amine subtype 7,8-diol group（BIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Figs. 8 and 10）．
新規ジテルペノイドアルカロイドyesoensine（77）78）及び2種の既知ジテルペノイドアルカロイドnevadensine（57），38,58,68） 18-methoxygadesine（78）68,83）は，lycoctonine type N,O-mixed acetal subtype 7,8-diol group（BIIa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 10）．新規ジテルペノイドアルカロイドyesoensine（77）は，14-dehydrodelcosine（74）をアセトン–水（5 : 1 v/v）中過マンガン酸カリウムで処理するとyesoensine（77）及びN-deethylyesoensine（79）78）が得られ，誘導体77のスペクトルデータは天然物77とよく一致したことより構造を決定した（Scheme 8）．78）さらに，新規lycoctonine type amide subtype 7,8-diol group（BIVa）C19-型ジテルペノイドアルカロイドα-oxobrowniine（80）68）を単離し（Fig. 10），browniine（72）を無水アセトン中過マンガン酸カリウムで処理するとα-oxobrowniine（80）及びoxobrowniine（81）84）が得られ，誘導体80のスペクトルデータは天然物80とよく一致したことより構造を決定した（Scheme 9）．68）
8種の既知ジテルペノイドアルカロイドvirescenine（55），nevadensine（57），browniine（72），14-acetylbrowniine（73），14-dehydrodelcosine（74），macrocentridine（75），delphinifoline（76），18-methoxygadesine（78）は，テリハブシより初めて単離した．
2-2-2. テリハブシ由来のC20-型ジテルペノイドアルカロイドの構造テリハブシより20種のC20-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し，そのうち11種は新規ジテルペノイドアルカロイドであり，構造を決定した（Fig. 11）．2種の新規ジテルペノイドアルカロイドyesoxine（82）77）とmacroyesoenline（83）79）及び既知ジテルペノイドアルカロイドcochlearenine（84）79,85）は，denudatine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 11）．新規ジテルペノイドアルカロイドyesoxine（82）は，X線結晶構造解析により構造を決定した．Yesoxine（82）はジテルペノイドアルカロイドでは数少ないエポキシ基を含み，macroyesoenline（83）とcochlearenine（84）はエポキシ基が開環したと思われるジオール構造を有していた．また，2種の新規ジテルペノイドアルカロイドyesoline（85），80） yesonine（86）68,79）は，hetidine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 11）．Pseudokobusine（10）をメタノール中ヨウ化メチルで処理するとメチル化ヨウ素塩（87）が得られ，化合物87を50%メタノール水溶液中酸化銀で処理するとN-methyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusine（86）が得られた（Scheme 10）．86） Yesoline（85）のアルカリ加水分解生成物は誘導体86とスペクトルデータが一致したことより，yesoline（85）はN-methyl-15-veratroyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusineと決定した．さらに，新規ジテルペノイドアルカロイドyesonine（86）は，誘導体86とスペクトルデータがよく一致したことより構造を決定した．
3種の新規ジテルペノイドアルカロイド15-benzoylpseudokobusine（88），77） 15-veratrylpseudokobusine（89），77） yesodine（90）78）及び2種の既知ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9），38,63,64,67,74–76,79） pseudokobusine（10）64,67,74–76,87,88）は，hetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであり（Fig. 11），2種の新規ジテルペノイドアルカロイド88, 90はpseudokobusine（10）より誘導することにより構造を決定した．Pseudokobusine（10）のピリジン溶液に塩化ベンゾイルを加え還流すると，pseudokobusine 6-benzoate（91），11-benzoate（92），15-benzoate（88），6,11-dibenzoate（93）及び6,15-dibenzoate（94）が得られ77）（Scheme 11），誘導体88のスペクトルデータが天然物88とよく一致したことより15-benzoylpseudokobusine（88）の構造を決定した．また，pseudokobusine（10）をピリジン中塩化p-ニトロベンゾイルで処理すると，pseudokobusine 6-p-nitrobenzoate（95），15-p-nitrobenzoate（96），6,11-di-p-nitrobenzoate（97），6,15-di-p-nitrobenzoate（98）及び6,11,15-tri-p-nitrobenzoate（99）が得られ，続いて，誘導体97をジクロロメタン中N,N′-dicyclohexylcarbodiimide及び4-dimethylaminopyridine存在下，S-（+）-2-methylbutyric acidで処理するとpseudokobusine 15-［（S）-2-methylbutyryl］-6,11-di-p-nitrobenzoate（100）が得られた（Scheme 11）．78）得られた誘導体100をトリエチルアミン–メタノール–水（1 : 5 : 1 v/v）中60度で部分加水分解するとpseudokobusine 15-（S）-2-methylbutyrate（90）が得られ78）（Scheme 11），誘導体90の旋光度は天然物90とよく一致したことよりyesodine（90）の構造を決定した．
4種の新規ジテルペノイドアルカロイドdehydrolucidusculine（67），38,67,79）N-deethyldehydrolucidusculine（101），67） 12-acetyldehydrolucidusculine（102），77） 12-acetyllucidusculine（103）77）及び6種の既知ジテルペノイドアルカロイドluciculine（11），64,73–77） lucidusculine（12），64,73–77,79） dehydroluciculine（68），37,69,77） 1-acetylluciculine（104），44,77） flavadine（105），68,89） flavamine（106）68,89）は，napelline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドであった．Lucidusculine（12）を50%エタノール溶液中酸化銀90）で処理するとdehydrolucidusculine（67），N-deethyldehydrolucidusculine（101）及びN-deethyllucidusculine（107）が得られ67）（Scheme 12），誘導体67及び101のスペクトルデータはそれぞれ天然物67及び101とよく一致したことより構造を決定した．また，dehydrolucidusculine（67）をピリジン中無水酢酸で処理すると12-acetyldehydrolucidusculine（102）が得られ77）（Scheme 12），誘導体102のスペクトルデータは天然物102とよく一致したことより構造を決定した．さらに，lucidusculine（12）をピリジン中無水酢酸で処理すると，12-acetyllucidusculine（103）及び1,12,15-triacetylluciculine（108）が得られ77）（Scheme 12），誘導体103のスペクトルデータは天然物103とよく一致したことより構造を決定した．
5種の既知ジテルペノイドアルカロイドluciculine（11），dehydroluciculine（67），1-acetylluciculine（104），flavadine（105），flavamine（106）は，テリハブシより初めて単離した．
2-3. Delphinium属植物由来のジテルペノイドアルカロイドの構造デルフィニウム属（Delphinium）はトリカブト属（Aconitum）と同じくキンポウゲ科（Ranunclaceae）に属し，主にlycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドが含まれることが知られている．3）筆者らは，栽培品種であるデルフィニウムパシフィックジャイアント（Delphinium elatum cv. Pacific Giant）の種子を石油エーテルで脱脂後，エタノールで抽出し，得られたエキストラクトを常法により処理し，粗アルカロイドを得た．得られた粗アルカロイドをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し，42種のジテルペノイドアルカロイドを単離した（Figs. 12 and 13）．単離したジテルペノイドアルカロイドの構造はNMR（1D及び2D），IR及びMS（HRMS），また，既知化合物から得た誘導体とスペクトルデータを比較することにより同定あるいは決定した．デルフィニウムパシフィックジャイアントの成分探索により，delpheline（7）が主要成分であることを明らかにした．
デルフィニウムパシフィックジャイアントより26種のlycoctonine type amine subtype（BI）C19-型ジテルペノイドアルカロイドを単離し（Fig. 12），そのうち16種の新規ジテルペノイドアルカロイドの構造を決定した．新規ジテルペノイドアルカロイドelpacidine（109）91）は，lycoctonine type amine subtype 7-hydroxy/8-methoxy group（BIb）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった．15種の新規ジテルペノイドアルカロイドpacidine（112），92–94,96） paciline（113），97） pacinine（117），91,93,94,96,97） 6-dehydroeladine（118），91,94,96） melpheline（121），93,94） meladine（122），96） melapacitine（123），96） elapaciline（124），96） elapacigine（126），94） N-deethyl-N-formylpaciline（127），94） N-deethyl-N-formyldelpheline（128），96） N-deethyl-N-formyleladine（129），96） N-deethyl-N-formylpacinine（130），94） N-deethyldelpheline（131），96） N-deethylpacinine（132）96）及び9種の既知ジテルペノイドアルカロイドdelpheline（7），91,93–97） delcorine（110），92–95） 6-dehydrodelcorine（111），93,95,96） isodelpheline（114），91–94,98） eladine（115），92,94,96,98） delelatine（116），96,99） yunnadelphinine（119），91–94,96,100） 6-dehydroeldelidine（120），96,101） bonvalotidine C（125）93,96,103）は，lycoctonine type amine subtype 7,8-methylenedioxy group（BIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 12）．新規ジテルペノイドアルカロイドpaciline（113）はdelpheline（7）をメチル化（DMSO中NaH存在下，CH3Iで処理）することにより得られ，誘導体113のスペクトルデータは天然物113とよく一致したことより構造を決定した（Scheme 13）．97）新規ジテルペノイドアルカロイドpacinine（117）はdelpheline（7）を80%エタノール中酸化銀102）で処理することにより得られ，誘導体117のスペクトルデータは天然物117とよく一致したことより構造を決定した（Scheme 13）．97）既知ジテルペノイドアルカロイドandersonidine（133）92,104）は，lycoctonine type amine subtype 7,8-diol/18-anthranoyl group（BId）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 12）．
