FGA 1238 bp欠失を有する無フィブリノゲン血症3例のハプロタイプ解析

Abstract

先天的に血液中にフィブリノゲン（fibrinogen; Fbg）が存在しない無Fbg血症は約1/100万人の頻度でみられ，Aα鎖・Bβ鎖・γ鎖をコードするFGA・FGB・FGG遺伝子の変異が原因とされている。無Fbg血症患者にみられるFGA del c.364+86_c.510+45（FGA Δ1238 bp）は日本（三重，岡山，福岡，岐阜，埼玉）と中国（上海）で報告されているが地域性に関する検討報告はない。今回，三重で2例目の新規FGA Δ1238 bpを有する無Fbg血症を経験し，ハプロタイプ解析により過去に報告した三重と岡山の2家系と比較を行い，臨床所見についても既報症例と比較した。4番染色体のFbg遺伝子近傍の7種のshort tandem repeat（STR）領域を使用し，polymerase chain reaction（PCR）で増幅後にフラグメント解析を行った。3家系でD4S3021-FGA-i3 (intron 3 of FGA)-D4S2631-D4S1629（230-del-212-146 bp）の少なくとも3領域が共通であり，FGA Δ1238 bpを有する対立遺伝子が共通先祖由来である可能性が示唆された。FGA Δ1238 bpを有する無Fbg血症は西日本に発端者が分布していることから，今後もシークエンス解析に加えてハプロタイプ解析によるデータ蓄積を継続することで，遺伝的背景を明らかにする一端になると考える。

Translated Abstract

Congenital afibrinogenemia is characterized by the complete absence of immunoreactive fibrinogen in plasma, and its prevalence is approximately 1/1,000,000. Genetic mutations within three fibrinogen genes (FGA, FGB, and FGG coding for Aα, Bβ, and γ chain, respectively) have been associated with afibrinogenemia. FGA del c.364+86_c.510+45 (FGA Δ1238 bp) in afibrinogenemia has been reported in Japan (Mie, Okayama, Fukuoka, Gifu, and Saitama prefectures) and China (Shanghai), but regional characteristics are unknown. We identified a novel case of afibrinogenemic in a girl, the second patient in Mie, with FGA Δ1238 bp. The haplotype was identified by short tandem repeat (STR)-polymerase chain reaction (PCR) and fragment analyses using seven STR loci (D4S2962, D4S2934, D4S2999, D4S3021, intron 3 of FGA (FGA-i3), D4S2631, and D4S1629) on chromosome 4. Haplotype and clinical features were compared with those of two previously affected families (Yokkaichi and Kurashiki), and six patients were reported. Each of the three families had at least three common STR loci of D4S3021-FGA-i3-D4S2631-D4S1629 (230-del-212-146 bp) and the allele with FGA Δ1238 bp. The Mie and Okayama families may be derived from the same ancestor. Afibrinogenemic patients with FGA Δ1238 bp have been identified in Western Japan, and the continuous data accumulation by haplotype and sequence analyses should provide clues to discriminate their genetic background.

I　 はじめに

フィブリノゲン（fibrinogen; Fbg）はAα鎖，Bβ鎖，γ鎖の3種類のポリペプチド鎖から構成される340 kDaの血漿タンパクで，S-S結合により2量体(Aα-Bβ-γ)₂に組み立てられ肝細胞から分泌される。健常成人では180–350 mg/dLの濃度で血漿中に存在し，血液凝固・止血・血栓形成・創傷治癒・炎症反応・妊娠継続などに関与する。Aα鎖，Bβ鎖，γ鎖をコードする遺伝子は4番染色体上（4q31）のFGA（5 exons），FGB（8 exons），FGG（10 exons）であり，これらの遺伝子異常が先天性Fbg異常症の原因とされており，350以上の遺伝子異常がデータベースに登録されている¹⁾。

