標本とスライドガラスの接着についての検討から，乳腺断端術中凍結HE標本における組織切片の剥離防止法の確立を試みた。接着の検討には，組織パラフィン切片及び細胞診残余材料を用いて，剥離防止コートスライドガラスとの接着に関する検討を行った。その結果，染色に耐えうる標本の接着を得るためには，パラフィン組織切片は水で濡れることが必要で，かつ，パラフィン組織切片及び細胞診標本とも，剥離防止コートスライドガラスとの接着面から，乾燥や脱水による十分な水の拡散が必要であった。次に，乳腺断端術中凍結HE標本の標本剥離防止の検討を行った結果，標本作製時の固定法の選択が肝要で，湿固定に比し，乾燥を含む固定法では，有意に標本の剥離が抑制された（p < 0.001）。実際の運用としては，細胞診標本固定法の一つである噴霧固定による標本作製を行うことで，標本剥離を抑制し，かつ，良好な染色性が担保された乳腺断端術中凍結HE標本の作製が可能であった。
We study the adhesion between a specimen and a glass slide and try to prevent the detachment of intra-operatively obtained frozen HE specimens of the mammary margin. First, we used tissue paraffin sections and the remaining cytology material to study specimen adhesion to a coated glass slide. As a result, we found that to achieve adhesion of specimens that can withstand staining, the paraffin tissue sections must be wetted with water, and both paraffin tissue sections and cytology specimens required adequate water diffusion through drying and dehydration from the adhesion surface to a coated glass slide. Next, we examined the prevention of detachment of intra-operatively obtained frozen HE specimens of the mammary margin, and found that, compared with wet fixation, dry fixation significantly prevented specimen detachment (p < 0.001). Therefore, the choice of the fixation method for specimen preparation was important. In practice, after spray fixation, which is one of the cytological specimen fixation methods, specimen detachment is prevented by drying the specimen, and it was possible to prepare intra-operatively obtained frozen HE specimens of the mammary margin with good staining.
乳腺断端術中凍結HE標本作製において，薄切された組織切片が，染色中に剥がれ，再作製においても再度剥がれることを経験する。このことは乳腺断端術中迅速の診断精度を担保する上で速やかに解決することが望まれる。しかし，切片の剥離防止に着眼した報告は見られず，日常的にその対応に苦慮される。剥離の防止には，標本とスライドガラスの接着をより強固にする必要がある。接着とは，接着剤を媒体として化学的，物理的，もしくはその両者の作用によって二つの面が結合した状態であり，この際の接着剤とは，物体の間に介在し物体同士を結合することのできる物質であると，日本工業規格（JIS K6800）に用語説明されている。また，液体で個体が濡れるということは，液体と個体とが引き合う力を持っていることであり，接着の根幹である1),2)とされ，接着剤による接着は一般的に，接着剤に含まれる溶剤が拡散され硬化することで，接着はより強くなる1),3)とされている。
我々は日常的にパラフィンブロック，凍結標本や細胞診材料より得られた検査対象物を，スライドガラスに接着させることで標本の作製を行っているが，いずれの材料を用いた場合においても，検査対象物の剥離を経験する。今回，パラフィンブロック，細胞診材料を用いて，濡れの溶剤を水に限定し，接着面の濡れ，接着面からの水の拡散の必要性の検討の後，乳腺断端術中凍結HE標本の剥離防止法の確立を試みたので報告する。
奈良県立医科大学附属病院病院病理部に，2016年10月から12月の期間に提出された乳腺断端の術中迅速診断組織標本及び，その後のパラフィンブロック10検体。細胞診検体は，BDサイトリッチTMレッド保存液（日本ベクトン・デッキンソン株式会社）で固定後4週間以上経過した細胞診体腔液プール検体10例を用いた。スライドガラスは，剥離防止コートスライドガラスCREST（松浪硝子工業株式会社，以下コートスライド）を用いた。本検討は，奈良県立医科大学医の倫理審査委員会で承認されている（1363号／1364号）。
2． 統計学的処理方法統計学的処理は，EZR4)を用いて行った。
