LM1010, a high-performance liquid chromatography system for therapeutic drug monitoring (TDM) of various agents in clinical practice, is currently approved in Japan. Unlike conventional systems, LM1010 can rapidly measure clinical samples, and data analysis is based on the absolute calibration curve method and fully automated. However, the analytical performance of the LM1010 for the measurement of serum concentrations of linezolid (LZD) has not yet been evaluated. In this study, we aimed to evaluate the analytical performance of LM1010 and confirm the long-term stability of LZD at −30°C. One hundred forty-eight serum samples were collected from 25 patients (17 men and 8 women) who received LZD. Serum concentrations of LZD were measured using LM1010 and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Three LM1010 instruments were used to confirm the differences in the measured values. A Passing–Bablok regression analysis demonstrated a strong correlation between LM1010 and LC-MS/MS (r=0.991), and comparable results were observed among the three LM1010 instruments (r=0.982–0.998). Bland–Altman analyses revealed that the average difference between LM1010 and LC-MS/MS methods was 1.7%, and similar results were observed among the three LM1010 instruments. The long-term stability of serum LZD in samples stored at −30°C for 48 weeks was also confirmed. These results suggest that LM1010 can be used for TDM of LZD in clinical practice.
オキサゾリジノン系抗菌薬のリネゾリド（linezolid: LZD）はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA）やバンコマイシン耐性Enterococcus faecium感染症などに適応を有する薬剤である．LZDは細菌リボソーム50Sサブユニットとの特異的結合による機能性70S開始複合体形成の阻害により，細胞のタンパク合成を阻害することで抗菌活性を発揮する．1） MRSA肺炎の治療においてはバンコマイシンより高い治療成績が報告されており，2–4）近年は難治性抗酸菌感染症に対する治療薬としても用いられている．5,6）一方で，高頻度で発生する副作用が問題となっており，LZD投与患者の30%以上で血小板減少が，2.8–47.3%で貧血が発現するほか，長期投与では視神経障害や末梢神経障害の発現も報告されている．7–14）特に血小板減少は血中LZD濃度に依存して発現することが報告されており，1,15）近年ではトラフ濃度の上限値として7–8 µg/mLを目標とした治療薬物モニタリング（therapeutic drug monitoring: TDM）を行うことで，その発現頻度を抑制できる可能性が報告されている．16–18）血中LZD濃度の測定は高速液体クロマトグラフ（HPLC）や高速液体クロマトグラフ-質量分析計（LC-MS/MS）を用いて実施されているが，15–17,19）煩雑かつ熟練した手技を要するため一般の医療施設でこれらを用いることは困難であり，TDM実施の阻害要因になっている．
LM1010高速液体クロマトグラフ（LM1010）（株式会社日立ハイテクサイエンス，東京）は，絶対検量線法によるHPLC法を測定原理とし，測定ピークの自動解析機能を有する医療機器である．本機器は，簡便な検体処理及び測定手技による医療施設内における短時間での血中薬物濃度測定が可能であり，日常診療においてボリコナゾール等のTDMへの応用が期待されている．20）近年，LM1010による血中LZD濃度測定法が日立ハイテクサイエンス社より新規に上市され高い利便性が期待されているが，臨床検体を用いた既存法との相関は十分に示されていない．また，LM1010は絶対検量線法を測定原理としているため，異なる施設での測定において，測定者の手技の違いが測定結果に影響をおよぼす可能性も考えられる．
