技術論文
多血小板血漿作製後の時間経過における全自動血液凝固測定装置CSシリーズでの血小板凝集能の変化
2020 年 69 巻 4 号 p. 631-639
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2020 年 69 巻 4 号 p. 631-639
【背景・目的】血小板凝集能検査（透過光法）は，自動測定器で数多くの検査を実施可能となった。しかし多検体処理では，機器内での検査待ち時間延長により検体の多血小板血漿（PRP）は長時間静置状態となる。細胞である血小板は沈降し検査前の撹拌がないと血小板分布が不均一な検体となること，また採血後の時間経過による血小板反応性の変化も懸念される。この静置の血小板凝集への影響を検討した。【方法】健常人から作製したPRPにADP（0.5, 2 μM）とコラーゲン（0.5, 2 μg/mL）を用いて1）PRP作製後に静置状態0，30，90，150，210分後，測定直前に撹拌あり・なしの血小板凝集反応の変動，2）PRP作製後180分の静置検体の上・下層および撹拌後の血小板数を比較した。【結果・結語】血小板凝集反応は，凝集刺激の強い場合に150分の静置検体まで安定したが，ADP低濃度刺激では30～90分後がピークで以後は減弱した。長時間静置検体で測定前に撹拌すると反応が減弱した。一方，静置検体の血小板数は検体の上下部で10%程度の差は生じたが凝集反応に影響はなかった。したがって，血小板反応の有無を確認する強刺激を負荷する検査は，検査前には撹拌は不要で，静置の影響はないことが示唆された。一方で，弱刺激による血小板活性化反応を判定するには，採血後から検査までの時間が重要で，検査のタイミングに注意する必要がある。
Background: Platelet light transmission aggregometry (LTA) can be performed using a Sysmex CS series, an automatic measuring device. However, it is observed that the sample of platelet-rich plasma (PRP) moves to the left and stays for a long time in the device owing to the multisample processing. We investigated the time course of platelet activation following platelet-rich plasma preparations on CS-2000i. Methods: PRP samples from normal healthy donors were allowed to stand from 0 to 180 min after preparation. The platelet activity of these samples with or without mixing was assessed by LTA using CS-2000i. Final concentrations of 0.5 and 2 μM ADP and 0.5 and 2 mg/μL collagen were used. We also determined the platelet count at the supernatant or lower part of the sample. Results and Conclusions: The results showed that the time course of platelet aggregation was not affected within 120 min. However, the platelet activation was attenuated when the sample was weakly stimulated with ADP after 30–90 min of platelet preparation, or was stirred before the measurement after allowing the sample to stand for a long time. Although the platelet count at the lower part of the sample was approximately 10% higher than that at the supernatant, no considerable effect on platelet activation was observed. Therefore, it was suggested that leaving the sample for a long time does not affect the results of this assay under the given conditions. However, it is necessary to pay attention to the timing of the assay after PRP preparation in the determination of platelet activation.
血小板は，外傷などの血管損傷時に血小板血栓を形成して一次止血を行い，止血機構の維持に中心的役割を果たしている血液細胞である。この血小板の機能低下や異常亢進の際には，出血性疾患や血栓性疾患を発症する可能性があるが，その異常を見いだすために種々の血小板機能検査法が開発されてきた。その中でも主となる検査法は血小板凝集能検査であり，1962年にBornによって開発されて以来，透過光法（light transmission aggregometry; LTA）1)が出血性疾患である血小板無力症やvon Willebrand病などの先天性血小板機能異常症の診断2)においては血小板機能評価の「ゴールドスタンダード」とされ，今でも汎用されている3)。臨床検査室では自動化された検査機器が導入されて各種検査が簡便化されていく一方で，この透過光法をもちいた血小板凝集能は手作業による煩雑な検査法である。さらには，血小板という生きた血液細胞の生理的機能を検査するため検体の保存ができず採血後の適切な時間内に実施しなければならない時間的制約があること，血小板凝集能検査のための専用機の設置をしなければならないことなど，未だに多くの技術的な問題，検査技師のマンパワーの問題から大病院でも検査を実施していない施設もある。