既知ジテルペノイドアルカロイドlaxicyminine（134）93,94,96,105）は，lycoctonine type N,O-mixed acetal subtype 7,8-methylenedioxy group（BIIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 13）．4種の新規ジテルペノイドアルカロイドiminopaciline（135），91） iminodelpheline（136），91,93） iminoisodelpheline（137），91,93） iminoeladine（138）96）は，lycoctonine type imine subtype 7,8-methylenedioxy group（BIIIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 13）．新規ジテルペノイドアルカロイドpacifidine（139）92）は，lycoctonine type imine subtype 7,8-diol/18-anthranoyl group（BIIId）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 13）．6種の新規ジテルペノイドアルカロイド19-oxopaciline（140），96） 19-oxoisodelpheline（141），93,94,96） 19-oxopacinine（142），96）N-deethyl-19-oxodelpheline（143），93,96）N-deethyl-19-oxoisodelpheline（144），93,96）N-deethyl-19-oxoeladine（145）96）は，lycoctonine type amide subtype 7,8-methylenedioxy group（BIVc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 13）．2種の新規ジテルペノイドアルカロイドpacifiline（146）92）及びpacifinine（147）92）は，lycoctonine type amide subtype 7,8-diol/18-anthranoyl group（BIVd）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであった（Fig. 13）．2種の新規ジテルペノイドアルカロイドN-formyl-4,19-secopacinine（148），91,93）N-formyl-4,19-secoyunnadelphinine（149）94,96）は，seco type amine subtype 7,8-methylenedioxy group（EIc）C19-型ジテルペノイドアルカロイドであり，それぞれpacinine（117）及びyunnadelphinine（119）のC-4とC-19の結合が開裂し，N-ホルミル基を有する特異な構造で，初めての報告であった（Fig. 13）．
11種の既知ジテルペノイドアルカロイドdelpheline（7），delcorine（110），6-dehydrodelcorine（111），isodelpheline（114），eladine（115），delelatine（116），yunnadelphinine（119），6-dehydroeldelidine（120），bonvalotidine C（125），andersonidine（133），laxicyminine（134）は，デルフィニウムパシフィックジャイアントより初めて単離した．
ジテルペノイドアルカロイドの生理作用は，トリカブトの主要成分であるaconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドaconitine（1），mesaconitine（2）及びjesaconitine（3）は強毒性であることから，多くは研究されておらず，鎮痛作用や抗炎症作用，不整脈作用，強心作用などが報告されている．2,3,22,23）筆者らは，小樽市銭函産オクトリカブト（A. japonicum subsp. subcuneatum）及び札幌市定山渓産テリハブシ（A. yesoense var. macroyesoense）のエキストラクトや含有ジテルペノイドアルカロイドの急性毒性を検討した．また，ジテルペノイドアルカロイドの抗がん作用の報告は数報106,107）みられるが，詳細に検討されていないことから，C19-型及びC20-型ジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞に対する細胞毒性を検討した．
3-1. ジテルペノイドアルカロイドの毒性オクトリカブト及びテリハブシのエキストラクトや含有するジテルペノイドアルカロイドの急性毒性（LD50: mg/kg）を，マウスを用いて検討した（Table 1）．オクトリカブトのメタノール及び水エキストラクトのLD50（s.c.）は，それぞれ9.1及び20.5 mg/kgと強い毒性を示した．15）オクトリカブトの毒性は，前記（2-1節）のとおり含有する強毒性のaconitine（1; LD50: 0.380 mg/kg, i.p.），108） mesaconitine（2; LD50: 0.213 mg/kg, i.p.）108）及びjesaconitine（3; LD50: 0.35 mg/kg, i.p.）22）を主要成分としていることによる（Fig. 14）．また，新潟産トリカブト（A. japonicum; LD50: 120 mg/kg, s.c.）10）はaconitine（1）及びmesaconitine（2）が主要成分であり，オクトリカブトは，更にjesaconitine（3）も含有することにより，より毒性が強いと考えられる．一方，テリハブシのメタノール及び水エキストラクトのLD50（s.c.）は，それぞれ652及び990 mg/kgと弱い毒性を示した．28）テリハブシは，前記（2-2節）のとおりdelcosine（6; LD50: >200 mg/kg, s.c.）28）や14-acetyldelcosine（54; LD50: >200 mg/kg, s.c.），28） lucidusculine（12; LD50: >200 mg/kg, s.c.）28）を主要成分とし（Fig. 14），これらジテルペノイドアルカロイドの毒性が弱いことや強毒性のaconitine（1）類が含まれないことから，毒性が弱いと考えられる．
| Alkaloids | LD50 (mg/kg) | |||
|---|---|---|---|---|
| s.c. | p.o. | i.p. | i.v. | |
| A. japonicum subsp. subcuneatum MeOH extr.15) | 9.1 | 48.6 | — | — |
| H2O extr.15) | 20.5 | 101.4 | ||
| A. japonicum (Niigata) MeOH extr.10) | 120 | 540 | 110 | 60 |
| A. yesoense var. macroyesoense MeOH extr.28) | 652 | — | — | — |
| H2O extr.28) | 990 | — | — | — |
| Aconitine (1)107) | 0.270 | 1.8 | 0.380 | 0.12 |
| Mesaconitine (2)107) | 0.204 | 1.9 | 0.213 | 0.10 |
| Jesaconitine (3)22) | — | — | 0.35 | — |
| Hypaconitine (4)107) | 1.19 | 5.8 | 1.10 | 0.47 |
| Delcosine (6)28) | >200 | — | — | — |
| Lucidusculine (12)28) | >200 | — | — | — |
| Aljesaconitine A (32)15) | 5.2 | 56.5 | — | — |
| Aljesaconitine B (33)15) | 1.9 | 43.8 | — | — |
| Hokbusine A (40)15) | 21 | 207 | — | — |
| Aconine (41)108) | — | — | — | 1160 |
| 14-Acetyldelcosine (54)28) | >200 | — | — | — |
| 8-O-Ethyl-14-benzoylmesaconine (150)15) | 3.6 | 45.9 | — | — |
| 14-Benzoylaconine (151)107) | — | — | 70 | 23 |
| 14-Benzoylmesaconine (152)22) | — | — | 240 | 21 |
強毒性のaconitine（1）やmesaconitine（2）類の毒性発現には，構造中の3位水酸基，8位アセチル基及び14位ベンゾイル基が大きく関与している（Fig. 14, Scheme 14）．3位に水酸基を持たないhypaconitine（4）のLD50（1.19 mg/kg, s.c.）108）は，mesaconitine（2）の1/5に毒性が減少した．8位アセチル基がアルコシ基であるhokbusine A（40）及びaljesaconitine A（32）のLD50（それぞれ21, 5.2 mg/kg, s.c.）15）は，それぞれmesaconitine（2）及びjesaconitine（3）の1/15–1/100に毒性が減少した．また，aljesaconitine B（33; LD50: 1.9 mg/kg, s.c.）15）及び8-O-ethyl-14-benzoylmesaconine（150; LD50: 3.6 mg/kg, s.c.）15）は，それぞれhokbusine A（40）及びaljesaconitine A（32）より毒性が3–6倍強く，アルコシ基のアルキル鎖が長くなると毒性が増強されると考えられる．8位アセチル基が水酸基である14-benzoylaconine（151; LD50: 70 mg/kg, i.p.）108）及び14-benzoylmesaconine（152; LD50: 240 mg/kg, i.p.）22）は，それぞれaconitine（1）及びmesaconitine（2）の1/180–1/1100に毒性が大きく減少した．さらに，8位アセチル基及び14位ベンゾイル基が水酸基であるaconine（41; LD50: 1160 mg/kg, i.v.）109）は，aconitine（1）及びjesaconitine（3）の1/3000–1/10000に毒性が非常に減少した．したがって，aconitine（1）やmesaconitine（2）類の毒性発現には，構造中の8位アセチル基及び14位ベンゾイル基が必須である．さらに，3位水酸基により，毒性が増強される．
ジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞［A549（lung carcinoma），DU145（prostate carcinoma），MDA-MB-231（triple-negative breast cancer），MCF-7（estrogen receptor-positive, HER2-negative breast cancer），KB（identical to cervical carcinoma HeLa derived AV-3 cell line），KB-VIN（multidrug-resistant（MDR）subline KB-VIN）］に対する細胞毒性を検討した．
3-2-1. Aconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞に対する細胞毒性オクトリカブトより単離した21種のジテルペノイドアルカロイドaconitine（1），110–112） mesaconitine（2），110–112） jesaconitine（3），110–112） hypaconitine（4），110–112） 3-hydroxykaracoline（16），37,111,112） karacoline（17），110–112） isotalatizidine（18），38,111,112） 14-benzoylneoline（21），110–112） neoline（27），110–112） neolinine（28），37,111,112） deoxyjesaconitine（31），110–112） aljesaconitine A（32），110–112）N-deethylaljesaconitine A（34），38,111,112） 14-anisoyllasianine（35），38,111,112） deoxyaconitine（39），110–112） hokbusine A（40），110–112） aconine（41），38,111,112） lipojesaconitine（47），37,111,112） lipoaconitine（48），37,111,112） lipomesaconitine（49），38,111,112） secojesaconitine（51）110–112）及び2種の誘導体3,15-diacetyljesaconitine（53），110–112） 3-acetylmesaconitine（153）110–112）について，ヒトがん細胞（A549, DU145, MDA-MB-231, MCF-7, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討した（Fig. 15）．ジテルペノイドアルカロイド1–4, 16–18, 21, 27, 28, 31, 32, 34, 35, 39–41, 51, 53及び153は，ヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．