3． 接着における水の介在に関する検討 1） 接着面の濡れと乾燥による水の拡散に関する検討：パラフィン組織切片とコートスライド間の接着に関する検討スライドキャリーに立てかけた状態で，標本が下方にずれ落ちることがない状態を，接着が見られると定義し，検討を行った。濡れの有無に対する標本作製は，標本薄切後，切片を切片浮遊水で浮遊させた後コートスライドに貼付［水（+）］，及び直接コートスライドに貼付［水（−）］した標本を作製した。切片の乾燥に対する標本作製は，パラフィンオーブンPM-401（サクラファインテックジャパン）を用いて60℃ 30分間ベーキングを行った標本［乾燥（+）］，スライドキャリーに立てた状態で1分間室温に放置した水切りのみ［乾燥（−）］の標本，及び，切片を貼付し，すばやくエタノールに浸漬することで，脱水による乾燥を試みた標本［乾燥（エタノール）］を作製した。
①水（+）・乾燥（+）
②水（+）・乾燥（−）
③水（+）・乾燥（エタノール）
④水（−）・乾燥（+）
⑤水（−）・乾燥（−）
⑥水（−）・乾燥（エタノール）
パラフィン組織切片は厚さ4 μmとし，切片浮遊水には精製水を使用した。作製した標本の染色は，ヘマトキシリン・エオシン染色（hematoxylin eosin stain; HE）を自動染色装置ティシュー・テック®プリズマTM（サクラファインテックジャパン株式会社）で行った。染色後，水（+）・乾燥（+）の標本を対照に，それぞれの標本について組織切片剥離の有無について肉眼的に観察し，比較検討を行った。
2） エタノールによる接着面の水の拡散に関する検討：細胞診標本における接着細胞数の比較細胞診塗抹後における，水の拡散の差異による標本の接着性について比較検討を行った。細胞診プール検体を精製水で置換したものを用いた。塗抹標本はコートスライドを用い，沈査10 μLを引きガラス法で作製した。標本作製後，95%エタノール及び精製水にすばやく浸漬し，30分間室温放置した。作製した標本の染色は，パパニコロウ染色（papanicalou; PAP）を自動染色装置ティシュー・テック®プリズマTM（サクラファインテックジャパン株式会社）で行った。染色後，95%エタノール浸漬標本を対照に，精製水浸漬標本における細胞の接着についての評価を，3人の細胞検査士で行った。評価法は，塗抹中心部付近における4視野の細胞数を計測し有意差検定（Wilcoxon符号付順位和検定）を行った。検定結果p < 0.05を有意差ありとした。
4． 乳腺断端術中凍結HE標本における剥離防止の検討 1） 凍結組織標本の作製方法乳腺断端術中凍結標本を，ホワイトティシューコート（ユーアイ化成株式会社）を用い包埋後，ヒストテックピノ（サクラファインテックジャパン株式会社）で−80℃ 1分間凍結して凍結ブロックを作製した。凍結切片は，クリオトームFE（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて8 μmに薄切し，コートスライドに貼付して標本作製を行った。固定は，4種類の条件で行い，十分な固定及び乾燥を行った。
①エタノールをベースとした湿固定法（対照法）：湿固定液（80%エタノール40 mL，酢酸2 mL，及びホルマリン原液4 mL）に60秒以上静置（以下，湿固定）。
②乾燥固定法：室温放置で10分以上乾燥（以下，乾燥固定）。
③乾燥固定再水和法：切片を室温放置で10分以上乾燥後，生理食塩水に10秒浸漬し再水和（以下，再水和）。
④細胞診標本固定法である噴霧固定法：迅速コーティング剤ラピッドスプレー（武藤化学株式会社）を噴霧後，室温で60秒以上乾燥（以下，噴霧固定）。
それぞれの方法で固定した標本を用い，迅速HE染色を行った。染色条件は，固定後，温水水洗，ヘマトキシリン30秒，温水色だし30秒，エオジン30秒，脱水・透徹・封入で実施した。
2） 凍結組織標本の各固定法による標本剥離の比較検討組織標本の剥離状態を，3人の細胞検査士で評価した。評価法は，主観的評価法である視覚的アナログスケール5)（visual analog scale; VAS）を用い，10 cmの直線の一端を剥離なし，他端をひどい剥離と定義した。VASで得られた評価平均値を用いて有意差検定（ANOVA）を行い，p < 0.05を有意差ありとした。
3） 各固定法による迅速HE標本染色性の比較検討迅速HE染色における染色性の状態を，3人の細胞検査士により評価した。評価法はVASを用い，10 cmの直線の一端を美しい染色性，他端を見るに堪えない染色性と定義した。VASで得られた評価平均値を用いて有意差検定（ANOVA）を行い，p < 0.05を有意差ありとした。
乾燥（+）の標本では，肉眼的に切片のパラフィンは溶解されていた。乾燥（−）の標本では，肉眼的に切片はコートスライドに接着されていた。乾燥（エタノール）では，肉眼的にエタノール溶液中に切片の浮遊が見られた。HE染色標本では，水（+）・乾燥（+）の標本では，全例肉眼的に組織切片の剥離は認めなかった（0/10）。水（+）・乾燥（+），水（+）・乾燥（−），水（+）・乾燥（エタノール），水（吸水）・乾燥（+），水（吸水）・乾燥（−），水（−）・乾燥（+），水（−）・乾燥（−），水（−）・乾燥（エタノール）のいずれの標本でも，全例肉眼的に標本の剥離を認めた（10/10）（Figure 1）。
(1) Water (+)/Dry (+), (2) Water (+)/Dry (−), (3) Water (+)/Dry (ethanol), (4) Water (−)/Dry (+), (5) Water (−)/Dry (−), (6) Water (−)/Dry (ethanol)
In a study of drying with ethanol, glass slides were immersed in the solution, and the sections were detached and suspended in the solution.
