総説
共焦点レーザー内視鏡Confocal laser endomicroscopyの現況と将来展望
2019 年 61 巻 6 号 p. 1209-1217
詳細
2019 年 61 巻 6 号 p. 1209-1217
共焦点レーザー内視鏡とは，蛍光色素でラベルされた組織を顕微鏡レベルの解像度で観察できる内視鏡のことである．以前は内視鏡一体型であったが，現在はプローブ型，ニードル型となり内視鏡の鉗子孔や穿刺針から挿入し，目的とする部位に接触させることでリアルタイムに組織構造が観察可能である．消化管に限らず，胆道・膵管，肝臓，気管支・肺胞，膀胱，甲状腺などの臓器の組織画像も得ることができる．蛍光色素の投与経路には経静脈的投与と局所散布がある．その造影態度や形態異常をリアルタイムに観察することで，通常の内視鏡では検出できない病態も解明しうる．また今後，蛍光標識プローブによる分子イメージングも期待される．
本稿では，共焦点レーザー内視鏡の原理，機種，観察法と特徴を概説し，その後文献的考察を交えて臨床応用例を紹介する．
内視鏡の拡大観察法は14インチモニターで100倍程度までの拡大像をCCD（Charge Coupled Device）イメージセンサーに結像させることで，ピットパターンなどの粘膜表層の微細模様や微小血管像の観察を可能にさせた．近年，さらに細胞や細胞核スケールの拡大観察ができる顕微内視鏡が実用化された．顕微内視鏡観察法には光学法と共焦点法がある．
光学法は，CCDと顕微光学系との組み合わせにより，細胞核，末梢血管，あるいは組織構造の観察が可能な超拡大観察法である．2018年２月オリンパス社からエンドサイトスコピー（EndocytoⓇ）が発売された．26型モニター上で最大520倍の光学拡大機能が付いており，メチレンブルーなどの色素法を組み合わせることで細胞核の観察が可能であるため核異型の診断ができ，従来の細胞診に類似した画像を得ることができる．また狭帯域光観察（narrow band imaging：NBI）を追加することで末梢血管の顕微観察も可能である．
共焦点法は，生体組織内で光の焦点が合った位置のみの情報を選択的に結像する共焦点光学系を用いた方法で，粘膜表層の断層像や細胞レベルの顕微観察を実現した方法である 1）．フランス・マウナケア社から共焦点レーザー内視鏡Confocal laser endomicroscopy（CLE，CellvizioⓇ）が発売されている．本稿では，この共焦点レーザー内視鏡について，原理，機種，観察法を述べ，形態診断，機能診断，分子イメージングへの臨床応用について紹介する．
共焦点レーザー内視鏡は蛍光色素でラベルされた組織を顕微鏡レベルの解像度で観察することのできる蛍光内視鏡である．
共焦点光学系は「人工知能の父」と呼ばれたマーヴィン・ミンスキー（1927～2016）により1957年に共焦点顕微鏡double focusing optical systemとして発明された 2）．その原理をFigure 1-aに示す．発明当初はレーザー光源がなかったため，ランプ光源の前にピンホールを配置し，通過光を試料に投影し，さらに試料の像位置にピンホールと検出器を配置した．２つのピンホール，試料がすべて共役位置にあることから共焦点光学系と呼ばれる．しかし解像度は低く，大きな進展はなかった．その後1969年に指向性・干渉性・収束性に優れ，波長一定（単色性）の輝度の高い点光源であるレーザーが共焦点顕微鏡に用いられるようになって状況は一変し，共焦点レーザー顕微鏡が実用化されるに至った 3）．
共焦点光学系の原理．
a：マーヴィン・ミンスキーの発明原理．
b：共焦点レーザー内視鏡の原理．