Lipojesaconitine（47）は，4種のヒトがん細胞（A549, MDA-MB-231, MCF-7, KB）に対して明らかに細胞毒性（IC50 6.0–7.3 µM）がみられたが，KB-VIN細胞（IC50 18.6 µM）に対しては弱い細胞毒性がみられた（Table 2）．Lipoaconitine（48）及びlipomesaconitine（49）は，KB細胞に対しては中程度の細胞毒性（それぞれIC50 13.7及び9.9 µM）がみられたが，そのほかの4種のヒトがん細胞（A549, MDA-MB-231, MCF-7, KB-VIN）に対しては弱い細胞毒性（IC50 15.5–21.5 µM）がみられた（Table 2）．Aconitine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞に対する細胞毒性の発現には，以上の結果とChdoevaら106）の8-O-azeloyl-14-benzoylaconine（154: IC50 10–20 µM）（Fig. 15）の報告より，C-8位に脂肪酸エステルが存在することにより細胞毒性がみられ，更に，C-14位のベンゾイル基［lipoaconitine（48），lipomesaconitine（49）］がアニソイル基［lipojesaconitine（47）］に置換することで，細胞毒性が強くなった．
| Alkaloids | IC50 (µM)a) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| A549 | MDA-MB-231 | MCF-7 | KB | KB-VIN | |
| 47 | 7.3±0.3 | 6.0±0.2 | 6.7±0.2 | 6.0±0.2 | 18.6±0.9 |
| 48 | 17.4±1.1 | 15.5±0.5 | 16.0±0.3 | 13.7±1.3 | 20.3±1.1 |
| 49 | 17.2±2.3 | 20.0±0.2 | 19.0±1.0 | 9.9±3.3 | 21.5±0.9 |
| Paclitaxelb) | 6.3±0.3 | 7.8±0.1 | 12.4±0.1 | 6.8±0.8 | 2237.6±271.4 |
a)Values are mean±standard deviation (S.D.). b)Paclitaxel (nM) was used as an experimental control.
オクトリカブトより単離した5種のジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6），110–112） 14-acetyldelcosine（54），110–112） virescenine（55），38,111,112）N-deethylnevadensine（56），38,111,112） nevadensine（57），38,111,112）テリハブシより単離した3種のジテルペノイドアルカロイド14-acetylbrowniine（73），110–112） delphinifoline（76），110–112） 18-methoxygadesine（78），110–112）デルフィニウムパシフィックジャイアントより単離した23種のジテルペノイドアルカロイドdelpheline（7），110–112） delcorine（110），94,111,112） pacidine（112），94,111,112） isodelpheline（114），94,111,112） eladine（115），94,111,112） pacinine（117），110–112） yunnadelphinine（119），110–112） melpheline（121），93,111,112） bonvalotidine C（125），93,111,112）N-deethyl-N-formylpaciline（127），94,111,112）N-deethyl-N-formylpacinine（130），94,111,112） andersonidine（133），110–112） laxicyminine（134），93,111,112） iminodelpheline（136），91,111,112） iminoisodelpheline（137），91,111,112） pacifidine（139），110–112） 19-oxoisodelpheline（141），94,111,112）N-deethyl-19-oxodelpheline（143），93,111,112）N-deethyl-19-oxoisodelpheline（144），93,111,112） pacifiline（146），110–112） pacifinine（147），110–112）N-formyl-4,19-secopacinine（148），91,111,112）N-formyl-4,19-secoyunnadelphinine（149），94,111,112）及び2種の誘導体delsoline（155），110–112）N-deethyldelsoline（156）110–112）（Fig. 15）について，ヒトがん細胞（A549, DU145, MDA-MB-231, MCF-7, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討したが，いずれのジテルペノイドアルカロイドもヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．
3-2-3. Lycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドdelcosine誘導体のヒトがん細胞に対する細胞毒性ジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6）の46種の誘導体について，5種のヒトがん細胞（A549, MDA-MB-231, MCF-7, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討した（Fig. 16, Table 3）．110–113） Delcosine（6）のアセチル及びベンゾイル誘導体［1-O-acetyldelcosine（157），1,14-O-diacetyldelcosine（157a），14-benzoyldelcosine（158）］は，細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．しかし，delcosine（6）のC-1あるいは14位の水酸基へ様々なアシル基を導入することにより，細胞毒性がみられた．
| Alkaloids | IC50 (µM)a) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| A549 | DU145 | MDA-MB-231 | MCF-7 | KB | KB-VIN | |
| 157 | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 157a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 158 | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 159 | 20.6±0.3 | — | 19.4±1.0 | 17.9±2.3 | 14.6±0.6 | 17.1±0.8 |
| 159a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 160 | 18.7±0.1 | — | 29.1±1.6 | 25.8±1.4 | 19.6±0.3 | 21.1±1.5 |
| 161 | 7.7±0.9 | — | 8.6±6.0 | 15.8±4.2 | 5.6±1.2 | 8.6±1.9 |
| 161a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 162 | 4.5±0.5 | — | 5.0±0.1 | 5.9±0.3 | 5.4±0.3 | 5.6±0.4 |
| 162a | 24.8±0.0 | — | 4.7±0.1 | 12.2±0.3 | 5.8±0.4 | >40 |
| 163 | 4.8±0.3 | — | 4.8±0.7 | 5.7±0.4 | 4.3±0.5 | 5.3±0.4 |
| 163a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 164 | 26.5±0.3 | — | >40 | 40.6±2.5 | 27.8±1.7 | 28.1±3.0 |
| 165 | 20.8±1.7 | — | 32.4±2.3 | 25.9±2.4 | 23.0±2.4 | 21.5±1.3 |
| 165a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 166 | 21.7±1.6 | — | 30.2±2.7 | 26.9±1.4 | 20.7±1.2 | 21.5±3.6 |
| 167 | 14.4±2.1 | — | 20.1±0.7 | 16.3±2.1 | 13.6±1.1 | 15.7±0.8 |
| 168 | 11.4±1.4 | — | 10.4±1.7 | 22.5±1.5 | 10.8±1.9 | 11.8±3.2 |
| 169 | 4.7±0.1 | — | 5.3±0.2 | 9.2±0.4 | 5.8±0.6 | 9.5±0.5 |
| 169a | 4.9±0.1 | — | 4.9±0.1 | 5.3±0.2 | 4.7±0.1 | 4.9±0.1 |
| 169b | 4.8±0.1 | — | 4.6±0.3 | 6.0±0.1 | 4.8±0.4 | 4.9±0.4 |
| 170 | 20.8±2.1 | — | 21.5±0.6 | 21.4±0.3 | 18.6±1.7 | 15.0±0.1 |
| 170a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | 39.1±2.0 |
| 170b | 23.8±2.0 | — | 25.2±1.0 | 23.3±1.1 | 23.7±1.1 | 22.6±0.3 |
| 171 | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 172 | 20.6±1.2 | — | 21.3±1.3 | 22.4±1.2 | 20.8±2.1 | 18.0±1.0 |
| 172a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 173 | 18.6±2.6 | — | 19.7±2.0 | 20.6±1.2 | 22.2±1.8 | 19.8±1.9 |
| 173a | 33.0±2.1 | — | 32.5±1.7 | 31.1±0.8 | 23.3±1.1 | 40.0±1.0 |
| 174 | 23.8±2.6 | — | 33.4±1.7 | 29.8±1.2 | 22.8±1.7 | 22.6±2.4 |
| 175 | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 176 | 17.3±2.2 | — | 23.1±0.5 | 20.0±0.7 | 16.1±1.8 | 17.4±1.9 |
| 177 | 16.5±1.3 | — | 22.5±0.8 | — | 8.7±0.7 | 15.8±0.8 |
| 178 | 40.9±5.3 | — | >40 | >40 | 36.3±1.0 | 29.3±0.6 |
| 179 | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 180 | 21.2±0.1 | — | 24.8±1.6 | 24.6±1.0 | 18.7±1.2 | 21.7±0.6 |
| 180a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 181 | 23.8±0.5 | — | 32.9±0.9 | 22.6±1.5 | 21.2±0.1 | 19.2±0.1 |
| 182 | 11.2±0.7 | — | — | — | 21.1±3.9 | 19.5±8.2 |
| 183 | 29.7±0.7 | — | 43.2±1.8 | 32.0±0.6 | 36.0±0.4 | 45.1±3.4 |
| 184 | 18.5±0.5 | — | 17.9±0.4 | 15.5±0.6 | 13.7±0.1 | 14.2±0.5 |
| 185 | 22.9±0.5 | — | 20.7±2.1 | 20.5±1.0 | 21.6±0.1 | 24.4±0.5 |
| 186 | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 186a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 186b | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 187a | >20 | — | — | >20 | >20 | >20 |
| Paclitaxelb) | 4.8±0.6 | 5.9±1.9 | 8.4±0.8 | 10.2±0.9 | 5.8±0.2 | 2405.4±44.8 |
a)Values are mean±standard deviation (S.D.). b)Paclitaxel (nM) was used as an experimental control.