そこで，本研究では血清中LZD濃度測定におけるLM1010の性能評価を目的として，LC-MS/MS法との測定値の比較，異なる3施設に設置されたLM1010による測定値の機台間差を検討した．また，凍結保存条件下でのLZDの長期保存安定性を評価したので報告する．
本研究では筑波大学附属病院及び筑波メディカルセンター病院において，2023年6月から2024年6月の間にLZDが投与され，検体収集に対して書面同意が得られた患者を対象とした前向き観察研究を実施した．日常診療で採血した検体から血清を分離し，LZD濃度の測定日まで−80°Cで保存した．血清中LZD濃度は筑波大学附属病院においてLM1010及びLC-MS/MSを用いて同日中に測定した．LC-MS/MS装置はekspert ultraLC Systems（株式会社AB Sciex，東京）を接続したAPI3200（株式会社AB Sciex）を用いた．LM1010の機台間差の比較検討には，筑波大学附属病院に設置した2台（Instrument 1：製造番号2003-005，Instrument 2：製造番号2002-003）及び日立総合病院に設置した1台（Instrument 3：製造番号2003-006）の合計3台を用いた．
2. 血清中LZD濃度測定LM1010による血清中LZD濃度の測定は，同機器のLZDメソッドに付属する操作手順書に従い，指定の試薬・消耗品を用いて実施した．すなわち，提供された前処理方法に従い，150 µLの患者血清からスピンカラムセット（株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いた固相抽出によってLZDを回収した．本カラムは逆相系固相抽出スピンカラムである．分析には移動相A及びB（株式会社日立ハイテクサイエンス）を，分析カラムにはLaChrom LM TypeA Column（株式会社日立ハイテクサイエンス）を用い，UV波長は250 nmで解析した．本測定法の定量下限は0.558 µg/mLであり，2–50 µg/mLの範囲での日内変動と日間変動の変動係数（coefficient of variation: CV値）はそれぞれ0.9–2.3%と1.0–1.8%であった．本測定法の精度管理はquality control（QC）サンプル（株式会社日立ハイテクサイエンス）の測定により実施した．
LC-MS/MS法による血清中LZD濃度の測定は，既報19）に基づき若干の修正を加えた測定法により実施した．すなわち，200 µLの患者血清に内標準物質としてテジゾリドを添加し，アセトニトリル500 µLを加えて除タンパクした上清1 µLをLC-MS/MSを用いて測定した．分析カラムはTSKgel ODS-100V（2.0 mm I.D.×50 mm，粒子径5 µm，東ソー株式会社，東京）を使用し，カラム温度は40°Cに設定した．移動相には0.1%ギ酸水溶液（移動相A）とアセトニトリル（移動相B）を用い，グラジエント条件は，A/B 80/20（0–0.01 min），80/20–5/95（0.01–0.60 min），5/95（0.60–3.00 min），5/95–80/20（3.00–3.20 min），80/20（3.20–6.00 min）とし，流速は0.2 mL/minに設定した．MS/MSにはエレクトロスプレーイオン化法を用い，システム制御及びデータ収集にはAnalyst software ver. 1.6.1（株式会社AB Sciex）を使用した．MS/MSにおいて，イオンソース温度は500°C，イオンスプレー電圧は5500 V，カーテンガスは20 psi，イオンソースガス1と2はそれぞれ30と70 psi，コリジョンガスは4に設定した．モニターしたLZDのプリカーサーイオンとプロダクトイオンのm/z値はそれぞれ338.4と296.3，内標準物質（テジゾリド）のプリカーサーイオンとプロダクトイオンのm/z値はそれぞれ371.2と343.2に設定した．本測定法の定量下限は1 µg/mLであり，1–50 µg/mLの範囲での日内変動と日間変動の変動係数（CV値）はそれぞれ1.2–2.2%と2.9–4.8%であった．
3. 併用薬剤の測定におよぼす影響LM1010によるLZD測定に影響をおよぼす可能性のある薬剤の有無を調査するために，すべての患者が採血時に服用していた薬剤をカルテから抽出した．LM1010の操作手順書に従ってLZD投与患者の血清中LZD濃度を測定し，LZDの定量に影響をおよぼす夾雑ピークの有無を得られたクロマトグラム上で確認した．
4. LZDの保存安定性試験LZDの保存安定性試験はLZD添加血清を用いて実施した．コントロール血清Iワコー（BR）（富士フイルム和光純薬株式会社，大阪）にLZD（Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis）を添加して，それぞれ2 µg/mL, 20 µg/mL及び40 µg/mLの血清検体を調製した．調製した検体は−30°Cで11週間，24週間及び48週間保存し，各期間における血清中LZD濃度をLM1010で測定した．LZD濃度がそれぞれの調製濃度の85–115%の場合に，安定であると評価した．