この原理を内視鏡に応用したものが共焦点レーザー内視鏡である（Figure 1-b）．レーザー光がプレート型ビームスプリッター（beam splitter）を透過，対物凸レンズで直進・屈折し落射照明として試料（tissue）に収束される．戻ってきた光はビームスプリッターで反射し，焦点面（focal plane：青線）からの光（黒実線）だけがピンホールを通過し光検出器（detector）で結像する．焦点面以外（赤点線）からの光（黒破線）はピンホールでカットされるため，深さ方向の分解能が生じ光学的水平断層像を得ることができる．蛍光共焦点光学系を用いているため，さらに解像・コントラストともに優れた断層画像が得られる．
ペンタックス社が以前，内視鏡一体型スコープ（EC-3870CIKシリーズ：視野角：140°，共焦点観察範囲：475μm×475μm，共焦点観察深度：０～250μm）を供給していたが，その後製造を断念したため現在は購入できない．励起光レーザーは488 nm（青色），１mW以下の低出力で，安全基準はClass3Rである．画像分解能が0.7μmのため，非常に分解能の優れた画像が得られる 4），5）．また，観察深度も調整可能で現在でもこの機器を用いた論文が複数発表されている 6），7）．しかし，内視鏡の先端外径は12.8 mmのため，この内視鏡が挿入できスコープ先端を接触できる部位でしか画像を得ることができない．また，画像の取得はScan Mode Control Fasterが0.8 frame/sec（533×521μm），Scan Mode Control Slower：が1.2 frame/sec（1,024×512μm）と断続的で，リアルタイム観察は不可能である．
２）CellvizioⓇフランス・マウナケア社が製造している内視鏡（Figure 2）で，光の伝送は光ファイバーで行われている．プローブは現在６種類あり，Figure 3に各々の適合チャンネル径，プローブ長，制限使用回数，共焦点観察範囲，共焦点観察深度，画像分解能を示す．画像の取得速度は12 frame/secで，ビデオ画像としてリアルタイムに観察できる．励起光レーザーは488 nm，15 mWと低出力で，安全基準はClass 2M，直接ビームを覗き込んだり，集光しなければ安全とされる．いずれも細いため，通常の内視鏡の鉗子孔，穿刺針等から挿入可能で，通常観察下でプローブ先端を組織に接触させることで画像を取得できる．日本では2014年４月に薬事承認されたが，未だ保険承認されていない．
CellvizioⓇシステム．
CellvizioⓇのミニプローブ一覧．
①プローブ型共焦点レーザー内視鏡 probe-based CLE（pCLE）
消化管の検査には上部消化管用（GASTROFLEXTMUHD），下部消化管用（COLOFLEXTMUHD）があるが，有効長がそれぞれ３m，４mのため，有効長が２mのバルーン小腸内視鏡でも両者使用可能である．胆道用には通常，CHOLANGIOFLEXTMが用いられる．アメリカではバレット食道の精査が保険適用され，病理診断点数も付いている．
②ニードル型共焦点レーザー内視鏡 needle-based CLE（nCLE）
AQ-FLEXTM19は19ゲージの穿刺針に挿入可能であり，超音波内視鏡下穿刺（EUS-FNA）の際に用いられる．膵疾患，リンパ節，消化管粘膜下腫瘍等が対象である．アメリカでは膵疾患に対する超音波内視鏡下穿刺での使用が保険適用され，病理診断点数も付いている．