All specimens were detached except for the water (+) and dry (+) specimens (10/10).
95%エタノール浸漬標本では，平均176.4個，95%信頼区間49.9–302.9，精製水浸漬標本では平均25.0個，95%信頼区間2.3–47.6であった。95%エタノール浸漬標本に比し，精製水浸漬標本は，有意に細胞の剥離が見られた（p < 0.01）（Figure 2, Figure 3）。
Specimens were prepared by the pull glass method.
The number of cells in four fields of view near the center of the smear was measured.
Significantly more cell detachment was observed in distilled water immersion than in 95% ethanol immersion.
湿固定ではVAS = 4.7，95%信頼区間3.7–5.7，乾燥固定ではVAS = 7.4，95%信頼区間6.8–8.1，再水和ではVAS = 7.4，95%信頼区間6.8–8.0，噴霧固定ではVAS = 7.1，95%信頼区間6.5–7.7であった。湿固定に比し乾燥固定（p < 0.01），再水和（p < 0.01），噴霧固定（p < 0.05）のいずれも，優位に標本の接着性の向上が見られた（Figure 4, Figure 5）。
Compared to wet fixation, the specimen detachment was significantly reduced in the fixation method including drying.
Wet fixation resulted in significant cell detachment.
染色性の特徴として，湿固定や噴霧固定では，全症例で核は立体的でクロマチンが保持されていたが，乾燥固定や再水和では，全症例で核は平面的で無構造であり，クロマチンの観察に堪え得なかった（Figure 6）。湿固定ではVAS = 5.8，95%信頼区間5.2–6.3，乾燥固定ではVAS = 5.6，95%信頼区間4.7–6.5，再水和ではVAS = 6.3，95%信頼区間5.5–7.0，噴霧固定ではVAS = 7.4，95%信頼区間6.8–8.1であった。湿固定に比し乾燥固定（p = 1.0），再水和（p = 0.79）では染色性の有意な差異は見られなかったが，噴霧固定では，優位にHE染色性は良好であった（p < 0.001）（Figure 7）。
Weakly magnified images ×100 (objective lens 10×) show the status of the nuclei in the mammary gland and stroma, and strongly magnified images ×600 (objective lens 60×) show the status of the nuclei in the mammary epithelium.
In terms of nuclear staining, the nuclear findings at 1) and 4) showed that the nuclei were stereoscopic and retained chromatin in all cases; at 2) and 3), the nuclei were planar and unstructured in all cases, indicating that HE staining was better for spray fixation.
Compared to wet fixation, spray fixation showed a significant improvement in staining.