先天性Fbg血症は全世界で400家系ほどが報告され，量的異常である無Fbg血症および低Fbg血症，質的異常であるFbg機能異常症に分類される。無Fbg血症や低Fbg血症ではミスセンス変異，ナンセンス変異，フレームシフト，スプライス部位の異常，欠失などの様々な遺伝子異常がホモ接合体（Homozygote）またはヘテロ接合体（Heterozygote）に見られ，Homozygoteでは血漿中にFbgが存在せず，Heterozygoteでは低値となる。一方，Fbg機能異常症はほとんどがHeterozygoteのミスセンス変異であり，このミスセンス変異によりFbgの立体構造が変化し，血液凝固過程が障害される。量的異常・質的異常ともに有症状では出血傾向を呈するようになる^2),3)。

FGA遺伝子の1238 bp欠損（FGA del c.364+86_c.510+45, FGA Δ1238 bp）（Figure 1）を有する無Fbg血症は日本での報告が多く，我々がこれまでに報告した三重県，岡山県の家系⁴⁾以外に，福岡県⁵⁾，静岡県（発端者は岐阜県，埼玉県）^6),7)，中国⁸⁾での報告がある。今回新たに三重県出身者でFGA del c.364+86_c.510+45（FGA Δ1238 bp）を経験し，ハプロタイプ解析を行うとともに，これまでの症例の臨床症状をまとめたので報告する。

Figure 1 Sequencing analysis of mutant FGA

Mutant FGA is shorter than wild-type FGA. The 1238 bp nucleotide deletion from c.364+86 to c.510+45 was identified by sequencing analysis (FGA del c.364+86_c.510+45, FGA Δ1238 bp).

II　 症例

1． 症例1（Ise）：0歳25日　女児（2017）

出生情報：在胎40週1日　自然経腟分娩　Apgar score（1分／5分）：9/10　体重：3,126 g

家族歴：特筆事項なし

現病歴：日齢1日より右頭部頭血腫が出現し，次第に増大。日齢2日にも増大傾向続き，巨大頭血腫にて新生児特定集中治療室（Neonatal Intensive Care Unit; NICU）へ紹介入院となった。NICU入院時の頭血腫は，頭部右側方から後方に限局していた（縦径12.2 cm，横径11.0 cm）。全身の皮膚や粘膜に出血斑は認めなかった。

経過：新鮮凍結血漿（fresh frozen plasma; FFP）を補充後，Fbg活性値70–120 mg/dLを保てるようになり，血腫増大が改善された。第II・V・X因子活性が正常範囲であったことから，低Fbg血症または無Fbg血症が疑われ，Fbg製剤の補充を行い，安定化がみられた。

2． 症例2（Yokkaichi）⁴⁾：0歳3か月　女児（2010）

出生情報：在胎38週5日　自然経腟分娩　Apgar score（1分／5分）：10/10　体重：2,940 g

家族歴：血族結婚なし　両親・親族に出血傾向なし

現病歴：生後6日目の臍帯脱落から臍出血止まらず，近医受診も止血不能で救急搬送された。来院時出血性ショックの状態であった。コンピューター断層撮影（CT）検査では硬膜下血腫を認めた。

経過：来院時，急速補液と同時に止血処理を行うも止血不能であった。FFPおよび赤血球MAPを投与しながら6時間圧迫後止血確認され，その後の経過は良好であった。第II・V・X因子活性が正常範囲であったことから，先天性無フィブリノゲン血症が疑われ，以後はFbg製剤投与を行った。3週間の入院加療後，外来フォローとなった。

3． 症例3（Kurashiki）⁴⁾：0歳11か月　女児（2008）

出生情報：詳細不明

家族歴：特筆事項なし

現病歴：嘔吐下痢症状により近医受診し，当日，4日後，5日後に点滴による処置が行われた。この点滴刺入部が血腫となり，凝固系が著明に延長していることから3回目の点滴後に紹介受診となった。来院時，前医での点滴挿入部からの出血が続き，止血不能であった。