これに対して近年，ルーチン検査で使用されている全自動血液凝固測定装置（シスメックス株式会社，CSシリーズ）に血小板凝集能検査装置が搭載され，スターラーバー入りキュベットへの多血小板血漿（platelet rich plasma; PRP）の添加やアゴニストの添加などが自動化された。我々はこれまで用いられてきた血小板凝集能測定装置であるPA-200（興和株式会社）とCS-2000i（シスメックス株式会社）との比較検討を実施し，相関は良好である上に用手作業が格段と減ることで検査手技の面でも標準化されるためCSシリーズが有用であることを報告した4)。我々以外のグループからも血小板機能異常症の診断，抗血小板薬の薬効評価に使用できることが報告されている5)～8)。これにより全自動血液凝固測定装置で多数の検体を同時に処理することが可能となったが，多くの検体を扱うことでPRPの作製から測定までの時間にばらつきが生じること，検査までの待機時間が長くなることによる血小板の試薬反応性の低下，また検査機器へ静置されたPRP検体中の血小板が沈降することによる凝集能結果への影響が懸念される。そのため我々は，これらの懸念事項について全自動血液凝固測定装置の検体ラック上でPRPが長時間放置された場合を想定し，ADPおよびコラーゲン凝集への影響および血小板数の影響を検討したので報告する。
本研究は，東京大学医学部附属病院治験委員会（治験薬事申請番号：2013057-11Y，課題名：血小板凝集能測定システム比較．シスメックス社の受託研究），東京大学大学院医学系研究科・医学部倫理委員会（1584：血小板活性化機構の解明）の承諾を得て行われた。
血小板凝集能検査は，機器としてCS-2000iを用いた。試薬としてレボヘムADPおよびレボヘムコラーゲン（シスメックス株式会社）を用い，ADPの終濃度は0.5 μMと2 μM，コラーゲンの終濃度は0.5 μg/mLと2 μg/mLになるように調製した。
採血は21 Gの翼状針で，真空採血管（5 mL，3.2%クエン酸ナトリウム）を用いて行い，テーブルトップ遠心機4000（KUBOTA製）で700 rpm（90 g），15分の遠心で得られた上清をPRPとした。残血を3,000 rpm（1,690 g），10分にて再度遠心し，得られた上清を乏血小板血漿（platelet poor plasma; PPP）とした。抗血小板薬を含めた薬の服用がない健常人4人からPRP作製後，サンプルをカップに移した後に0分，30分，90分，150分，210分後まで蓋をしたまま静置してそのまま測定した条件（静置）と静置し測定前に撹拌して測定した条件（撹拌）において，凝集曲線，最大凝集率，Area Under the Curve（AUC），Lag Timeを比較した。抗血小板薬を含めた薬の服用がない健常人6人からPRP作製後180分間静置し，PRPの上層部分と下層部分および撹拌したPRPを採取し，血小板数の測定を多項目自動血球分析装置XN-9000（シスメックス株式会社）を用いて実施した。統計学的手法にはpaired t-testを用い有意水準を5%とした。
After preparation PRP (0 min), platelet aggregation was measured by CS-2000i at particular points of time (30, 90, 150, 210 min). PRP samples left to stand for a given period of time (leave to stand) or mixed well before assay (mixed) were stimulated with ADP at two different concentrations.
Maximum platelet aggregation rates, area under the curve (AUC), and lag time were measured by PRP samples taken from four healthy volunteers.
典型的な血小板凝集波形（Figure 1）においては，PRP調製直後の2 μMで刺激したものでは1次凝集後の凝集曲線の低下が観察されずにそのまま2次凝集により最大凝集に達した（Figure 1A, B）。また，0.5 μMで刺激したものでは1次凝集後に軽度の凝集曲線の低下が観察されたもののその後に2次凝集が観察されて最大凝集に達した（Figure 1C, D）。
PRP作製後の時間経過に伴い，凝集が弱くなる傾向が見受けられた。ADP 2 μMの刺激条件では210分後ではこれまで観察されていなかった1次凝集後の2次凝集に至るまでの凝集曲線の低下が観察されたが，撹拌と静置では大きな違いはなかった（Figure 1A, B）。ADP 0.5 μMの刺激条件では2次凝集に達したのは撹拌の30分および静置の30分，90分であった（Figure 1C, D）。
これらADP惹起血小板凝集のデータをまとめたものをFigure 2に示す。最大凝集率の評価の結果，ADP 2 μM刺激では静置で210分まで80%を超えていたが，攪拌では210分において80%を下回った（Figure 2A, B）。ADP 0.5 μM刺激では，撹拌したサンプルにおいて経時的に最大凝集率，AUCともに低下する傾向が観察されたが，静置してあるものでは特に90分後で攪拌に比べて最大凝集率が大きくなる傾向が観察された（Figure 2A–D）。
2． コラーゲン凝集（Figure 3, 4）
After preparation PRP (0 min), platelet aggregation was measured by CS-2000i at particular points of time (30, 90, 150, 210 min). PRP samples left to stand for a given period of time (leave to stand) or mixed well before assay (mixed) were stimulated with collagen at two different concentrations.
