The Challenge of Cardiotoxicity Prediction Using In vitro Assay Method

Summary

Non-clinical pharmacological safety studies are conducted using cells and animals to ensure the safety of pharmaceuticals in humans. Following these studies, drug candidates are administered to humans during clinical trials. Safety must be sufficiently confirmed in non-clinical studies to ensure that test participants suffer no adverse health effects. However, due to species differences, low ability to extrapolate from in vitro to in vivo evaluation methods, and other problems, health hazards may unfortunately still occur. Therefore, sophisticated in vitro evaluation systems using human cells are actively being pursued. The main challenge remains the lack of a reliable methodology for extrapolating in vitro results to in vivo settings. We have attempted to extract parameters that can be predictably translated from in vitro [contractile evaluation in three-dimensional (3D) heart tissue] to in vivo (guinea pig echocardiography) conditions, using cardiac contractile dysfunction induced by anticancer drugs as an example. In this review, we introduce the in vitro methods developed to date to evaluate this cardiac contractile dysfunction, analyze the factors enabling highly accurate prediction of torsades de pointes in humans based on past proarrhythmic risk prediction methods using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, and apply them to evaluate cardiac contractile dysfunction caused by anticancer drugs using three-dimensional heart tissue. We also introduce the proposed strategy for this evaluation method in this section.

1. はじめに

医薬品のヒトへの安全性を確保するために，非臨床試験の中の安全性薬理試験では細胞や動物を用いた試験を行っている．一方で臨床試験では医薬品候補物質を実際にヒトに投与する試験を行う．臨床試験において，被検者への健康影響が出ないよう十分に非臨床試験で安全性を確認しているが，種差や評価法の低いin vivo外挿性の問題等で不運にも健康被害が発生してしまうケースもある．そのため，ヒトの細胞を用いた高度化されたin vitro評価系の開発が盛んに行われている．しかしながら，一番の問題は，in vitro評価系で得られた結果をin vivoに外挿するための方法論が確立されていないことである．そこで，筆者は抗がん剤等による心収縮障害を1つの例として，in vitro（3次元心筋組織による収縮評価）からin vivo（モルモット心エコー計測）へ予測性高くトランスレーションできるパラメーターの抽出を試みた．

本稿では，これまでに開発されている抗がん剤等によるin vitro心収縮障害評価法を紹介するとともに，過去にヒトinduced pluripotent stem（iPS）心筋細胞を用いた催不整脈リスク予測法において，ヒトにおけるtorsades de pointes（TdP）を高い精度で予測できた要因を分析し，三次元心筋組織を用いた抗がん剤等による心収縮障害評価へ応用することとした．その戦略について紹介したい．

2. がん治療関連心筋障害

がん患者は高齢化に伴って漸増傾向となっているものの，^1,2）血液マーカーや健康診断等による早期発見，抗がん剤をはじめとした治療法の発展や進歩によりがん患者の予後は飛躍的に改善している．^3,4）特に抗がん剤は，1997年から2000年にかけてヒト成長因子受容体2（HER2）に対する抗体医薬であるトラスツズマブ，慢性骨髄性白血病に対するBCR-ABLチロシンキナーゼ阻害薬であるイマチニブ，CD20抗原に対する抗体医薬であるリツキシマブ等の分子標的薬が相ついで承認されたことにより，進行がんを含めた，多くのがん患者の生存期間延長に奏功した．^5–7）

一方で，抗がん剤治療中に患者が心筋障害の症状を呈する報告が散見されるようになり，がんを経験したがんサバイバーの死因として心不全が多いことも報告されている．^8–11）がん治療に伴う心血管毒性のうち，心筋障害及び心不全について，を「がん治療関連心筋障害（cancer therapeutics-related cardiac dysfunction: CTRCD）」という．最も懸念すべき心血管合併症であり，心不全症状の有無によらず左室駆出率が低下する．既に多くの抗がん剤でCTRCDが発生することが知られており，^12）その代表格がアントラサイクリン系抗がん剤であるドキソルビシンと既出のトラスツズマブである．