C-1位の誘導体のうち，1-（3,5-dichlorobenzoyl）delcosine（161），1-（4-chloro-3-nitrobenzoyl）delcosine（162），1-（4-dichloromethylbenzoyl）delcosine（163）及び1-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl）delcosine（169）は，すべてのヒトがん細胞に対して明らかに細胞毒性（それぞれ平均IC50 9.3, 5.3, 5.0及び6.9 µM）がみられた．1-（4-Bromobenzoyl）delcosine（159），1-（4-fluoro-3-trifluoromethylbenzoyl）delcosine（167），1-（4-methoxy-3-trifluoromethylbenzoyl）delcosine（168），1-（2,4,5-trifluoro-3-methoxybenzoyl）delcosine（170），1-（3,5-bis-trifluoromethylbenzoyl）delcosine（172），1-（4-trifluoromethylthiobenzoyl）delcosine（173），1-（3,5-diethoxybenzoyl）delcosine（176），1-（4-benzyloxybenzoyl）delcosine（177），1-（3-trifluoromethylcinnamoyl）delcosine（182）及び1-naphthoyldelcosine（184）は，すべてのヒトがん細胞に対して中程度の細胞毒性（平均IC50 12.7–20.7 µM）がみられた．誘導体177は，KB細胞に対してよい細胞毒性（IC50 8.7 µM）がみられたが，A549, MDA-MB-231及びKB-VIN細胞に対して細胞毒性は弱かった．1-（4-Chlorobenzoyl）delcosine（160），1-（3-chloro-4-fluorobenzoyl）delcosine（165），1-（4-fluoro-3-methylbenzoyl）delcosine（166），1-（3,5-dimethoxybenzoyl）delcosine（174），1-（2,2-difluoro-1,3-benzodioxole-4-carbonyl）delcosine（180），1-（phenylacetyl）delcosine（181）及び1-（anthraquinone-2-carbonyl）delcosine（185）は，すべてのヒトがん細胞に対して弱い細胞毒性（平均IC50 22.0–26.5 µM）がみられた．1-（4-Dimethylaminobenzoyl）delcosine（164），1-（4-cyanobenzoyl）delcosine（178）及び1-（4-nitrocinnamoyl）delcosine（183）は，すべてのヒトがん細胞に対してわずかな細胞毒性がみられたのに対して，誘導体1-（4-trifluoromethylbenzoyl）delcosine（171），1-（3,4,5-trimethoxybenzoyl）delcosine（175），1-piperonyloyldelcosine（179）及び1-（4-nitrobenzoyl）delcosine（186）は，すべてのヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった．
C-1,14位の誘導体のうち，1,14-di-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl）delcosine（169a）及び14-O-acetyl-1-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl）delcosine（169b）は，すべてのヒトがん細胞に対して明らかに細胞毒性（それぞれ平均IC50 4.9及び5.0 µM）がみられた．1,14-Di-（4-chloro-3-nitrobenzoyl）delcosine（162a）（平均IC50 11.9 µM）は，MDA-MB-231及びKB細胞に対して，誘導体169a及び169bと同程度の細胞毒性（それぞれIC50 4.7及び5.8 µM）がみられたが，MCF-7及びA549細胞に対しては弱い細胞毒性（それぞれIC50 12.2及び24.8 µM）がみられ，KB-VIN細胞に対しては細胞毒性がみられなかった．14-O-Acetyl-1-（2,4,5-trifluoro-3-methoxybenzoyl）delcosine（170b）は，すべてのヒトがん細胞に対して弱い細胞毒性（平均IC50 23.7 µM）がみられた．1,14-Di-（2,4,5-trifluoro-3-methoxybenzoyl）delcosine（170a）及び1,14-di-（4-trifluoromethylthiobenzoyl）delcosine（173a）はわずかな細胞毒性（それぞれ平均IC50 39.8及び32.0 µM）がみられたのに対して，1,14-di-（4-bromobenzoyl）delcosine（159a），1,14-di-（3,5-dichlorobenzoyl）delcosine（161a），1,14-di-（4-dichloromethylbenzoyl）delcosine（163a），1,14-di-（3-chloro-4-fluorobenzoyl）delcosine（165a），1,14-di-（3,5-bis-trifluoromethylbenzoyl）delcosine（172a），1,14-di-（2,2-difluoro-1,3-benzodioxole-4-carbonyl）delcosine（180a），1,14-di-（4-nitrobenzoyl）delcosine（186a），14-O-acetyl-1-（4-nitrobenzoyl）delcosine（186b）及び1,14-di-（4-ethoxybenzoyl）delcosine（187a）は，すべてのヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった．
以上の結果から，delcosine C-1位アシル誘導体（159, 161–163, 165, 170, 172, 173, 180）は，delcosine C-1,14位ジアシル誘導体（159a, 161a–163a, 165a, 170a, 170b, 172a, 173a, 180a）より強い細胞毒性がみられ，細胞毒性発現にはC-1位アシル基及びC-14位水酸基が必要と考えられる．誘導体169, 169a及び169bについては，3種の誘導体ともすべてのヒトがん細胞に対して明らかに細胞毒性がみられた．
誘導体において，アシル基上の置換基の種類による細胞毒性の効果の違いがみられた．1,14-ジアシル誘導体及び1-アシル-14-アセチル誘導体のうち，2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl esterを1個又は2個含む誘導体169b及び169aのみが，すべてのヒトがん細胞に対して明らかに細胞毒性がみられた．2個の4-chloro-3-nitrobenzoyl esterを含む誘導体162aは，よい細胞毒性がみられた．同様に，すべてのヒトがん細胞に対して高い細胞毒性がみられたC-1位アシル誘導体は，4-chloro-3-nitro-（162），4-dichloromethyl-（163）及び2,3,4,5,6-pentafluoro-（169）benzoyl esterを含んでいた．Chloro基を含む誘導体162及び163，同様に3,5-dichloro基を含む161は，1個のchloro基のみを含む160又はchloro及びfluoro基を含む165よりよい細胞毒性がみられた．同様に，誘導体169はfluoro基を含む165–168及び170–173より，すべてのヒトがん細胞に対してより強い細胞毒性がみられた．さらに，いくつかの例外を除いて，bromo基（159, 159a），dimethylamino基（164），dimethoxy基（174），trimethoxy基（175），diethoxy基（176），benzyloxy基（177），cyano基（178），methylenedioxy基（179, 180），nitro基（186a, 186b），ethoxy基（187a）を含むbenzoyl ester又はphenylacetyl（181），cinnamoyl（182, 183），1-naphthoyl（184），及びanthraquinone-2-carbonyl（185）esterを含む誘導体は，細胞毒性が弱いかあるいはみられなかった．
3-2-4. Lycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドdelpheline誘導体のヒトがん細胞に対する細胞毒性デルフィニウムパシフィックジャイアントより単離したジテルペノイドアルカロイドdelpheline（7）の6位水酸基にアシル基を導入した20種の誘導体について，4種のヒトがん細胞（A549, DU145, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討し，細胞毒性がみられる誘導体を明らかにした（Fig. 17, Table 4）．110–112,114）
| Alkaloids | IC50 (µM)a) | |||
|---|---|---|---|---|
| A549 | DU145 | KB | KB-VIN | |
| 188 | 14.8±3.8 | 7.4±1.2 | 8.9±2.0 | 8.3±1.6 |
| 189 | >20 | 15.6±5.4 | >20 | 15.0±6.5 |
| 190 | >20 | 17.2±3.3 | >20 | 17.7±3.5 |
| 191 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 192 | >20 | 17.1±11.4 | >20 | 17.4±7.4 |
| 193 | 18.7±6.6 | 20.3±7.1 | 20.1±7.6 | 18.9±5.0 |
| 194 | >20 | 16.6±12.7 | >20 | 17.9±4.2 |
| 195 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 196 | >20 | 12.6±3.0 | 14.9±4.9 | 11.9±3.3 |
| 197 | >20 | >20 | 19.1±4.8 | 20.3±2.7 |
| 198 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 199 | 19.9±10.1 | 16.9±6.7 | 14.6±7.1 | 6.8±5.0 |
| 200 | 10.2±2.6 | 15.1±6.0 | >20 | 9.1±1.5 |
| 201 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 202 | >20 | >20 | >20 | 18.7±5.2 |
| 203 | 20.0±0. 9 | 15.6±2.6 | 14.8±3.3 | 6.5±2.2 |
| 204 | 14.1±2.9 | 13.2±5.7 | 6.8±1.7 | 4.2±1.1 |
| 205 | 16.5±2.2 | 11.3±7.9 | 5.4±1.8 | 4.4±0.8 |
| 206 | >20 | 19.8±4.6 | 12.1±7.8 | 4.7±1.4 |
| 207 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| Paclitaxelb) | 6.4±1.3 | 5.9±1.9 | 6.0±0.8 | 760±22.0 |
a)Values are mean±standard deviation (S.D.). b)Paclitaxel (nM) was used as an experimental control.