共焦点レーザー内視鏡に最も高頻度に使用されている蛍光造影剤である．分光吸収曲線のpeakは465～490 nm（青色），励起光のpeakは520～600 nm（黄緑）にある 8）．眼底血管造影に用いられるフルオレセイン注射液（ノバルティスファーマ社製：フルオレサイトⓇ静注500 mg）を用いる．ただし，現時点での保険適用はぶどう膜・網膜・視神経等の疾患の診断のみであり，共焦点レーザー内視鏡に用いる場合は保険適用外となり，2019年度以降は特定臨床研究のもとでの使用となる．フルオレセインは分子量332.32の赤色粉末で，エタノールまたは水酸化ナトリウム試液に溶けやすく，水にほとんど溶けない．静注されたフルオレセインの80％以上が血漿蛋白，主としてアルブミンと結合すると蛍光が著明に減弱する．静注で投与されたフルオレセインは急速に全身の血管内および血管外腔に拡散し，粘膜と皮膚は１分以内に染色される．これは網膜と中枢神経系の血管を除いて，すべての毛細血管から色素が漏れるためである．投与された色素は血管内で急速に希釈され，２ないし３回目の再循環で，ほとんど認められないまでの濃度になる．投与されたフルオレセインは，通常24時間以内に肝および腎によって排泄されるが，痕跡程度には１週間後にも認められる．皮膚の染色は静注後２時間，尿の変色は約24時間続く．腎機能障害があると，色素の貯留が起こる．実際の画像では経静脈投与後40秒ほどで血管が造影され，その後間質，上皮に造影剤が移行するダイナミックな変化が30分ほど観察できる．Nonakaらは胃粘膜への局所投与も有用であると報告している 9）．
フルオレセインの重篤な副作用にアナフィラキシーショックがある．Zografosはわが国を含む30カ国，260カ所の眼科施設の蛍光眼底造影実施症例594,687例を対象に合併症に関する調査を行った．死亡例は１例で49,577例（約５万例）中１例，重篤な合併症は３例で，18,020例（約２万例）中１例発生していた 10）．万一に備え，検査中は血管確保し，生体監視モニターを使用し，救急カートも近くに設置しておく必要がある．
２）その他アクリフラビンは分子量224.28の紫褐色または類赤色の結晶～粉末のアクリジン色素で，核染色可能な蛍光造影剤である．生理食塩水で0.05％に希釈して局所散布する．dsDNAの塩基間に挿入されたアクリジンの励起波長は502 nm（青色）で526 nm（緑色）の蛍光を発する．局所消毒薬として，グラム陰性・陽性細菌，真菌に効力があり，観賞魚の消毒剤として外用される．アクリフラビンの塩基間挿入によりフレームシフト変異が誘起されうる．なお，局所投与のため粘膜表層は染色されるが，粘膜深層は染色されない 11）．Kumagaiら 12），Nayaら 13）は粘膜刺激性の少ない外皮用殺菌消毒剤のアクリノールを用いた核染色の可能性を報告している．
他に，テトラサイクリン，クレシールバイオレットも蛍光剤となる可能性がある 14）．ただ，クレシールバイオレットを使用した筆者の経験では，蛍光強度は弱く良い染色像は得られなかった．
共焦点レーザー内視鏡の特徴を以下に列記する 15）．
１）病理組織標本を待たずにリアルタイムに組織像を知ることができる（optical biopsy）．
２）生体内の生きた組織画像が得られる（特に血管やリンパ管の観察に有効．ホルマリン固定パラファイン切片では脈管・間質は虚脱し，組織全体が収縮する）．
３）焦点面が表層下にあるため，粘膜深部の組織画像が得られる．
４）抗血栓薬投与患者，出血傾向の患者，全身状態が不良で生検採取を躊躇する患者等で生検を回避または生検個数を減らすことができる．
５）蛍光造影剤を静注後，その拡散を経時的に観察することで機能的側面を検討できる．
６）蛍光標識抗体や蛍光標識特殊染色を用いることで分子イメージングが可能である．
これら特徴を生かした臨床応用例の一部を紹介する．
①食道