Maximum platelet aggregation rates, area under the curve (AUC), and lag time were measured by PRP samples taken from four healthy volunteers.
典型的な血小板凝集波形（Figure 3）においては，コラーゲン2 μg/mLおよび0.5 μg/mLの2濃度での刺激条件とも，凝集反応が起こり最大凝集に達した。しかし，2 μg/mLに比べて0.5 μg/mLは凝集曲線の立ち上がりまでの時間であるLag-timeが長い傾向が観察され，濃度依存的に延長した。撹拌と静置条件の差異に関して，Lag-time，凝集曲線に大きな違いは観察されなかった。
これらコラーゲン惹起血小板凝集のデータをまとめたものをFigure 4に示す。最大凝集率の結果は，PRP作製後210分の検体において撹拌条件のコラーゲン0.5 μg/mL刺激の方が2 μg/mL刺激と比べてやや低下する傾向が観察されたが，静置条件下においてはその傾向は観察されなかった（Figure 4A, B）。AUCではFigure 3の凝集曲線で観察されたLag timeの違いに伴いコラーゲン濃度の0.5 μg/mLが2 μg/mLに対してやや低値傾向になることは観察されたが，撹拌と静置条件での大きな違いは観察されなかった（Figure 4C, D）。Lag timeでは凝集曲線で観察された通りに2 μg/mLに比べて0.5 μg/mLでコラーゲン濃度依存的に延長傾向が観察された。また，PRP開始直後から90分までLag timeが短くなる傾向があり，その後延長する傾向が観察された。撹拌と静置での大きな違いは観察されなかった（Figure 4E, F）。
3． 血小板数PRP作製後180分の静置条件の検体での上層・下層からのPRPおよび撹拌後の血小板数を比較したところ，6人の平均は上層で24.6 × 104/μL，下層で27.6 × 104/μL，撹拌後で26.7 × 104/μLであった。上層と下層で10%程度の血小板数の違いがあり，上層と下層および撹拌後と上層との間に血小板数に有意差が観察された（Figure 5）。
Platelets in the PRP samples were measured by XN-9000. After leaving to stand samples, PRP was taken from the upper side (upper) and lower side (lower) of the tube. Other sample was mixed before measurement. Asterisks indicate statistically significant differences (p < 0.05) between subgroups.
これまで血小板機能検査法は，数少ない検体を全て手作業で時間通りの検査工程により検査を実施していたが，全自動血液凝固測定装置で大量検体の測定が可能となったことから，検査実施時間のずれや検体静置に伴う血小板反応性，またPRP中の血小板の沈降が凝集能結果へ影響する可能性が懸念されたため，症例数が少ない検討ではあるが評価した。血小板凝集能検査は複数の凝集惹起剤や異なる濃度での血小板反応性を確認することが多く，1検体であっても1度に複数の検査をするために，全自動血液凝固測定装置が同時に測定できる患者検体数は多くない。例えば4つの測定チャンネルを持つ測定器では，ADP，コラーゲン，エピネフリン，リストセチンの凝集惹起剤で検査するのであれば各1濃度であり，種々の濃度を測定したい場合には1つの試薬で4濃度までである。時間差なく同時に測定するためには，検査目的に応じて検査すべき試薬，もしくは濃度を選択し，さらに検査が必要であれば1サイクル（5～10分）の測定後となる。1検体であれば待ち時間は少ないが，数多くとなるとこの影響は大きくなる。また血小板凝集の測定が自動化されるというメリットの反面，凝固時間などのルーチン検査項目と血小板凝集で使用する全自動測定装置が1台に集約されているために，ルーチン検査との兼ね合いからPRP調製後測定までにかかる時間も気にかけなければならない。血管内治療に伴う血小板凝集能評価，抗血小板薬療法の有用性を評価するためには，新たなスコアリング指標9),10)での評価が必要とされていることを考慮すると，血小板凝集能のテスト数自体も今後増加することとなる。今回は，このような状況を考慮してCSシリーズにおいて長時間静置したケースを想定して検討した。