経過：プロトロンビン時間（prothrombin time; PT）・活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time; APTT）が著名に延長，Fbg低値（測定不能），その他凝固因子は正常であったことから，低Fbg血症または無Fbg血症またはFbg機能異常症が疑われた。入院後FFPを3日間投与し，点滴刺入部の出血が止血可能となり，全身状態も良好となった。退院後の外来フォローではFbgの定期補充は行っていないが，経過良好である。

 

3例すべて精査目的に本学および本学附属病院にて詳細解析を施行し，無Fbg血症と最終報告を行った。本学における血液凝固検査結果と遺伝子解析結果をTable 1に示す。

Table 1  Cases of afibrinogenemia in three families

Reference range	Age	Sex	PT (sec)	APTT (sec) 23.0–38.0	Fbg-TT (mg/dL) 180–350	Fbg-Ag (mg/dL) 180–350	Type of mutation
Family 1: Ise
Proposita	0	F	> 60	> 200	< 20	1.0	FGA Δ1238 bp (Homozygote)
Father	—	M	11.9	32.4	213	222	FGA Δ1238 bp (Heterozygote)
Mother	—	F	11.5	33.6	238	265	FGA Δ1238 bp (Heterozygote)
Family 2: Yokkaichi4)
Proposita	0	F	> 60	> 200	< 20	15 *	FGA Δ1238 bp (Homozygote)
Father	—	M	11.3	29.0	191	248*	FGA Δ1238 bp (Heterozygote)
Mother	—	F	11.8	29.0	191	292*	FGA Δ1238 bp (Heterozygote)
Family 3: Kurashiki4)
Proposita	0	F	> 60	> 200	< 20	2.8	FGA Δ1238 bp, FGA c.54+3A>C (Compound Heterozygote)
Father	—	M	11.7	28.6	313	311	FGA Δ1238 bp (Heterozygote)
Mother	—	F	12.4	29.3	223	231	FGA c.54+3A>C (Heterozygote)

*: EDTA plasma, PT: prothrombin time, APTT: activated partial thromboplastin time, Fbg-TT: fibrinogen thrombin-time method, Fbg-Ag: fibrinogen immunological method, —: unknown, M: male, F: female.

本研究は，信州大学医学部遺伝子解析倫理委員会の承認（承認番号：383）を受けて行った。インフォームドコンセントを得た後に，DNA抽出及び遺伝子解析を行った。

III　 方法

1． ハプロタイプ解析

発端者（Ise）および両親の全血よりDNA Extractor WB Kit（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いてDNA抽出を行った。4番染色体のFbg遺伝子近傍の7種{D4S2962, D4S2934, D4S2999, D4S3021, intron 3 of FGA (FGA-i3), D4S2631, D4S1629}のshort tandem repeat（STR）領域を使用した（Figure 2）。STR-polymerase chain reaction（PCR）は蛍光標識プライマー⁴⁾およびAmpliTaq Gold^® 360 Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を使用し，95℃ 15分―（94℃ 30秒，57℃ 1分，72℃ 1分）×40サイクル―72℃ 10分でPCRを施行した。PCR産物を30倍希釈後，3500 Genetic Analyzer（Life Technologies）にてキャピラリー電気泳動を行い，GeneMapper^® software 5（Thermo Fisher Scientific）でフラグメント解析によりハプロタイプを決定した。YokkaichiとKurashikiおよびその両親についても保存DNAを用いて，本解析におけるPCR条件および解析装置にて同様にハプロタイプ解析を行った。

Figure 2 Chromosomal localization of STR markers

D4S2962, D4S2934, D4S2999, D4S3021, intron 3 of FGA (FGA-i3), D4S2631, and D4S1629 on chromosome 4 (4q31–4q32) were used for haplotype analysis.