すでにアメリカで保険適用になっているバレット食道に対しては多数の報告がある．バレット食道およびバレット食道腫瘍192例を対象とした国際多施設無作為割付比較試験において，白色光観察＋ランダム生検群に比べ，白色光観察＋pCLE＋狙撃生検群は腫瘍診断能の有意な向上が認められ（22％ vs ６％），約65％の患者で生検を回避でき，腫瘍に対する特異度は下げずに感度が向上できた（96％ vs 40％）と報告されている 16）．50例を対象とした白色光観察＋NBI＋eCLE＋ランダム生検（１cm毎の１／４周ずつ４カ所生検）を全例行ったオーストラリアの横断研究において，high grade dysplasia以上の病変の感度・特異度・正診率は白色光観察が79.1％，83.1％，82.8％，NBIが89.0％，80.1％，81.4％，eCLEが75.7％，80.0％，79.9％で，大部分の症例は白色光，NBIと狙撃生検で指摘できたと報告されている 17）．筆者らが施行したバレット食道腺癌のNBI拡大画像とpCLE画像をFigure 4に呈示する．扁平上皮に対するCLEに関して上皮乳頭内血管ループは描出されるが，扁平上皮の描出は不良で，同じ顕微内視鏡であるエンドサイトスコピーの方が優っている．
バレット食道腺癌（高分化腺癌，pT1b，粘膜下層浸潤：深層粘膜筋板～100μm）．
a：NBI拡大画像：黄色矢頭にバレット食道腺癌を認める．
b：pCLE画像（不整暗色上皮irregular dark epithelium）．
②胃
Bokらは表面型早期胃癌（分化型22例，未分化型10例），腺腫10例にpCLEを施行し，pCLEの診断能は91.7％，生検診断能は85.2％と報告している 18）．Parkらは内視鏡的粘膜下層剥離術予定の早期胃癌80例を対象にpCLE群と白色光＋色素内視鏡群に無作為割付前向き比較試験を行い，pCLEの方が正確な切除ラインの同定に有用であったと報告した 19）．筆者らは内視鏡診断困難なHp除菌後発見胃癌36病変に対する白色光観察，NBI拡大観察，pCLE，生検の質的診断能はそれぞれ72.2％，88.9％，97.2％，72.2％であり，pCLEは白色光観察，生検診断に比べ有意に高かったが，NBI拡大観察と有意差はなく，また癌境界領域の低異型度上皮・再生上皮の被覆率は95.2％，範囲診断能はNBI拡大観察の69.4％に比べpCLEで91.7％と有意に優れていたと報告した 20）．Figure 5にNBI拡大観察で癌境界が不明瞭な部位のpCLE画像を呈示する．
ピロリ菌除菌後発見早期胃癌（高分化型管状腺癌，pT1a（M））．
a：NBI拡大画像：黄色四角はpCLE操作部位．
b：pCLE画像：黄色点線左は癌腺管（不整暗色腺管irregular dark glands），右は非癌腺管．
③十二指腸
筆者らは非乳頭部十二指腸腫瘍にて腫瘍と関連するpCLE所見をdark epithelium，内腔突出像，造影剤漏出像，腺管の不均一性とした場合，dark epitheliumは感度83.3％，特異度100％で腺腫以上の腫瘍病変を，構造不均一性は感度100％，特異度98.2％で癌を予測し得たと発表した 21）．
④空腸・回腸
筆者らは深部小腸疾患に対するダブルバルーン小腸内視鏡下pCLEの有用性を報告している 15）．孤在性angiodysplasiaやRendu-Osler-Weber 病の小腸血管奇形において，pCLEで口径差のある血管吻合が描出され 22），また蛋白漏出性腸症を来す腸リンパ管拡張症において，拡張リンパ管が描出された．大量の小腸出血を繰り返した空腸GIST症例では，pCLEの先端を腫瘍中心の陥凹に接触させただけでGISTを疑う紡錘形腫瘍が描出され，生検診断が不要であった（Figure 6） 23）．
空腸GIST（Modified Fletcher分類：ハイリスク）．
a：経口的ダブルバルーン小腸内視鏡画像．
b：pCLE画像（多数の造影されない紡錘形の核と造影される細胞質を有する高密度な紡錘形腫瘍enhanced spindle cell tumor with many unenhanced nuclei）．
⑤大腸