5. 統計解析LM1010及びLC-MS/MS法による血清中LZD濃度測定結果の比較には，Shapiro–Wilk検定でデータが非正規分布であることを確認したうえで，外れ値に対して頑健な手法であるPassing–Bablok回帰分析及びBland–Altman分析を用いた．解析はSPSS ver. 29（日本IBM株式会社，東京）及びMedCalc ver. 22（MedCalc Software Ltd., Belgium）を用いて実施した．Bland–Altman分析において，横軸は2つの装置で得られた血清中LZD濃度測定結果の平均値を用い，縦軸は2つの装置で得られた測定値の差を平均値で除した値（Relative difference）を用いた．誤差の許容範囲は誤差の平均値±誤差の標準偏差（2装置間の測定結果の差の平均値±1.96×差の標準偏差）で示した．p値が0.05未満の場合は統計的に有意であると判断した．
6. 倫理的配慮本研究は筑波大学附属病院臨床研究倫理審査委員会の承認（承認番号R04-161）を得て，「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」及び「ヘルシンキ宣言」に基づき実施した．本検体の収集に際しては，研究分担者が患者若しくは代諾者に対して書面により説明して同意を取得した．
LM1010の検量線用標準試料及び患者検体の測定において，LZDの分析ピークは2.04分付近に観察された（Fig. 1）．LM1010とLC-MS/MS法の比較には，対象期間中にLZDが投与された患者20名（男性13名，女性7名）から得られた117検体を用い，LC-MS/MS法の定量下限未満（<1 µg/mL）であった3検体を除外した114検体を解析対象とした．血清検体114検体（20名）のLC-MS/MS法での測定値（x軸）とLM1010（Instrument 1）での測定値（y軸）の相関関係をFig. 2に示す．LC-MS/MS法による血清中LZD濃度の中央値は8.9 µg/mL（測定範囲：1.1–38.8 µg/mL，四分位範囲：4.5–19.7 µg/mL），LM1010による血清中LZD濃度の中央値は8.4 µg/mL（測定範囲：1.2–43.9 µg/mL，四分位範囲：5.0–19.5 µg/mL）であり，両者の相関係数は0.991（回帰式：y=0.975x+0.152）であった．LM1010とLC-MS/MS法による測定値の差の絶対値が3.0 µg/mLを超えたのは4検体（3.5%）であった．Bland–Altman分析の結果をFig. 3に示す．LM1010（Instrument 1）とLC-MS/MS法による血清中LZD濃度の差の平均値（±1.96標準偏差）は+1.7（−21.3–24.8）%，95%信頼区間は−0.452–3.917であり有意な固定誤差は認めなかった（p=0.119）．また，回帰式の係数は−0.204，95%信頼区間は−0.424–0.016であり有意な比例誤差も認めなかった（p=0.068）．誤差の許容範囲外であったのは8検体（7.0%）であった．
Calculated linezolid concentration was 6.4 µg/mL.
Solid and dashed lines represent the Passing–Bablok regression line and identity line, respectively.
The relative difference was calculated using the following equation: (LM1010 method−LC-MS/MS method)/mean×100. The solid line indicates the mean relative difference between linezolid concentrations in LM1010 method and LC-MS/MS method, whereas the dashed lines indicate the upper and lower limit of agreement values, which were calculated as the mean relative difference±S.D. The dotted line represents the regression line of the relative differences.
3台のLM1010によるLZD測定値の機台間の比較には，対象期間中にLZDが投与された患者12名（男性10名，女性2名）から得られた34検体を用いた．3台のLM1010における機台間の相関関係をFig. 4に示す．機台1–2間の相関係数は0.998（回帰式：y=1.006x−0.058）（Fig. 4A），機台1–3間では0.984（回帰式：y=0.956x+0.053）（Fig. 4B），機台2–3間では0.982（回帰式：y=0.959x+0.048）（Fig. 4C）であった．Bland–Altman分析の結果をFig. 5に示す．血清中LZD濃度の差の平均値（±1.96標準偏差）は，機台1–2，1–3，2–3でそれぞれ，−0.5（−5.6–4.6）%，−2.4（−18.9–14.2）%，−1.9（−19.1–15.3）%，95%信頼区間はそれぞれ−1.381–0.435（p=0.297），−5.307–0.584（p=0.112），−4.951–1.168（p=0.217）であり有意な固定誤差は認めなかった．回帰式の傾きは，機台1–2，1–3，2–3でそれぞれ，0.121，−0.442，−0.558，95%信頼区間はそれぞれ−0.137–0.379（p=0.346），−1.249–0.366（p=0.274），−1.390–0.274（p=0.181）であり有意な比例誤差も認めなかった．
Solid and dashed lines represent the Passing–Bablok regression line and identity line, respectively.