2． FGA Δ1238 bp無Fbg血症患者の臨床所見

これまでの国内外で報告されたFGA Δ1238 bp無Fbg血症患者7例の臨床所見をTable 2にまとめた。

Table 2  Characteristics of afibrinogenemic patients with FGA Δ1238 bp

Native place	Sex	Onset age	Main symptoms	Other mutation	Reference No.
Homozygote
Ise	F	1 day after birth	large cephalohematoma
Yokkaichi	F	6 days after birth	persistent umbilical bleeding, progression to intradural		[4]
			hematoma and hemorrhagic shock
Gifu	F	5 days after birth	subcutaneous hemorrhage (details unknown)		[6]
Saitama	F	details unknown	details unknown		[7]
Fukuoka	M	14 days after birth	prolonged umbilical bleeding	PROC 3 bp deletion of exon 7	[5]
Compound Heterozygote
Kurashiki	F	11 months after birth	hematoma developed at antibiotic infusion site	FGA c.54+3A>C (M)	[4]
			when hospitalized with infectious gastroenteritis
Shanghai	F	at birth (details unknown)	prolonged umbilical bleeding	FGA c.364+1_4delGTAA(P)	[8]

(M): maternal gene mutation, (P): paternal gene mutation.

IV　 結果

1． ハプロタイプ解析

各家系の発端者ごとのSTR領域（D4S2962-D4S2934-D4S2999-D4S3021-FGA-i3-D4S2631-D4S1629）の長さ（bp）は，Iseが132-175-215-230-del-212-137/136-177-217-230-del-208-146，Yokkaichiが130-177-217-230-del-204-146/130-179-207-230-del-212-146，Kurashikiが136-179-217-232-del-212-146/132-179-215-230-200-208-146であった（Figure 3）。Yokkaichi母とKurashiki父由来のD4S2934-FGA-i3-D4S2631-D4S1629（179-del-212-146），Yokkaichi母とIse父由来のD4S3021-FGA-i3-D4S2631（230-del-212），Yokkaichi母とYokkaichi父とIse母由来のD4S3021-FGA-i3-D4S1629（230-del-146）が，それぞれ共通していた。

Figure 3 Haplotype analysis of chromosome 4q adjacent to fibrinogen gene

I and II are the first and second generation, respectively. Numerals (130–232) are amplification length (bp) using STR-PCR. Δ is deletion. The alleles with FGA Δ1238 bp and FGA c.54+3C are highlighted in deep gray and light gray, respectively. Squares are males, and circles are females.

2． FGA Δ1238 bp無Fbg血症患者の特徴

これまでに報告されたFGA Δ1238 bpを有する無Fbg血症患者の臨床所見についてTable 2に示す。7例中6例が日本での報告であり，Homozygoteが5例，Compound Heterozygoteが2例であった。男女比は1:6で女性に多かった。5例が出生後まもなく臍出血や頭血腫などを契機に無Fbg血症と診断がなされたが，Kurashikiは出生時のイベントではなく外傷性の血腫が原因で診断された。Compound Heterozygote 2例のFGA Δ1238 bp以外の遺伝子変異は，いずれもFGA遺伝子のsplicing siteの遺伝子変異であり，Compound Heterozygoteを含めた7例全てが2種類の対立遺伝子の両方にFGA遺伝子異常を有していた（Table 2）。

V　 考察

無Fbg血症は約1/100万人の頻度でみられ，新生児期に臍帯出血や頭血腫増大など重篤な症状を呈することが多く，死亡することもある。新生児期以降も，外傷に起因する重篤な出血が惹起され，創傷治癒障害もみられる^9),10)。Fbgは分娩時の止血および妊娠継続¹¹⁾に必須の物質であり，異常Fbg血症を有する女児にとって将来的な妊娠・分娩管理が非常に重要となる。また，患児の次子の妊娠・出産におけるリスク管理のためにも，発端者およびその両親の遺伝子解析が有用であり，発端者の経時的フォローによるデータ蓄積が必須である。

