2021 年 70 巻 2 号 p. 260-266
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）スクリーニング培地を用いての監視培養を導入する目的で，MDRS-K寒天培地（MDRS-K），X-MRSA寒天培地（X-MRSA），クロモアガーMRSAスクリーン培地（関東クロモ），CHROMager MRSA II（MRSA II）を比較検討し，検査フローを考察した。保存菌株を用いた評価では，栄養要求の高いMRSAは，48時間（h）培養で検出率を高められる可能性が示唆された。患者検体を用いた評価では，48 hのpositive predictive value（PPV）/negative predictive value（NPV）（%）は，MDRS-K，X-MRSA，関東クロモ，MRSA IIでそれぞれ100.0/80.0/42.9/100.0，100.0/94.9/75.0/100.0，100.0/89.7/60.0/100.0，93.3/95.9/78.0/98.9であった。夾雑菌の一部は，48 hでMRSA類似コロニーとして観察された。本検討により，スクリーニング培地を用いての監視培養検査は，48 hを最終判定とし，24 hではスクリーニング培地の発育有無のみで判定，48 hでは発色コロニーの同定を追加して判定することにより，低コストで正確性，迅速性に優れた検査が可能と考える。
To introduce the Staphylococcus aureus (MRSA) surveillance culture test in our hospital, we compared the characteristics of different MRSA screening media: Methicillin-resistant MDRS-K agar medium (MDRS-K), X-MRSA agar medium (X-MRSA), Chromagar MRSA screen medium (Kanto Chrom) and CHROMagar MRSA II (MRSA II). In the evaluation using 11 preserved S. aureus strains, small colonies of three variant MRSA strains were detected only in X-MRSA and Kanto Chrom, and a culture time of 48 h was required for these three variant strains to become positive. Aerobic-culture-delayed MRSA was detected only in Kanto Chrom and MRSA II after 48 h of culture. Cefoxitin-sensitive MRSA was negative in all media up to 48 h of culture. In the evaluation using patient samples, the sensitivity/specificity/positive predictive values/negative predictive values (%) of MDRS-K, X-MRSA, Kanto chrom and MRSA II after 48 h of culture were 100.0/80.0/42.9/100.0, 100.0/94.9/75.0/100.0, 100.0/89.7/60.0/100.0 and 93.3/95.9/77.8/98.9, respectively. We detected colonies of contaminating bacteria at 48 h of culture, and some of these contaminants were observed to form MRSA-like colonies at 48 h. On the basis of these results, we propose that the surveillance culture test using these screening media needs to continue for up to 48 h. It is possible to judge the presence of MRSA only by the color of its colonies on the screening medium at 24 h. Our study may lead to the establishment of a low-cost, high-accuracy and quick surveillance culture test.