6-（4-Chlorobenzoyl）delpheline（188），6-（4-benzyloxybenzoyl）delpheline（204）及び6-（3-fluoro-4-trifluoromethylbenzoyl）delpheline（205）は，4種のヒトがん細胞に対して強い細胞毒性（それぞれ平均IC50 9.8, 9.6, 9.4 µM）がみられた．しかしながら，6-（3-trifluoromethylcinnamoyl）delpheline（200）は，A549細胞に対する細胞毒性活性（IC50 10.2 µM）が誘導体188, 204及び205より明らかに強いが，DU145, KB及びKB-VIN細胞に対する細胞毒性活性は弱かった．6-p-Anisoyldelpheline（191），6-（4-methoxycarbonylbenzoyl）delpheline（195），6-（3,4,5-trimethoxybenzoyl）delpheline（198）及び6-（4-fluorocinnamoyl）delpheline（201）は，4種のすべてのヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．それに対して，6-（4-fluorobenzoyl）delpheline（189），6-（4-nitrobenzoyl）delpheline（190），6-（4-phenylbenzoyl）delpheline（192），6-（4-trifluoromethoxybenzoyl）delpheline（193），6-（4-trifluoromethylthiobenzoyl）delpheline（194），6-（3,5-dinitrobenzoyl）delpheline（197）及び6-（6-trifluoromethylnicotinoyl）delpheline（202）は，わずかに細胞毒性（平均IC50 17.7–19.9 µM）がみられた．
4種のヒトがん細胞の中で，KB-VIN細胞に対する細胞毒性はアシル誘導体204–206［6-（4-fluoro-3-methylbenzoyl）delpheline］（それぞれIC50 4.2, 4.4, 4.7 µM）に強い活性がみられ，続いて，188, 6-（4-trifluoromethylbenzoyl）delpheline（196），6-（3,4,5-trifluorobenzoyl）delpheline（199），200及び6-（4-ethoxybenzoyl）delpheline（203）（それぞれIC50 8.3, 11.9, 6.8, 9.1, 6.5 µM）に活性がみられた．これら活性がみられたすべてのアシル誘導体は，ほかの3種のヒトがん細胞に対する細胞毒性と比較して，KB-VIN細胞に対する細胞毒性が強かった．さらに，アシル誘導体188, 196, 204及び205のKB及びKB-VIN細胞に対する細胞毒性は，同程度の活性（KBのIC50／KB-VINのIC50：それぞれ1.1, 1.3, 1.6, 1.2倍）がみられた．それに対して，アシル誘導体199, 203, 200及び206はKB-VIN細胞に対する強い細胞毒性がみられ，2種のヒトがん細胞の間で2倍以上の選択性（KBのIC50／KB-VINのIC50：それぞれ2.2, 2.3, 2.3, 2.6倍）がみられた．
C-6位のアシル基によりヒトがん細胞に対する細胞毒性は，特徴がみられた．例えば，KB-VIN細胞に対して強い細胞毒性がみられたアシル誘導体は，アシル基にCl（188），F（199, 205, 206），CF3（196, 200, 205），CH3CH2O（203），C6H5CH2O（204）基が含まれている．KB-VIN細胞に対して，アシル誘導体199（F, F, F），205（F, CF3）及び206（F, CH3）は196（CF3）より強い細胞毒性がみられ，189（F）より更に強い細胞毒性がみられた．同様に，アシル誘導体200は，すべてのヒトがん細胞に対する細胞毒性が201及び202より強かった．しかし，C-6位のベンゾイル基にNO2（190），OCH3（191），C6H5（192），OCF3（193），SCF3（194）及びCOOCH3（195）基が含まれている誘導体は，細胞毒性が弱いあるいはほとんどみられなかった．また，7,8-demethylene-6-（3-trifluoromethylbenzoyl）delpheline（207）は，誘導体196と比較して細胞毒性がみられなかったことより，細胞毒性発現には7,8位のメチレンジオキシ基が必要であると考えられる．
3-2-5. C20-型ジテルペノイドアルカロイドのヒトがん細胞に対する細胞毒性オクトリカブトより単離した5種のhetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイド14-hydroxykobusine（59），50） japosubcusine（60），50） 9-hydroxynominine（61），37） ryosenamine（62），38） torokonine（63），37） 2種のvakognavine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドjaposubcumine（64），50） japosubcunine（65）50）及びactaline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドaconicharmine A（70），37）また，テリハブシより単離した4種のhetisine typeジテルペノイドアルカロイドkobusine（9），110） pseudokobusine（10），110） 15-benzoylpseudokobusine（88），110） 15-veratrylpseudokobusine（89）110）及び7種のnapelline type C20-型ジテルペノイドアルカロイドlucidusculine（12），110） dehydrolucidusculine（67），110） dehydroluciculine（68），110） 12-acetyldehydrolucidusculine（102），110） 12-acetyllucidusculine（103），110） 1-acetylluciculine（104），110） flavadine（105），110）更に，7種のnapelline type C20-型ジテルペノイドアルカロイド誘導体1,12,15-triacetylluciculine（108），110） 12-benzoylluciculine（208），110） 12,15-dibenzoylluciculine（209），110） 1,12,15-tribenzoylluciculine（210），110） 12-benzoyllucidsuculine（211），110） 12-anisoylluciculine（212），110） 12-veratroylluciculine（213）110）について（Fig. 18），ヒトがん細胞（A549, DU145, MDA-MB-231, MCF-7, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討したが，いずれのジテルペノイドアルカロイドもヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．
Hetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドpseudokobusine（10）の誘導体について（Fig. 18），ヒトがん細胞（A549, DU145, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討した（Table 5）．110） 6-Benzoylpseudokobusine（91），6-p-nitrobenzoylpseudokobusine（95），15-p-nitrobenzoylpseudokobusine（96），6,15-di-p-nitrobenzoylpseudokobusine（98），15-acetylpseudokobusine（214），11,15-diacetylpseudokobusine（215），6-p-anisoylpseudokobusine（217），6,11-di-p-anisoylpseudokobusine（219），6,15-di-p-anisoylpseudokobusine（220），6,11,15-tri-p-nitrobenzoylpseudokobusine（225），6,11-di-（3-trifluoromethylbenzoyl）pseudokobusine（228），6-cinnamoylpseudokobusine（230），15-cinnamoylpseudokobusine（232），11-pivaloylpseudokobusine（233），11-nicotinoylpseudokobusine（234），15-nicotinoylpseudokobusine（235），11,15-dinicotinoylpseudokobusine（236），15-propionylpseudokobusine（237），11,15-dipropionylpseudokobusine（238），N-benzyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusine（240），N-acetyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusine（241），N,11,15-acetyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusine（242）及びN-cinnamoyl-N,6-seco-6-dehydropseudokobusine（243）は，いずれのヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．
| Alkaloids | IC50 (µM)a) | |||
|---|---|---|---|---|
| A549 | DU145 | KB | KB-VIN | |
| 93 | 19.3±4.5 | 15.3±4.3 | 12.8±1.7 | 10.2±0.9 |
| 214 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 215 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 216 | 8.8±4.5 | 7.6±2.5 | 5.2±1.3 | 6.3±0.6 |
| 217 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 218 | 15.4±3.7 | 13.2±2.0 | 11.1±5.5 | 15.7±1.5 |
| 219 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 220 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 221 | 8.0±5.1 | 15.3±2.9 | 14.9±3.6 | >20 |
| 222 | 16.0±5.5 | 16.9±7.8 | 19.7±3.1 | 14.7±7.0 |
| 223 | 15.2±6.4 | 16.6±7.9 | 18.1±4.3 | 12.2±5.5 |
| 224 | 5.8±0.7 | 7.2±1.9 | 6.4±0.8 | 6.4±1.8 |
| 225 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 226 | 5.0±1.1 | 5.2±1.8 | 5.6±1.2 | 5.6±2.9 |
| 227 | 6.8±0.7 | 7.7±3.8 | 8.9±3.7 | 6.2±1.3 |
| 228 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 229 | 17.9±7.2 | 14.5±7.2 | 15.7±4.1 | 13.9±3.3 |
| 230 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 231 | 8.4±1.7 | 6.5±0.5 | 7.0±1.3 | 6.4±0.9 |
| 232 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 233 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 234 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 235 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 236 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 237 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 238 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 239 | 6.4±1.2 | 6.0±3.3 | 6.6±3.1 | 5.2±1.0 |
| 240 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 241 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 242 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| 243 | >20 | >20 | >20 | >20 |
| Paclitaxelb) | 6.4±1.3 | 5.9±1.9 | 6.0±0.8 | 761±224 |
a)Values are mean±standard deviation (S.D.). b)Paclitaxel (nM) was used as an experimental control.