ドキソルビシンは，様々な抗がん剤が開発されている現在でも，全身性のがんの治療に適用される第一選択薬であり，使用頻度が非常に高い．ドキソルビシンによる心毒性の病態には酸化ストレスが深く係わっているとの報告があるが，^13）それ以外にもDNA複製やRNA転写の阻害等の様々な作用部位が存在するため発症機序の全容は明らかとなっていない．アントラサイクリン系抗がん剤の特に注意が必要な点として，蓄積性と用量依存性が挙げられる．ドキソルビシンは，500 mg/m²が累積上限とされており，250 mg/m²以上で心機能障害のハイリスクとなる．実際に，ドキソルビシンの濃度によるCTRCDの発生頻度は，400 mg/m²で3–5%，550 mg/m²で7–26%，700 mg/m²で18–48%と報告されている．^12）

トラスツズマブはHER2陽性の乳がん，胃がん，結腸・直腸がんに対して適用される．HER2は心筋細胞膜上にも発現しており，心筋細胞の保護等に関与している．このため，トラスツズマブによるHER2の阻害は，心筋細胞内において活性酸素を蓄積させ，アポトーシスを亢進させることにより，心毒性を発症させることが報告されている．^14）トラスツズマブによる心毒性は無症状であることが多く，用量非依存的であり，心毒性発症後に休薬することで改善を認める．トラスツズマブ単剤でも心毒性を発症するが，アントラサイクリン系抗がん剤との併用により心不全症状の発生頻度は顕著に上昇する．^15）

3. 抗がん剤の非臨床安全性評価

優れた医薬品の患者への迅速な提供及び国際的な研究開発の促進を図ることを目的として，承認審査資料の国際的なハーモナイゼーション推進を行うために日米EU医薬品規制調和国際会議（The International Council for Harmonisation: ICH）が1990年に設立された．ICHでの合意に基づき2009年10月に「抗悪性腫瘍薬の非臨床評価に関するガイドライン」（ICH S9）が制定された．^16）

このガイドラインでは，治療方法の選択肢が限られた進行がん患者のための抗がん剤の開発における非臨床評価について言及しており，抗がん剤の開発を促進・加速し，かつ患者を不必要な副作用から守ることを目的としている．

非臨床評価のために必要な試験として，①薬効薬理，②安全性薬理，③薬物動態，④一般毒性，⑤生殖発生毒性，⑥遺伝毒性，⑦がん原性，⑧免疫毒性，⑨光安全性がある．このうち，②安全性薬理試験としては，生命維持に重要な器官（心血管系，呼吸系及び中枢神経系）の機能に及ぼす影響について，初回臨床試験開始前に評価しておく必要があるとされ，抗がん剤投与後の詳細な一般状態の観察や非げっ歯類における適切な心電図測定を行えば十分と記載されている．個々の製薬会社によって対応は異なっていると予想するが，長期的な投与により生じる副作用の可能性については考慮されていないのが実情である．

抗がん剤の初回臨床試験では，通常，進行がん患者を対象として実施されることから，安全性だけでなく有効性も考慮して初回投与量を設定しなければならない．国内の多くの製薬会社では，げっ歯類の10%に重篤な毒性を発現した投与量（STD₁₀）や非げっ歯類に重篤かつ非可逆的な毒性を発現しない最高投与量（highest non-severely toxic dose: HNSTD）等の安全性の指標と薬効量・薬効曝露量などの有効性の指標が用いられている．加えて，先ほど挙げた9つの非臨床試験の半分以上において動物を用いた試験が適用されている．近年開発されている抗がん剤の多くがヒト特異的な分子標的薬であることを考慮すると，種差が有効性や安全性・毒性評価に影響を及ぼすことも懸念される．