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）は，個々の入院患者において難治性感染症の原因となりえるだけでなく，院内でのアウトブレイクを起こす可能性がある耐性菌である1)。国内での分離率は近年，減少傾向であるものの，6.42%と耐性菌の中では依然高い水準である2)ため，MRSA保菌者を早期に検出し適切な対策を行うことが重要とされる。MRSA保菌リスクの高い患者を対象とした入院時の監視培養を積極的に実施することは感染対策上，有用であるとの報告があり3),4)，とくに伝播リスクの高いNICUやICUでの実施が，費用対効果の視点からも有用と考えられている5),6)。またsurgical site infection（SSI）予防の観点からも術前に監視培養を行う有用性が評価され7)，MRSAを保菌し術後感染のリスクが高いと考えられる患者においては，手術の際に用いられる予防的な抗菌薬として抗MRSA薬が適応となっている1)。
特定機能病院，感染症指定医療機関である当院でもMRSA監視培養検査の要望は多い。一方で，監視培養検査は費用に見合う効果が得られるかが重要であり，導入にあたっては精度を維持した簡略的な検査体制の構築が必要となる。今回我々は，最小限の検査試薬コスト，労働力の中で，最大限の精度，迅速報告をするための培地選択，検査手順を構築する目的で，スクリーニング培地の比較検討を行い，最適な検査フローを考察したので報告する。
MDRS-K寒天培地（極東製薬，以下MDRS-K），X-MRSA寒天培地（日水製薬，以下X-MRSA），クロモアガーMRSAスクリーン培地（関東化学，以下関東クロモ）およびCHROMager MRSA II（日本ベクトン・ディッキンソン，以下MRSA II）の4種類のスクリーニング培地を比較した。また，非選択培地として羊血液寒天培地（日水製薬，以下羊血寒）を用いた。培養条件は各種スクリーニング培地で35℃ 好気培養，羊血寒で35℃ 5% CO2培養とした。スクリーニング培地上のMRSAのコロニーはMDRS-Kで黄色かつ卵黄反応，X-MRSAで青色，関東クロモおよびMRSA IIで藤色を呈する（Figure 1）。
MRSA 3株（保存株番号1，2，3），Small colony variants MRSA（SCVs-MRSA）3株（保存株番号4，5，6），好気培養遅発育MRSA 1株（保存株番号7），Cefoxitin（CFX）感性MRSA 1株（保存株番号8），MSSA 2株（保存株番号9，10）およびATCC29213標準菌株（MSSA）（保存株番号11）を供試菌株とした。ATCC29213株を除く各菌株はいずれも臨床分離株で，当検査室にて別患者より分離された株であり，VITEK MS（ビオメリュー・ジャパン）にてS. aureusと同定され，PCR法によりmecA遺伝子の有無を確認した。PCRはCica geneus DNA Extraction Kit（関東化学）を用いてDNAを抽出し，Okumaら8)の方法に従って実施した。
各対象菌株をMcfaland 0.5に菌液調整後，30 μLずつ各培地に画線塗抹し，24時間（h）・48 h培養後のコロニーの発育の有無を確認した。48 hで発育が認められた株は，Mcfaland 0.5に菌液を調整後，10−1から10−7まで段階希釈したものを20 μLずつ各培地に滴下し，Miles & Misra法による発育支持能試験を行った。なお，好気培養遅発育MRSAについては，35℃ 好気培養羊血寒を追加した。
3． 患者検体を用いた比較検討2019年6月3日から8月31日に検査室に提出された鼻腔の臨床検体113検体を対象とし，臨床材料における有用性を比較検討した。同定はVITEK MS（ビオメリュー・ジャパン），薬剤感受性試験はマイクロスキャンWalkAway 96 Plus（ベックマン・コールター）を用いた。鼻腔ぬぐいスワブを300 mLの滅菌食塩水に懸濁し，各培地に30 μLずつ滴下，画線塗抹を行った。このとき，白金耳は1枚の培地に画線するごとに別のものを使用した。24 h・48 h培養後に各培地の観察を行った。羊血寒については発育したS. aureus様コロニーを釣菌し，S. aureusと同定された株は，当院で日常検査において使用しているMDRS-K培地に塗布し，発育の有無でMRSAとMSSAの鑑別を行った。スクリーニング培地については発育が認められた培地より1コロニー以上を釣菌し，同定を行った。
各培地間で判定結果が乖離した株，および複数のスクリーニング培地でS. aureusが分離された場合は，それらのうち1株の薬剤感受性試験を行い，MICによるMRSAの確認を行った。感受性試験の菌液調整はプロンプト法により行い，MRSAの判定はCLSIの基準（oxacillin ≥ 4 μg/L and/or cefoxitin ≥ 8 μg/L）に従った9)。
なお，本研究は東北大学大学院医学研究科倫理委員会の承認を得て実施した（承認番号：2020-1-061）。
4． MRSA検出成績の比較法48 h培養後の最終判定において，非選択培地を含む5培地のいずれかひとつでもMRSAが検出された検体をMRSA陽性検体，いずれの培地でもMRSAが検出されなかった検体をMRSA陰性検体と定義し，各スクリーニング培地におけるsensitivity/specificity/positive predictive value（PPV）/negative predictive value（NPV）を求めた。各種スクリーニング培地において，MRSA類似コロニーが検出されたが，同定または感受性の結果，MRSA以外の菌であることが判明した場合を偽陽性，他のスクリーニング培地または羊血寒のみにMRSAが発育した場合を偽陰性とした。なお，類似コロニーの定義として，MDRS-Kでは卵黄反応またはマンニット分解のいずれかを呈したコロニー，それ以外の3培地では，陽性に近い着色を呈したコロニーとした。