採血時に患者が服用していた薬剤の一覧をTable 1に示す．解析対象とした検体においてLZDのほかに計111剤が併用されていたが，LM1010のクロマトグラム上にLZD測定に影響をおよぼす夾雑ピークは確認されなかった．
| Acetaminophen | Distigmine | Loxoprofen | Rosuvastatin |
| Alfacalcidol | Domperidone | Magnesium carbonate | Rupatadine |
| Ambroxol | Doxazosin | Magnesium oxide | Sacubitril valsartan |
| Amezinium | Droxidopa | Mecobalamin | Salazosulfapyridine |
| Amiodarone | Duloxetine | Metformin | Sennoside |
| Amitriptyline | Edoxaban | Methotrexate | Shakuyakukanzoto |
| Amlodipine | Eldecalcitol | Minocycline | Silodosin |
| Aspirin | Elobixibat | Mirogabalin | Sodium ferrous citrate |
| Atorvastatin | Empagliflozin | Mitiglinide | Spironolactone |
| Atovaquone | Eperisone | Montelukast | Sulfamethoxazole |
| Avacopan | Esaxerenone | Naldemedine | Suvorexant |
| Azilsartan | Esomeprazole | Naproxen | Tacrolimus |
| Azosemide | Evocalcet | Nicorandil | Telmisartan |
| Bethanechol | Febuxostat | Nifedipine | Teneligliptin |
| Bisoprolol | Fexofenadine | Olanzapine | Tolvaptan |
| Calcitriol | Folic acid | Oxycodone | Torasemide |
| Calcium polystyrene sulfonate | Furosemide | Pimobendan | Tramadol |
| Carbazochrome | Iguratimod | Polaprezinc | Tranexamic acid |
| Carbocisteine | Juzentaihoto | Potassium chloride | Trichlormethiazide |
| Carvedilol | Lacosamide | Potassium L-aspartate | Trimethoprim |
| Celecoxib | Lansoprazole | Pranlukast | Ursodeoxycholic acid |
| Clarithromycin | Lanthanum carbonate | Precipitated calcium carbonate | Valganciclovir |
| Clobazam | Lemborexant | Prednisolone | Valsartan |
| Dapagliflozin | Levofloxacin | Pregabalin | Vonoprazan |
| Daprodustat | Levothyroxine | Ramelteon | Warfarin |
| Dextromethorphan | Limaprost alfadex | Rebamipide | Zinc acetate |
| Diclofenac | Lorazepam | Rifampicin | Zolpidem |
| Difenidol | Losartan | Rikkunshito |
−30°Cの凍結保存条件における保存安定性試験の結果をTable 2に示す．11週，24週，48週における血清中LZD濃度の真度は，2 µg/mL，20 µg/mL及び40 µg/mLのいずれの濃度においても調製濃度の85–115%の範囲内であり，−30°Cの条件下で48週までの長期冷凍保存でのLZDの安定性が確認された．
| LZD concentration (µg/mL) | Accuracy (% nominal) | ||
|---|---|---|---|
| 11 weeks | 24 weeks | 48 weeks | |
| 2 | 103.7±0.7 | 106.5±2.1 | 106.5±0.3 |
| 20 | 100.9±0.8 | 100.3±1.5 | 103.6±0.2 |
| 40 | 95.1±7.1 | 98.7±1.3 | 102.8±2.4 |
Linezolid concentrations were measured in triplicate using the LM1010 instrument. Data are presented as the mean±S.D.