4. In vitro収縮評価系の現状

上記のような理由から，筆者を含めた多くのアカデミア研究者や製薬会社等がヒトiPS細胞由来分化心筋細胞（human iPS cell-derived cardiomyocytes: hiPS-CMs）を用いた抗がん剤による心毒性のin vitro収縮評価系開発に取り組んでいる．既に多くのプラットフォームが報告されている^17）が，それらの中でドキソルビシン等の抗がん剤を用いて評価を実施している例を中心に紹介したい．

4-1. Motion field imaging

平面状に播種された心筋シートが拍動する動画から心筋細胞の収縮特性を定量的に評価する手法である．心筋細胞の動きベクトルを正確に捉えることが可能な高性能カメラにて拍動動画を得ることができれば，非侵襲的に収縮関連パラメーターを算出できる．主にSI8000（2024年9月ソニー株式会社からエルピクセル株式会社へ継承）というアルゴリズムを用いた，動きベクトル検出法の報告が多い．

Sakamotoらは，心筋シートに対して0.1 µMドキソルビシンを投与し，投与3日目には収縮速度及び平均変形距離，収縮弛緩ピーク間隔の3パラメーターで溶媒の0.05% DMSOよりも有意に低下することを見い出した．ドキソルビシン投与8日目には弛緩速度も0.05% DMSOに比べて低下することを見い出した．一方で，心毒性を示さない1 µMエルロチニブでは，いずれのパラメーターも投与8日目まで0.05% DMSOと同等の値を示した．8日目まで観察することにより，0.1 µMドキソルビシンによるパラメーターの異常値が多く検出できたことから識別力が向上したと主張している．^18）

一方で，Kopljarらは，ドキソルビシンを含む作用機序の異なる3種類の抗がん剤を72時間曝露し，motion field imaging，バイオマーカー放出及び遺伝子発現を同時に評価することにより，多様な慢性薬物誘発性心筋障害メカニズムを検出できることを示した．^19）

4-2. インピーダンス

生体に微弱な電流を流して，体内抵抗値（インピーダンス）を求め，非侵襲的かつ簡便に身体の細胞内外水分量，筋肉量，脂肪量などを高い精度と再現性をもって測定可能なのが生体電気インピーダンス法である．一般的には，体組成計に応用されている技術である．これをhiPS-CMsに対して応用したプラットフォームがCardioEXcyte96（Nanion社），xCELLigence RTCA CardioECR（Agilent社）やMaestro Pro, Edge等（Axion Biosystems社）に搭載されている．各機器専用のプレートにはインピーダンス測定用の電極が埋め込まれており，心筋細胞の収縮による形態変化を電気抵抗値の変化によって評価することが可能である．いずれの機器も細胞外電位を同時に測定可能である．心筋細胞の収縮に変化を与える陰性対照を含む49種類の化合物について，hiPS-CMインピーダンス，ラット心筋細胞インピーダンス，イヌ心筋細胞サルコメア短縮を調べた論文では，ドキソルビシンの適用でいずれの標本も収縮を抑制する反応が得られている．^20）

4-3. Engineered heart tissue（EHT)

hiPS-CMs単独あるいは間質細胞や線維芽細胞とhiPS-CMs混合の細胞懸濁液をマトリゲル／コラーゲンあるいはフィブリノーゲン／トロンビンを用いてゲル化し，polydimethylpolysiloxane（PDMS）製等の伸縮性を有するシリコンラック上に人工的に製造したものをEHTという．比較的長期間（3週間–）培養することによりすべての細胞が電気的に同期し，1つの心筋組織として収縮が観察可能である．EHTが拍動する動画を取得し，種々の方法により動画から収縮波形を抽出して収縮特性を評価可能である．筆者のグループを含めたいくつかの研究グループでドキソルビシンによる収縮の応答性を評価しており，3–28日間のドキソルビシンの持続的曝露により収縮抑制が観察されている．^21–24）