乳房温存手術における断端陽性は局所再発リスク要因の一つである。従って乳腺断端術中迅速診断における評価は，その後の追加切除や手術方針を決定する重要な情報となる。術中迅速診断を行う際，病理検査技師には短時間で良質な術中迅速標本の作製を行うことが求められる。このため，固定法や特殊免疫染色等様々な検討により，その精度を高める報告6)～8)が見られる。しかし，標本剥離防止に関する文献はほとんど見られない。そこで，技師の技術の差異に影響されず，短時間で完了する切片の剥離防止方法の確立を試みるため，接着の基本的概念から，パラフィン切片及び細胞診検体を用いて，コートスライドへの接着の検討を行い，乳腺断端術中凍結HE標本における，組織切片の剥離防止法についての確立を試みた。
パラフィン切片については，液体で個体が濡れる必要性，乾燥による接着面からの水の拡散の必要性について検討を行った。その結果，水（+）・乾燥（+）の標本以外の条件では，すべての標本で剥離が見られた。
次に，細胞診標本を用い，エタノール脱水による接着面からの水の拡散の必要性について検討を行った。今回使用した細胞診標本中の細胞は，固定された細胞が精製水に浮遊させたため，細胞は水で濡れた状態で存在している。検討の結果，95%エタノール浸漬に比し，精製水浸漬では優位に細胞の剥離が見られた。
剥離防止コートスライドガラスの接着原理9)は，細胞膜上に発現する糖鎖の末端に存在するシアル酸が持つ負電荷と，スライド上のコート剤の持つ正電荷による静電結合であるとされている。従って，パラフィン切片や細胞診標本中の細胞とスライドガラスは静電結合により接着するのであるならば，検討を行った標本作製法において，剥離は見られないのではないかと考えた。しかし，検討結果からは，標本作製条件により，切片や細胞の接着性に有意差が見られた。これからは，検体とコートスライドとの，より強固な接着を得るためには，静電結合以外の作用の関与が否定できない。
パラフィン組織切片は，その殆どは乾燥された蛋白質で構成すると考えられ，切片浮遊水に切片を浮遊させた際，水を吸収する10)ことで濡れる。そして，大量の水と共に切片はコートスライドに採取され，スライドガラスは濡れる。次に，接着面の水は，乾燥により拡散される。また，細胞診材料では通常，コートスライドに濡れた状態で塗抹されることで，スライドガラスも濡れる。次に，95%エタノールにより細胞固定が行われる。この際，細胞とコートスライドとの接着面に存在する水は，エタノール脱水により拡散される。このように，接着面は水により濡れ，かつ脱水や乾燥による接着面からの水の拡散が得られることで，より強固な接着が得られたのではないかと考えられた。またコーティング剤は，水を溶剤とした接着剤として作用しているのではないかと推察された。
凍結組織切片の作製は通常，生体から採取後直ちに行われる。体内で起こる反応は水を媒体とする反応であるため，凍結組織切片は水により濡れた状態でコートスライドに貼付される。その後，エタノールをベースとした湿固定法による細胞固定が行われ，エタノールは，切片を浸透・拡散しながら接着面へ到達11)し，接着面の脱水が行われ，接着されると考えられる。しかし，乳腺断端術中凍結標本では，湿固定では標本の剥離が見られ，乾燥による固定法により有意に標本の接着が得られていた。
乳腺は，膠原線維などの線維性蛋白質や脂肪細胞の割合が多く含まれる12)。線維性蛋白質や脂肪細胞は，エタノールとの相溶性に乏しい13),14)ため，エタノールによる，切片への浸透・拡散は緩慢であると考えられる。従って，湿固定法では，エタノールが，切片とコートスライド接着面の水を拡散する速度よりも，エタノールが切片とコートスライドの間に一気に割り込む速度が速い11)ことにより剥離が生じる。しかし，乾燥による固定法では，乾燥により水の拡散が得られるため，十分な接着が得られたと考えられた。
湿固定と乾燥固定では，標本の細胞像は大きく異なるため，それぞれに適切な染色法を用いることが必要である。通常，凍結組織切片や細胞診標本は湿固定を行った後，迅速HE染色やパパニコロウ染色が行われる。その細胞像は，細胞及び核は立体的で，核クロマチンの詳細な観察が可能である。一方で，乾燥固定を行ったパパニコロウ染色では，細胞及び核は膨化し平面的で，核クロマチンの詳細な観察は困難となり，標本の染色性は不良となる15),16)。今回の検討においても，乾燥固定や再水和による迅速HE標本の核は，同様の所見を示し染色性は不良であった。しかしながら，噴霧固定による迅速HE標本の核は，湿固定同様の所見が得られ染色性は良好であった。噴霧固定に使用した迅速コーティング剤は，含有するポリエチレングリコールが保護膜を形成することで，細胞を保護するとされている17)。以上から噴霧固定を用いて，標本を十分に乾燥させた後に迅速HE染色を行うことで，標本の剥離を防止するとともに良好な染色性が担保された乳腺断端術中凍結HE標本の作製が可能であった。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本論文執筆にあたり，ご討論頂いた松浪硝子工業株式会社 新道 弘規氏に深謝する。