11,15-Dibenzoylpseudokobusine（216），11-p-nitrobenzoylpseudokobusine（224），11,15-di-（3-nitrobenzoyl）pseudokobusine（226），11-（3-trifluoromethylbenzoyl）pseudokobusine（227），11-cinnamoylpseudokobusine（231）及び11-tritylpseudokobusine（239）は，強い細胞毒性（それぞれ平均IC50 7.0, 6.5, 5.4, 7.4, 7.1, 6.1 µM）がみられた．6,11-Dibenzoylpseudokobusine（93），11-p-anisoylpseudokobusine（218），11-veratroylpseudokobusine（221），6,11-diveratroylpseudokobusine（222），6,15-diveratroylpseudokobusine（223）及び11-（4-trifluoromethylbenzoyl）pseudokobusine（229）は，弱い細胞毒性（それぞれ平均IC50 14.2, 13.9, 14.6, 16.8, 15.5, 15.5 µM）がみられた．誘導体221は，A549細胞には中程度の細胞毒性（IC50 8.0 µM）がみられたが，そのほかの細胞に対して細胞毒性は弱いかあるいは示さなかった．
Pseudokobusineの6位誘導体91, 95, 217, 230, 15位誘導体96, 214, 232, 235, 237及び6, 11, 15位誘導体225は，細胞毒性がみられなかった．それに対して，11位誘導体218, 221, 224, 227, 229, 231, 239, 11, 15位誘導体216, 226及び6, 11位誘導体93, 222は，誘導体215, 219, 233, 234, 238を除いて細胞毒性がみられた．
4種のヒトがん細胞の間で，KB-VIN細胞に対する細胞毒性は誘導体216, 224, 226, 227, 231, 239（それぞれIC50 6.3, 6.4, 5.6, 6.2, 6.4, 5.2 µM）に強い活性がみられ，続いて，誘導体93, 222, 223, 229（それぞれIC50 10.2, 14.7, 12.2, 13.9 µM）に活性がみられた．また，誘導体93, 222, 223, 227, 229はほかの3種のヒトがん細胞に対する細胞毒性と比較して，KB-VIN細胞に対する細胞毒性が強く，KB及びKB-VIN細胞に対する細胞毒性は，2種のヒトがん細胞の間で1.3倍以上の選択性（KBのIC50／KB-VINのIC50：それぞれ1.3, 1.3, 1.5, 1.4, 1.3倍）がみられた．
3-2-7. Hetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドkobusine誘導体のヒトがん細胞に対する細胞毒性Hetisine type C20-型ジテルペノイドアルカロイドkobusine（9）の誘導体について（Fig. 19），ヒトがん細胞（A549, DU145, MDA-MB-231, MCF-7, KB, KB-VIN）に対する細胞毒性を検討した（Table 6）．110,115） Kobusineの11及び15位誘導体のうち，11,15-dibenzoylkobusine（245），11,15-di-（3-methoxybenzoyl）kobusine（247），11,15-di-p-anisoylkobusine（248），11,15-di-（3,4,5-trimethoxybenzoyl）kobusine（249），11,15-di-（4-ethoxybenzoyl）kobusine（250），11,15-di-p-nitrobenzoylkobusine（252），11,15-di-（4-trifluoromethylbenzoyl）kobusine（255），11,15-di-（4-fluorobenzoyl）kobusine（257），11,15-di-（4-fluoro-3-methylbenzoyl）kobusine（258），11,15-di-（3-chloro-4-fluorobenzoyl）kobusine（259），11,15-di-（2,4,5-trifluoro-3-methoxybenzoyl）kobusine（260），11,15-di-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl）kobusine（261），11,15-di-（2-chlorobenzoyl）kobusine（262），11,15-di-（3-chlorobenzoyl）kobusine（263），11,15-di-（4-chlorobenzoyl）kobusine（264），11,15-di-（3,5-dichlorobenzoyl）kobusine（265），11,15-di-（4-chloro-3-nitrobenzoyl）kobusine（266），11,15-di-（4-dichloromethylbenzoyl）kobusine（267）及び11,15-di-（3-trifluoromethylcinnamoyl）kobusine（268）は，強い細胞毒性（平均IC50 4.2–7.8 µM）がみられた．誘導体246［11,15-di-（2-methoxybenzoyl）kobusine］及び251［11,15-di-（3-nitrobenzoyl）kobusine］は，中程度の細胞毒性（それぞれ平均IC50 15.7及び18.8 µM）がみられた．誘導体246はMCF-7及びKB細胞にはよい細胞毒性（それぞれIC50 13.4及び13.0 µM）を示したが，A549, MDA-MB-231及びKB-VIN細胞では細胞毒性が低下した．しかし，11,15-diacetylkobusine（244）は，いずれのヒトがん細胞に対して細胞毒性がみられなかった（IC50 >20 µM）．
| Alkaloids | IC50 (µM)a) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| A549 | DU145 | MDA-MB-231 | MCF-7 | KB | KB-VIN | |
| 244 | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 244b | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 245 | 8.4±1.4 | 9.3±3.0 | — | — | 6.0±0.8 | 7.5±3.7 |
| 245a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 245b | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 246 | 17.0±0.2 | — | 19.0±0.5 | 13.4±1.9 | 13.0±1.3 | 16.1±0.5 |
| 247 | 4.5±0.1 | — | 4.5±0.1 | 4.7±0.1 | 4.7±0.04 | 4.8±0.1 |
| 248 | 6.7±2.4 | 7.1±2.0 | — | — | 5.3±0.3 | 5.2 ±1.2 |
| 248a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 249 | 4.4±0.2 | — | 4.7±0.04 | 4.2±0.01 | 4.2±0.1 | 4.6±0.1 |
| 249a | 19.5±0.6 | — | 21.2±0.02 | 26.9±0.8 | 19.9±0.1 | 28.9±0.2 |
| 249b | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 250 | 4.5±0.1 | — | 4.6±0.1 | 5.2±0.1 | 4.6±0.2 | 5.0±0.04 |
| 250a | 7.8±0.3 | — | 15.9±0.8 | 18.0±0.6 | 8.9±0.5 | 11.2±0.8 |
| 251 | 19.5±1.3 | — | 19.9±0.3 | 18.3±0.7 | 17.4±0.2 | 19.1±0.9 |
| 251a | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 251b | >40 | — | >40 | >40 | >40 | >40 |
| 252 | 6.9±1.7 | 7.0±2.2 | — | — | 5.3±0.60 | 5.5±0.7 |
| 252a | 19.5±3.3 | 15.3±5.6 | — | — | 13.9±2.8 | 17.9±1.8 |
| 252b | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 253a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 254a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 255 | 4.8±0.002 | — | 4.5±0.1 | 4.7±0.02 | 4.6±0.1 | 4.8±0.1 |
| 255a | 18.1±0.3 | — | 19.3±0.03 | 19.6±0.2 | 18.1±0.4 | 20.1±0.4 |
| 256a | 14.1±0.7 | 9.6±2.4 | — | — | 11.7±0.6 | 10.9±0.7 |
| 257 | 8.1±4.7 | 6.8±2.0 | — | — | 5.2±0.6 | 7.1±2.6 |
| 257a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 257b | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| 258 | 4.6±0.1 | — | 4.8±0.02 | 4.9±0.1 | 4.5±0.1 | 4.7±0.2 |
| 258a | 30.0±0.7 | — | 32.1±1.3 | 29.5±0.9 | 27.1±0.2 | 33.2±0.7 |
| 259 | 4.5±0.03 | — | 4.6±0.1 | 4.6±0.1 | 4.4±0.2 | 4.6±0.1 |
| 260 | 4.5±0.1 | — | 5.0±0.1 | 4.6±0.02 | 4.7±0.1 | 4.6±0.03 |
| 260a | 27.9±0.5 | — | 26.8±1.7 | 23.8±0.01 | 28.7±1.7 | 31.1±3.4 |
| 261 | 4.5±0.004 | — | 4.4±0.1 | 4.7±0.1 | 4.5±0.1 | 5.2±0.02 |
| 262 | 5.3±0.1 | — | 6.4±0.4 | 6.3±0.5 | 5.1±0.03 | 5.6±0.1 |
| 263 | 4.4±0.2 | — | 4.7±0.2 | 4.7±0.1 | 4.7±0.1 | 4.6±0.2 |
| 264 | 4.5±0.1 | — | 2.8±0.01 | 5.3±0.2 | 5.1±0.1 | 5.7±0.2 |
| 265 | 4.4±0.001 | — | 4.5±0.3 | 4.5±0.1 | 4.6±0.1 | 4.6±0.04 |
| 265a | 20.4±0.3 | — | 21.0±0.001 | 18.6±0.8 | 21.5±0.1 | 21.0±0.2 |
| 266 | 5.2±0.2 | — | 4.4±0.1 | 5.3±0.5 | 4.8±0.1 | 5.7±0.04 |
| 267 | 4.4±0.1 | — | 4.2±0.1 | 4.5±0.004 | 4.5±0.01 | 4.6±0.2 |
| 268 | 5.5±1.9 | 6.2±3.1 | — | — | 4.1±0.7 | 3.1±1.6 |
| 269a | >20 | >20 | — | — | >20 | >20 |
| Paclitaxelb) | 5.2±0.4 | 5.9±1.9 | 6.7±0.5 | 7.3±0.9 | 5.0±0.2 | 1320±101 |
a)Values are mean±standard deviation (S.D.). b)Paclitaxel (nM) was used as an experimental control.