これまで，FGA Δ1238 bpを有する無Fbg血症は日本での報告が大多数であり，発端者の出身地は三重，岡山，福岡，岐阜，埼玉と，西日本に散見される傾向にあった。今回我々は，国内で6例目の症例を経験し三重県では2例目ということもあり，共通の祖先から受け継がれた可能性を考えハプロタイプ解析を行った。FGA Δ1238 bpを有するYokkaichi母由来の対立遺伝子のD4S3021-FGA-i3-D4S2631-D4S1629（230-del-212-146）において，少なくとも3領域が他のFGA Δ1238 bpを有する対立遺伝子と共通であり，三重県2家系ではD4S3021-230 bpとFGA-i3の欠失が共通であった（Figure 3）。我々が解析した家系はいずれも血族婚でないが，FGA Δ1238 bpを有する対立遺伝子上で共通する領域を有していた。特にD4S3021とFGA-i3の距離は0.83 cM，FGA-i3とD4S2631の距離は0.65 cMと他の遺伝子座間と比べても短く，組み換え頻度が低いことからも，共通先祖由来の領域が保存されて子孫に伝達された可能性がある。FGA遺伝子解析と併せたハプロタイプ解析については，疾患頻度が低いこともあり報告がほとんどなく，少人数を対象とした家系解析の報告があるのみである¹²⁾。ハプロタイプ頻度を正確に推定するにはより多くの家系のデータまたは200人以上のデータが必要であり，本症例についても4領域の連鎖解析を行うことはできなかった。しかしながら，頻度の低い疾患でありながら三重県内で2例が発見され，その他の発端者も中部～西日本に分布している。FGA Δ1238 bpが日本人固有の共通先祖由来である可能性もふまえ，シークエンス解析に加えたハプロタイプ解析によるデータ蓄積が望まれる。

Homozygoteは個人差はみられるものの，詳細不明を除く4例全てで出生後1～14日で症状がみられた。Aα鎖ノックアウトマウスでは，新生マウスの約30%が出生後2日以内に明らかな出血を認めており¹³⁾，同様の傾向といえる。一方，Compound Heterozygote のShanghaiはHomozygote同様に出生時に出血症状がみられたが，Kurashiki は出生後11か月目に点滴挿入による外傷性血腫が契機での診断であった。FGA Δ1238 bpの他にShanghaiが有しているFGA c.364+1_4del GTAAはintron 3領域の5'末端の4塩基欠失変異であり，intron 3のsplice siteの欠失により正常なsplicingが起こらず，frameshiftによりc.364から8番目のアミノ酸がstop codonになると予測される。Δ1238 bpの欠失部位もintron 3で生じていることから，FGA c.364+1_4del GTAAとFGA Δ1238 bpの組み合わせはFGA Δ1238 bp Homozygoteと同様のexon 3までの異常タンパクが作られると考えられる。一方，Kurashikiが有していたc.54+3A>Cは，我々のリコンビナント実験¹⁴⁾により，一部正常なsplicing過程を経ることから，正常なFbgが少なからず分泌されることにより出生時出血イベントが回避されたものと考えられる。正常タンパクが全く作られないFGA Δ1238 bp Homozygoteでは正常Fbgが分泌されないことから症状が出現するが，Compound Heterozygoteはもう一方のFGA 遺伝子変異部位による異常Fbg産生および分泌の程度が異なるため，症状の出現や重症度に違いが出るものと考えられる。

VI　 結語

本研究では，世界で7例目のFGA Δ1238 bpを有する無Fbg血症を経験し，ハプロタイプ解析を行うとともにこれまでの報告例をまとめた。今後も継続的なシークエンス解析とハプロタイプ解析を行うことで，日本で報告例の多いこの疾患の遺伝的背景を明らかにする一端になると考える。

 

本研究は，科研費（17K09009）の助成を受けて行ったものである。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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