上記のようにhiPS-CMsを用いたin vitro収縮評価系プラットフォームが開発されているが，いずれもドキソルビシンの投与濃度／血中濃度や投与期間は臨床に即した条件ではない．また，in vitro評価系で得られた結果をin vivoの結果に橋渡しする方法が見い出されておらず，評価系としての妥当性は検証されていないのが現状と考える．そこで筆者は，hiPS-CMsを用いたin vitro収縮評価法について，in vitroからin vivoを外挿する（in vitro to in vivo extrapolation: IVIVE）方法論の確立を行う必要があると考えた．

5. In vivoとの橋渡しの重要性—催不整脈リスク予測を例に—

筆者は，hiPS-CMsを用いた多点電極アレイ（microelectrode array: MEA）評価において，医薬品による催不整脈リスク予測法を開発し，80%以上の精度でヒトのTdPデータベース（CredibleMeds）と合致することを見い出した．^25,26）また，国際的にも催不整脈リスク予測評価におけるhIPS-CMsの有用性が証明され，^27） ICH S7Bガイドラインのフォローアップ試験に導入されるに至った．^28）このhiPS-CMsを用いた催不整脈リスク予測評価法は，安全性薬理評価における世界で初めてのIVIVEの実例と捉えることができる．

上記のように高精度なIVIVEが実践できた要因として，MEA評価におけるパラメーターの1つである細胞外電位間隔がヒト心電図におけるQT間隔に相関することが明らかとなっていたこと，そしてTdPのリスク要因となる心筋細胞での活動電位波形における早期後脱分極がMEA評価における細胞外電位波形の変化として捉えることができていたことが挙げられる．^29,30） IVIVEを実践するためには，つまりin vitroデータとin vivoデータの橋渡しをするには，両者の間で相関関係にあるパラメーターの同定が必要となるとの考えに至った．

6. IVIVEとヒト細胞資源の活用による安全性評価技術のヒト予測性向上

筆者は，3次元心筋組織であるEHTを作製して，ヒトiPS-CMsを用いた抗がん剤等によるヒト外挿性の高いin vitro心収縮障害評価法の開発を進めてきた．^21）ヒトへの外挿性を向上させること，及び評価系の妥当性を検証するためには，上記のようにin vivoパラメーターと相関関係を有するin vitroパラメーターの特定が必要であるとの戦略の下，以下のように研究を進めてきた（Fig. 1）．

Fig. 1. Strategy for IVIVE

Strategy for in vitro (contractile evaluation in three-dimensional heart tissue) to in vivo (guinea pig echocardiography) extrapolation in cardiotoxicity.

6-1. 共通化合物の選択

IVIVE方法論を確立するため，抗がん剤を用いて進める前に心筋収縮プロファイルを確実に変化させることが明らかとなっている化合物（ドブタミン）を用いた．

6-2. In vivoデータの取得

抗がん剤治療の際，心エコー図計測にて心筋収縮障害を評価することが一般的であるためin vivoデータについては，心エコー図計測による各種パラメーターを得ることとした．動物種については，ヒトで実施するのが理想的であったが，倫理申請等の時間的な制約によりげっ歯類の中でも心臓プロファイルが比較的ヒトに近いモルモットを用いて実施することとした．^31）

6-3. In vitroデータの取得

「4. In vitro収縮評価系の現状」に記載の通り，hiPS-CMsを用いて3次元心筋組織を作製し，収縮評価により拍動動画を得た．SI8000を含む種々の動画解析ツールを使用して拍動動画から収縮パラメーターを算出した．

6-4. IVIVE

In vitroデータ（18パラメーター，Table 1）とin vivoデータ（25パラメーター，Table 2）の中で相関関係にあるパラメーターを特定するため各々のデータについて標準化によるスケーリング処理を行い，クラスター分析を実施した．これにより，in vivoパラメーターのみのクラスター，in vitroパラメーターのみのクラスター及びin vivoとin vitroパラメーターの両方が含まれたクラスターが複数抽出された（Fig. 2）．in vivoとin vitroパラメーターの両方が含まれたクラスターが，つまりはin vivoとin vitroの橋渡しが可能なパラメーターであると考えることができる．なお，クラスター分析は東北工業大学の鈴木郁郎教授及び石橋勇人助教との共同研究により実施した．