PRPの静置後の血小板数に最大3 × 104/μL（約10%）程度の差が生じた。過去の報告では，PRPの血小板数を希釈による凝集能の変化5)を観察したところ，生理食塩水による1.5倍程度の希釈では変動がなかった。一方で，遠心操作により作製された自己PPPを用いたPRP中の血小板数の調整は血小板反応性を損なう。今回の観察は静置による血小板沈降であるため，自己PPPでの希釈と異なる。全ての血小板が底に沈んでしまわず，サンプルカップからの機器のプローブによる検体の吸引される位置にもよるが，吸引される検体の血小板数の差異は凝集反応に大きな影響がないことが示唆された。近年では，PRPの血小板数を調整することは推奨されず11)正常な血小板数の被験者から作製されたPRPの血小板数のばらつき程度であれば，検査結果に影響がないとされている。この程度の血小板数自体は大きな影響がないと考えて良い。実際，ADP，コラーゲンの終濃度が血小板凝集を十分に惹起させることが可能な条件下では，PRP調製後150分の静置検体までは凝集能は安定しているように思われた。しかし，弱凝集物質であるADPの終濃度が血小板凝集をギリギリ惹起可能である0.5 μMのような条件下においては，凝集能は経時的に変化することが認められた。コラーゲン凝集はADP凝集に比べて撹拌・静置の条件下で変化がないように見受けられたが，ADPはいわゆるweak agonistでコラーゲンは比較的強力なアゴニストであり血小板活性化の差12)により生じた差である。弱い刺激のADPで血小板機能低下が鋭敏に捉えられていると示唆された。今回の結果も過去の報告13),14)と同様に，凝集能はPRP調製直後よりもある程度静置した方が血小板活性は上昇する傾向であり，一定時間を超えると顕著に活性低下することが観察されていると推測される。また，強めの刺激では撹拌検体と静置検体で大きな差は認められなかったが，ADP 0.5 μMの90分，ADP 2 μMの210分などを見ると，静置検体の方が撹拌検体に比べてやや活性が高くなる傾向であった。LTA測定は採血後4時間以内に完了すべき3),11),14)とされているが，今回の我々の検討でADP，コラーゲン刺激で差が生じたように，惹起剤の条件によってはその時間内であっても測定結果に変動が見られることに留意すべきである。原因については検索できていないが，保管温度，蓋の有無などのちょっとしたことが影響するとされており，長時間の静置後に検査前に血小板に機械的な刺激を加えることが影響しているかもしれない。今後この傾向を認めるかどうかは検査結果に影響する可能性もあり，さらなる検討が必要である。
心筋梗塞や脳梗塞などの血栓性疾患における血小板活性化などの機能評価やこれら疾患に対する抗血小板薬投与での薬物効果判定についても，透過光法を用いた血小板凝集能検査法が用いられてきた15),16)。しかしその一方で，血小板機能検査に基づいた抗血小板薬調整における無作為化臨床試験では一部の試験でしか利点が実証されていない17)。各々で異なる血小板機能検査が使用されていること，また検査法により結果に差異が生じることが知られており18)，その影響によることも示唆されている。血小板機能検査法の検査標準化が克服すべき課題15),19)であったが，特別な新しい検査機器を揃えることなく，多くの施設で凝固検査のために使用しているCSシリーズをもちいているので，この機器による透過光法で統一できる。また，自動化に伴う再現性の向上や，検査試薬の統一化により多くの症例で検討することができ，検査の有用性のみならず臨床的な有益性が高いことを証明できる可能性がある。ただし，今回の検討の結果から，検体の静置された条件について血小板数や血小板凝集能への当初我々が懸念していたほどの大きな影響は観察されなかったが，血小板凝集反応を起こすか起こさないか境界域に関しては，若干の影響があることが明らかとなった。このため強い凝集刺激を加えて血小板機能の欠如の有無，また凝集を欠損させるインテグリンαIIβ3受容体阻害剤などの抗血小板薬投与後の薬物効果判定の診断のために血小板活性化能の有無が残存しているか確認するための検査であれば問題ない。しかし微細な血小板活性化を捉える検査，また抗血小板薬でも軽度血小板機能の低下させる場合の評価については，解決すべき課題がある。
2018年に商品化されたCSシリーズの次期モデルであるCN-3000/6000においては，これまでのCSシリーズで備わっていなかった測定機器での試薬の自動希釈機能が搭載された。これらの自動化技術の進歩に伴って，測定機器を持つ施設において同一シリーズでの血小板機能測定法での誤差がより小さくなり多施設共同研究を実施した際にもより施設誤差のない結果が得られることが可能で，今後大変有用な検査法となることが期待できる。これまでは，このように自動化が進んだ血小板機能検査機器は存在しなかったが，未だ検体作製や測定までの時間などのアナログ的な面に関しては注意が必要であることを肝に銘じたい。
今後の検討によりさらに標準化が進められ，新しい血栓性疾患の評価法の確立，検査標準化が推進されて発展を遂げることにより，多くの患者に恩恵がもたらされることを期待したい。
全自動血液凝固測定装置による血小板凝集能測定において，静置したPRPの血小板数は3時間経過後も大きな変化がないが，検体の安定性について考慮するとPRP調製後150分以内に測定されることが望ましいと考えられた。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