本研究では，血清中LZD濃度測定におけるLM1010とLC-MS/MS法との相関係数は0.991と良好であり，血清中LZD濃度の差の平均値（±1.96標準偏差）は，+1.7（−21.3–24.8）%であった．3機台の機台間差の試験においては，いずれの相関係数も0.98以上であり，機台間における測定値の差は認められなかった．−30°Cにおける48週間の安定試験において，2–40 µg/mLに調製したLZD添加血清の真度は95.1–106.5%であり，同条件下での凍結保存におけるLZDの安定性が確認された．
LM1010を用いた血中薬物濃度測定として，Odaらはボリコナゾールの測定精度を評価し，LC-MS/MS法と高い相関が得られていることを報告している．20）また，Fukushiらはイマチニブの測定精度を評価しており，HPLC法及びLC-MS/MS法の両法においてLM1010との相関係数が0.906以上と良好であることを報告している．21）今回，われわれはLM1010を用いた血清中LZD濃度測定の分析学的妥当性を検討し，LZDの測定においてもLM1010の測定値はLC-MS/MS法との相関が極めて高く，かつ機台間での測定値の差も小さいことを明らかにした．
留意すべき点として，LM1010とLC-MS/MS法による測定値の誤差の大きい検体があり，血清中LZD濃度が10 µg/mL未満の検体ではLC-MS/MS法との測定値の差がやや大きい傾向がみられた（Figs. 2 and 3）．この原因の一つとして，本研究で用いたLC-MS/MS法での血清中LZD濃度の測定において，日内及び日間変動の相対標準偏差（relative standard deviation: RSD）が高濃度域（日内：1.68%，日間：3.61%）と比較して低濃度域（日内：5.05%，日間：11.41%）で大きいことが考えられる．19）また，LM1010は絶対検量線法によるHPLC法を測定原理としているため，検体測定時の手技が影響した可能性も考えられる．さらに，HPLC法の限界として，保持時間がLZDと同じ併用薬剤や内因性物質があった場合にピークの分離ができず，測定値が高値を示すことが挙げられる．今回の測定において，クロマトグラム上では夾雑ピークを認めなかったものの，併用薬剤（Table 1）や内因性物質の影響があった可能性は否定できない．これらの影響については臨床検体を用いた更なる検証が必要と考えられる．しかしながら，LC-MS/MS法とLM1010の測定誤差は概ね許容範囲内に収まっていること，両測定法間に有意な固定誤差や比例誤差を認めなかったことから，LM1010を臨床応用することに問題はないと考えられた．
LZDの安定性試験では，−30°Cの保存条件において48週間の安定性が示された．これまで，LZDの保存安定性試験では−20°Cの保存条件で6ヵ月間，−80°Cの保存条件で12ヵ月間の安定性が示されているが，−30°Cの保存条件では1.5ヵ月までしか検討されていなかった．22）医療現場において−80°Cでの検体保存が困難な場合もあり，−30°Cでの長期保存安定性を確認した今回の結果は臨床での検体保存に有用である．
結論として，本研究においてLM1010を用いた血清中LZD濃度測定はLC-MS/MS法と良好な相関を示し，LM1010の機台間における測定値に有意な差がないことを確認した．LM1010による血清中LZD濃度測定は1検体あたりの測定時間が約7分と迅速に結果を得ることができるため，臨床におけるTDM業務での活用が期待される．血清中LZD濃度測定の臨床的有用性（有効治療域の設定など）については今後多くの施設で検証する必要がある．
本研究に際して，血清中LZD濃度測定及びその準備に御協力頂いた谷村直樹氏に深く感謝申し上げます．また，検体収集に際して御協力頂いた筑波大学附属病院のスタッフ及びつくばi-laboratory LLPの皆様に深く感謝申し上げます．
本研究は株式会社日立ハイテクサイエンスとの共同研究で実施された．本研究において試薬・消耗品の購入のため，鈴木広道は同社より共同研究費を受領している．松下美由紀，森川 悟は株式会社日立ハイテクサイエンスの社員である．