11位誘導体のうち，11-（4-ethoxybenzoyl）kobusine（250a），11-p-nitrobenzoylkobusine（252a），11-（4-trifluoromethylbenzoyl）kobusine（255a）及び11-（4-trifluoromethoxybenzoyl）kobusine（256a）は，中程度の細胞毒性（それぞれ平均IC50 12.4, 17.1, 19.0及び12.2 µM）がみられた．誘導体250aはA549, KB及びKB-VIN細胞にはよい細胞毒性（それぞれIC50 7.8, 8.9及び11.2 µM）を示したが，MDA-MB-231及びMCF-7細胞では細胞毒性（それぞれIC50 15.9及び18.0 µM）が低下した．誘導体249a［11-（3,4,5-trimethoxybenzoyl）kobusine］，258a［11-（4-fluoro-3-methylbenzoyl）kobusine］，260a［11-（2,4,5-trifluoro-3-methoxybenzoyl）kobusine］及び265a［11-（3,5-dichlorobenzoyl）kobusine］は，弱い細胞毒性（それぞれ平均IC50 23.3, 30.4, 27.7及び20.5 µM）を示した．誘導体245a（11-benzoylkobusine），248a（11-p-anisoylkobusine），251a［11-（3-nitrobenzoyl）kobusine］，253a［11-（2-trifluoromethylbenzoyl）kobusine］，254a［11-（3-trifluoromethylbenzoyl）kobusine］，257a［11-（4-fluorobenzoyl）kobusine］及び269a（11-nicotinoylkobusine）は，細胞毒性を示さなかった．すべての15位誘導体［15-acetylkobusine（244b），15-benzoylkobusine（245b），15-（3,4,5-trimethoxybenzoyl）kobusine（249b），15-（3-nitrobenzoyl）kobusine（251b），15-p-nitrobenzoylkobusine（252b），15-（4-fluorobenzoyl）kobusine（257b）］は，細胞毒性を示さなかった．特に，11及び15位誘導体（245, 247–250, 252, 255, 257–268）は，11位又は15位誘導体（244b, 245a, 245b, 248a–258a, 249b, 251b, 252b, 257b, 260a, 265a, 269a）と比較して，強い細胞毒性を示した．このように，kobusine（9）誘導体の細胞毒性発現には，11及び15位のアシル化が必要である．
誘導体において，アシル基上の置換基の種類による細胞毒性の効果の違いがみられた．11及び15位誘導体において，様々な置換基を有するbenzoyl又はcinnamoyl esters誘導体247–250, 252, 255, 257–268は，すべてのテストしたヒトがん細胞に対して強い細胞毒性を示した．アルコシ基を有するbenzoyl esters誘導体において，247（3-methoxy），248（4-methoxy），249（3,4,5-trimethoxy）及び250（4-ethoxy）は，246（2-methoxy）より強い細胞毒性を示した．誘導体247（3-methoxy）は250（4-ethoxy）より強い細胞毒性を示し，249（3,4,5-trimethoxy）は247（3-methoxy）より強い細胞毒性を示した．また，誘導体252（4-nitro）は251（3-nitro）より強い細胞毒性を示した．さらに，F基を含む誘導体258（4-fluoro-3-methyl），259（3-chloro-4-fluoro），260（2,4,5-trifluoro-3-methoxy）及び261（2,3,4,5,6-pentafluoro）は，1個のF基のみを含む誘導体257（4-fluoro）より強い細胞毒性を示した．同様に，誘導体255（4-trifluoromethylbenzoate）及び268（3-trifluoromethylcinnamate）は，誘導体257（4-fluoro）より強い細胞毒性を示した．F基を含む誘導体（255, 258–261及び268：平均IC50 4.9 µM）は，アルコシ基を含む誘導体（247–250：平均IC50 7.1 µM）及びニトロ基を含む誘導体（251, 252及び266：平均IC50 9.9 µM）より強い細胞毒性を示した．さらに，Cl基を含む誘導体263（3-chloro），264（4-chloro），265（3,5-dichloro），266（4-chloro-3-nitro）及び267（4-dichloromethyl）は，262（2-chloro）より強い細胞毒性を示した．誘導体263（3-chloro）及び265（3,5-dichloro）は，264（4-chloro）及び266（4-chloro-3-nitro）より強い細胞毒性を示した．
18種の11及び15位誘導体（247–250, 252, 255, 257–268）のうち，13種の誘導体（247, 249, 250, 255, 258–261, 263–267）は，MDA-MB-231細胞に対して強い細胞毒性（IC50 2.8–5.0 µM）を示した．特に，誘導体264（4-chlorobenzoate: IC50 2.8 µM）は，最も強い細胞毒性を示した．さらに，同じ13種の誘導体（247, 249, 250, 255, 258–261, 263–267）は，MCF-7細胞に対して強い細胞毒性（IC50 4.2–5.5 µM）を示した．同じような強さ（IC50 4.4–5.5 µM）で15種の誘導体（247, 249, 250, 255, 258–269）は，A549細胞に対して細胞毒性を示した．さらに，誘導体247–250, 252, 255, 257–268は，KB細胞に対して強い細胞毒性（IC50 4.1–5.3 µM）を示した．また，誘導体247–250, 252, 255, 258–268は，KB-VIN細胞に対して強い細胞毒性（IC50 3.1–5.7 µM）を示した．特に，誘導体268（3-trifluoromethylcinnamate: IC50 3.1 µM）は，最も強い細胞毒性を示した．
3-2-8. Lycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドdelcosine及びdelpheline誘導体の多剤耐性がん細胞に対する化学療法増感効果Lycoctonine type C19-型ジテルペノイドアルカロイドdelcosine（6）及びdelpheline（7）の誘導体（182, 186a, 187a, 190–198, 201, 202）（Fig. 20）は，多剤耐性がん細胞（KB-VIN）に対する細胞毒性IC50値が11.9–20 µM又は20 µM以上を示した．しかし，多剤耐性がん細胞［P-glycoprotein（P-gp）-overexpressing multidrug-registant（MDR）KB subline（KB-VIN）］に対してパクリタキセル（paclitaxel: PXL）やビンクリスチン（vincristine: VIN），ドキソルビシン（doxorubicin: DOX）の化学療法剤と同時に添加（5 µM）すると，これら化学療法剤の抗腫瘍活性を増強させる効果を検討した（Table 7）．116）
| +Alkaloids | KB-VIN IC50 (µM)a) | KB-VINb) IC50 (RFc)) | Intracellular Calcein Accumulation (fold)d) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| VIN (nM) | PXL (nM) | DOX (nM) | |||
| DMSO | — | 2861±432 | 2312±261 | 2385±615 | 1.0 |
| 182 | 19.5±8.2 | 25.0±0.0 (14)e) | 24.9±1.5 (29)e) | N/Df) | N/Df) |
| 186a | >20 | 128.6±15.6 (22) | 77.1±2.3 (30) | 155.8±8.0 (15) | 1.7 |
| 187a | >20 | 5.44±0.66 (63)e) | 10.3±0.19 (70)e) | N/Df) | N/Df) |
| 190 | 17.7±3.5 | 59.4±9.0 (48) | 56.0±6.4 (41) | 218.5±28.5 (11) | 1.5 |
| 191 | >20 | 32.4±8.7 (88) | 56.0±2.6 (41) | 172.4±37.5 (14) | 2.8 |
| 192 | 17.4±7.4 | 40.9±11.1 (70) | 50.3±2.1 (46) | 120.6±27.5 (20) | 2.5 |
| 193 | 18.9±5.0 | 42.8±6.1 (67) | 55.3±4.4 (42) | 116.6±39.2 (20) | 1.3 |
| 194 | 17.9±4.2 | 24.6±1.4 (116) | 38.7±2.9 (60) | 172.2±46.2 (14) | 2.8 |
| 195 | >20 | 55.9±6.4 (51) | 47.5±6.0 (49) | 470.5±81.7 (5) | 2.0 |