Table 1. In vitro 18 Parameters

Parameter
Beating rate
Contraction velocity
Relaxation velocity
Contraction-end velocity
Acceleration
Contraction deformation distance
Relaxation deformation distance
Contraction-relaxation deformation distance
Contraction duration
Relaxation duration
Contraction-relaxation duration
Contraction-contraction peak interval
Contraction-relaxation peak interval
Object long length
Delta object long length
fpeakMax
fslopeMax
fslopeMin

Table 2. In vivo 25 Parameters

Parameter	Unit	Parameter	Unit
IVC Diam	mm	Stroke Volume	mL
E’	mm/s	Ejection Fraction	%
IVCT	ms	Fractional Shortening	%
IVRT	ms	Cardiac Output	mL/min
MV E	mm/s	LV Mass	mg
MV ET	ms	LV Mass Cor	mg
MV E/E’	none	LVAW; s	mm
Ao Sinus	mm	LVAW; d	mm
Heart rate	BPM	LVPW; s	mm
Diameter; s	mm	LVPW; d	mm
Diameter; d	mm	GLS	%
Volume; s	mL	Tei index	none
Volume; d	mL

Fig. 2. Cluster Analysis Results

Results of cluster analysis with 18 in vitro parameters and 25 in vivo parameters.

7. おわりに

本稿において，抗がん剤による心毒性，特に心収縮障害をin vitro評価系で検出するためのプラットフォームを紹介した．In vitro収縮評価法プラットフォームは種々開発されているが，いずれもin vivoとの相関性検証は行われておらず，評価系としての妥当性が証明されていないものと考えられる．過去に行ったhiPS-CMsを用いた催不整脈リスク予測の事例を考慮すると，ヒト外挿性向上のためにはin vivoとin vitroで相関するパラメーターを見い出すことが最優先課題と考え，その方法論を基にIVIVEの確立を目指した．「6. IVIVEとヒト細胞資源の活用による安全性評価技術のヒト予測性向上」に記したように，in vivoパラメーターとin vitroパラメーターを使用してクラスター分析を行ったところ，in vivoとin vitroパラメーターの両方が含まれたクラスター，つまりin vivoとin vitroの橋渡しが可能なパラメーターが抽出された．しかしながら，現段階では複数のクラスターが存在していること，それらのクラスターに含まれるパラメーターがin vivo，in vitroともに複数ずつあることからクラスター分析の精査が必要であると思われる．また，作用機序の異なる薬剤を用いた場合に，同じパラメーターセットが抽出されてくるのか，異なるものが抽出されてくるのかについても今後検討しなければならない．最終的な到達目標はヒトでの抗がん剤投与により生じる心収縮障害をin vitro評価系で検出することであるため，ヒト心エコー図計測データが必須である．これは，名古屋市立大学医学部循環器内科の瀬尾由広教授，岡田　恒医師との共同研究により抗がん剤投与患者の心エコー図計測データの収集を開始している．今後，より多くの化合物によりIVIVEの検証がなされれば，抗がん剤の開発時にある程度の心収縮障害を予測することが可能となり，臨床試験被検者や抗がん剤治療を行っている患者の安全性が保たれることが期待される．

謝辞

本稿で紹介した研究内容は国立研究開発法人日本医療研究開発機構（Japan Agency for Medical Research and Development: AMED）「創薬基盤推進研究事業：IVIVEとヒト細胞試験を活用による安全性評価技術のヒト予測性向上」（課題番号：22ak0101187）からの助成を受けて行ったものである．IVIVEの実施にあたり，東北工業大学の鈴木郁郎教授，石橋勇人助教の御尽力に深謝いたします．

利益相反

開示すべき利益相反はない．

Notes

本総説は，日本薬学会第144年会シンポジウムS30で発表した内容を中心に記述したものである．

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