大腸ポリープを対象とした画像強調観察に関する67編，自家蛍光内視鏡に関する11編，CLEに関する11編の論文のメタアナリシスでは腫瘍・非腫瘍の鑑別感度，特異度，リアルタイム陰性適中率はNBIが91.0％，85.6％，82.5％，FICEが91.8％，83.5％，83.7％，自家蛍光内視鏡が86.7％，65.9％，81.5％，CLEが93.3％，89.9％，94.8％であった 24）．
⑥炎症性腸疾患
通常内視鏡での診断が困難な潰瘍性大腸炎関連腫瘍に対する報告が多い．Kiesslichらは161例の潰瘍性大腸炎患者を対象とした無作為割付比較試験において，色素内視鏡＋CLE＋狙撃生検群は通常内視鏡＋ランダム・狙撃生検群に比べ生検個数が50％減少し，dysplasiaを4.75倍発見できたと報告した 25）．筆者らも潰瘍性大腸炎関連腫瘍において，分化型癌・dysplasiaでは造影不良なback to back構造異型，未分化型癌で造影不良な柵状構造配列が特徴的なpCLE画像と報告した 26）．
また，炎症性腸疾患の再燃予測に粘膜上皮間タイトジャンクションの障害を示す上皮間造影剤漏出像（Figure 7）の検出が有効であったとする報告もある 27）．
クローン病小腸粘膜のpCLE画像．
絨毛内間質の早期濃染と多数の上皮間造影剤漏出（黄色矢印）を認める．
⑦膵胆管
55例の胆管狭窄（悪性41例，良性14例）を対象としたCHOLANGIOFLEXTMによるpCLEの検討では従来の検査法に対し診断能の上乗せ効果が認められたと報告されている 28）．また，膵管内乳頭粘液性腫瘍で膵管が拡張している場合はCHOLANGIOFLEXTMによる膵管内観察も可能である 29）．
２）超音波内視鏡下穿刺①膵臓
アメリカで保険適用になっている膵疾患に対するEUS-FNA下nCLEの報告例は多数ある．膵嚢胞性疾患206例を対象としたフランスの最近の多施設前向き研究において，EUS-FNA下nCLEの感度，特異度は95％以上で，EUS単独や嚢胞液のCEA分析よりも有用であると報告されている 30）．
②リンパ節
消化管近傍リンパ節腫大21例を対象としたEUS-FNA下nCLEの探索的研究において，悪性腫瘍のリンパ節転移，悪性リンパ腫は全例に多形暗色調細胞が認められたが，EUS－FNAの診断能は86％であったと報告されている 31）．
食物不耐症が疑われた過敏性腸症候群36例を対象に，内視鏡鉗子孔から十二指腸粘膜に食餌性抗原を散布後pCLEでリアルタイム観察したところ，上皮間リンパ球，上皮間造影剤漏出が有意に増加することで原因が特定でき，特定食物の除去により症状が改善したとの報告がある 32）．
Atreyaらはアダリムマブ投与前のクローン病患者25例の大腸粘膜の炎症部に膜結合型TNFに対する蛍光標識抗体を散布し，蛍光細胞数が多いほどアダリムマブの反応性が良いことを示した 33）．また，Sturmらはファージディスプレイ法で同定したバレット食道腫瘍特異的配列ASYNYDAをFITC標識後に内視鏡下に散布し，pCLEで観察したところ，dysplasia，食道癌特異的な発現が認められたと報告している 34）．
欧米，中国では，臨床研究，実臨床ともCLEはバレット食道癌や膵腫瘍，炎症性腸疾患などの疾患に対し日本よりはるかに積極的に使用されているのが現状である．日本では共焦点レーザー内視鏡，蛍光造影剤とも保険承認されておらず，また何よりプローブに使用制限があり非常に高額であることが日本での普及を妨げている．従来の検査法で診断困難な病変の検出や機能診断，分子イメージングなどを可能にする内視鏡であり，現状の打開と今後の普及・発展が望まれる．
本論文内容に関連する著者の利益相反：大宮直木（マイランEPD合同会社，第一三共（株），EAファーマ（株），エーザイ（株），（株）ツムラ，田辺三菱製薬（株），医療法人福友会，大塚製薬（株），日本イーライリリー（株），武田薬品工業（株），アッヴィ合同会社，ブリストル・マイヤーズ スクイブ（株））