| 196 | 11.9±3.3 | 20.2±4.1 (142) | 53.6±5.5 (43) | 224.9±14.4 (11) | 1.7 |
| 197 | 20.3±2.7 | 63.2±9.2 (45) | 63.3±2.2 (37) | 380.9±63.7 (6) | 2.4 |
| 198 | >20 | 11.3±3.0 (253) | 48.6±3.9 (48) | 145.2±34.6 (16) | 5.3 |
| 201 | >20 | 56.0±7.8 (51) | 60.4±1.3 (38) | 369.5±61.2 (6) | 1.5 |
| 202 | 18.7±5.2 | 53.4±5.7 (54) | 51.9±3.1 (45) | 283.1±56.6 (8) | 1.4 |
| VER (5 µM) | N/Df) | 12.2±0.16 (28)e) | 26.7±2.2 (27)e) | N/Df) | 4.1 |
| VER (10 µM) | >10g) | 41.8±13.4 (68) | 54.5±6.9 (42) | 158.9±36.2 (15) | 6.7 |
| CSA (2 µM) | N/Df) | N/Df) | 49.4±6.8 (47) | N/Df) | N/Df) |
| CSA (3 µM) | N/Df) | N/Df) | 29.8±6.3 (78) | N/Df) | 7.9 |
| CSA (5 µM) | N/Df) | N/Df) | N/Df) | N/Df) | 11.0 |
| CSA (10 µM) | <10g) | N/Df) | N/Df) | N/Df) | 12.8 |
a)The IC50 values of alkaloids against KB-VIN were expressed with mean±S.D. of three independent experiments. b)The IC50 values of VIN, PXL, and DOX against KB-VIN cells were determined in the presence of 5 µM or 3 µM alkaloid, respectively and expressed with mean±S.D. of three independent experiments with duplication. c)RF, The reversal fold values were calculated as: reversal fold=IC50 (anticancer drug alone)/IC50 (anticancer drug+test compound). d)Fold accumulation of Calcein in KB-VIN cells by 5 µM alkaloid. e)IC50: VIN alone=342±23.1 nM, PXL alone=721±5.0 nM for these experiments. f)N/D: Not Determined. g)IC50 of P-gp competitive inhibitor Verapamil (VER) or P-gp modulator Cyclosporin A (CSA) against KB-VIN was over 10 µM or 6.8 µM, respectively. NOTE: IC50 of VIN, PXL, or DOX against KB was 4.4 nM, 6.4 nM, or 113 nM, respectively.
ビンクリスチンに対するジテルペノイドアルカロイド誘導体の増感効果について，誘導体187a, 190–198, 201, 202は，ヴェラパミル（verapamil: VER）を5 µM添加した場合よりよい効果を示した．特に，誘導体194, 196及び198はそれぞれ116倍，142倍及び253倍のビンクリスチンの増感効果がみられ，それはヴェラパミルを5 µM添加した場合より，それぞれ4.1倍，5.1倍及び9倍の効果がみられた．さらに，誘導体187a, 191, 192及び193はそれぞれ63倍，88倍，70倍及び67倍のビンクリスチンの増感効果がみられ，それはヴェラパミルを5 µM添加した場合より，それぞれ2.3倍，3.1倍，2.5倍及び2.4倍の効果がみられた．また，誘導体190, 195, 197, 201及び202はそれぞれ48倍，51倍，45倍，51倍及び54倍のビンクリスチンの増感効果がみられ，それはヴェラパミルを5 µM添加した場合より1.6–1.9倍の効果がみられた．パクリタキセルに対するテストしたすべての誘導体の増感効果は，ヴェラパミルを5 µM添加した場合より1.1–2.6倍の効果がみられた．特に，誘導体187a及び194はKB-VIN細胞に対するパクリタキセルの細胞毒性を，それぞれ70倍及び60倍増加させた．さらに，誘導体190–193, 195–198, 201及び202は37倍以上の増感効果がみられ，それはベラパミルを5 µM添加した場合より1.4–1.8倍の効果がみられた．誘導体182及び186aを除いて，テストした誘導体はビンクリスチンに対するよい増感効果を示したが，しかし，ドキソルビシンに対する効果はパクリタキセルと比較して弱かった．
Delpheline誘導体（190–198, 201, 202）の構造活性相関をビンクリスチン及びパクリタキセルにおける増感効果から考察すると，benzoyl誘導体（190–198）はcinnamoyl（201）及びnicotinoyl（202）誘導体より効果がみられた．Benzoyl誘導体のうち，パラ位にOCH3基のような電子供与基を有する誘導体191及び198は増感効果がみられ，メタ位にOCH3基が更に置換した誘導体198は効果が増加した．さらに，パラ位にC6H5基（192），OCF3基（193）及びSCF3基（194）とメタ位にCF3基（196）を有する誘導体は増感効果がみられた．増感効果は，3,4,5-tri-OCH3基（198）>3-CF3基（196）>4-SCF3基（194）>4-OCH3基（191）>4-C6H5基（192）>4-OCF3基（193）の順に効果がみられた．ビンクリスチン及びパクリタキセルにおける増感効果について，3-trifluoromethylbenzoyl（196）及び3,4,5-trimethoxybenzoyl誘導体（198）はビンクリスチンに対して最も効果がみられ，また，4-trifluoromethylthiobenzoyl誘導体（194）はパクリタキセルに対して最も効果がみられた．さらに，誘導体194は，ビンクリスチンに対して4-trifluoromethoxylbenzoyl誘導体（193）より強い効果がみられた．対照的に，テストした誘導体のドキソルビシンに対する増感効果は，ビンクリスチン及びパクリタキセルに対する増感効果より弱かった．しかし，誘導体192及び193のドキソルビシンに対する増感効果は，中程度の効果がみられた．
これらジテルペノイドアルカロイド誘導体の多剤耐性がん細胞に対する化学療法増感効果はP-gpの薬物排出活性を阻害することにより，細胞内の化学療法剤の蓄積と高濃度となることによるものと考えられる．KB-VIN細胞におけるP-gpの薬物排出活性に対するジテルペノイドアルカロイド誘導体の阻害効果を確認するために，細胞透過性蛍光P-gpの基質としてカルセイン–AMを用いて，5 µMの誘導体186a, 190–198, 201, 202存在下でP-gp基質の細胞内蓄積を測定した（Table 1）．カルセインの細胞内蓄積はヴェラパミル又はジテルペノイドアルカロイド誘導体の存在下でみられ，P-gpによるカルセインの排出はジテルペノイドアルカロイド誘導体により阻害されたと考えられる．5 µMのヴェラパミルと比較して，誘導体186a, 190–197, 201及び202はわずかに弱かったが，誘導体198は5.3倍の強い効果がみられた．誘導体198は特徴的にビンクリスチンの効果を増強するため，ビンクリスチン代謝酵素117）であるCYP3A5の誘導体198による阻害をもたらした可能性がある．
上述した通り，これまでに北海道に自生するトリカブト（Aconitum sp.）やDelphinium植物のジテルペノイドアルカロイドの探索により，新規ジテルペノイドアルカロイドを含め多くのジテルペノイドアルカロイドを単離した．それら天然物やその誘導体の薬理活性，特にヒトがん細胞に対する細胞毒性を検討し，数μMオーダーではあるが細胞毒性を示すジテルペノイドアルカロイドを見い出した．また，多剤耐性がん細胞に対して細胞毒性を示さないジテルペノイドアルカロイドを化学療法剤と併用すると，化学療法剤の抗腫瘍活性を増強させる効果を見い出した．これらの知見が，今後，天然化合物の探索や天然化合物の新薬開発の一助となることを期待したい．
本研究をご指導頂きました故 網谷 孝先生（元北海道薬科大学）を始めとする多くの先生方，並びに博士（薬学）の取得におきましては川原徳夫先生（元北海道薬科大学）に心から深く感謝申し上げます．また，共同研究を進めて頂いた故 Kuo-Hsiung Lee先生（ノースカロライナ大学チャペルヒル校）を始めとする多くの先生方に心から感謝申し上げます．本稿には記載しきれなかった研究の共同研究者の方にはお詫び申し上げます．そして，なによりともに研究を進めてきた多くの大学院生，学部生に深く感謝申し上げます．また，本研究の遂行するにあたり，北海道，ノーステック財団，元北海道薬科大学（現北海道科学大学）から研究助成を受けました．ここに感謝申し上げます．
開示すべき利益相反はない．
本総説は，2022年度退職にあたり在職中の業績を中心に記述されたものである．