Figure 1に示す発育コロニーを陽性としたとき，ATCC25293を含むMSSA 3株はすべてのスクリーニング培地で48 h陰性となり（Table 1），保存株1，2，3のMRSA株はすべての培地において24 hで陽性となった。SCVs-MRSAはX-MRSAおよび関東クロモでのみ陽性となり，24 hの時点では関東クロモ，X-MRSA共に保存株4のみ陽性で，保存株5，6は発育が見られないか，発育していても無色または着色のある微小コロニーであった（Figure 2）。CFX感性MRSAはすべての培地で48 h陰性であった。好気培養遅発育MRSAは24 hでは，CO2羊血寒以外のすべての培地で陰性，48 hで関東クロモおよびMRSA IIでのみ陽性となった。
| No. | Preserved strain | MecA gene | MDRS-K | X-MRSA | Kanto chrom | MRSA II | Blood agar (CO2) | Blood agar (Aerobic) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | |||
| 1 | MRSA | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ND | ND |
| 2 | MRSA | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ND | ND |
| 3 | MRSA | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ND | ND |
| 4 | SCVs-MRSA | + | w | w | + | + | + | + | − | w | w | w | ND | ND |
| 5 | SCVs-MRSA | + | − | w | − | + | w | + | − | − | w | w | ND | ND |
| 6 | SCVs-MRSA | + | − | w | w | + | w | + | − | − | w | w | ND | ND |
| 7 | Aerobic culture-delayed MRSA | + | − | w | − | w | − | + | − | + | + | + | − | − |
| 8 | CFX senciMRSA | + | − | w | − | − | − | − | − | − | + | + | ND | ND |
| 9 | MSSA | − | − | − | − | − | − | − | − | − | + | + | ND | ND |
| 10 | MSSA | − | − | − | − | − | − | − | − | − | + | + | ND | ND |
| 11 | ATCC29213 | − | − | w | − | − | − | − | − | − | + | + | ND | ND |
+: Typical colony was isolated.
−: Typical colony was not isolated.
w: Colony size is small and color is light, therefore it’s difficult to determine (weak growth).
ND: No data available.
Left: X-MRSA Right: Kanto chrom
MRSA 3株のそれぞれの培地での発育菌数に差はなく（Table 2），同等の発育支持能であった。SCVs-MRSA 3株および好気培養遅発育 1株においても，発育が認められた培地間で48時間での発育菌数に差はみられなかった。
| No. | Preserved strain | Medium | h | 10−1 | 10−2 | 10−3 | 10−4 | 10−5 | 10−6 | 10−7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | MRSA | MDRS-K | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 42 | 6 | 0 |
| X-MRSA | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 65 | 3 | 0 | ||
| Kanto chrom | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 38 | 4 | 0 | ||
| MRSA II | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 49 | 4 | 0 | ||
| 2 | MRSA | MDRS-K | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 25 | 2 | 1 |
| X-MRSA | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 32 | 1 | 0 | ||
| Kanto chrom | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 32 | 3 | 0 | ||
| MRSA II | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 31 | 2 | 0 | ||
| 3 | MRSA | MDRS-K | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 48 | 5 | 0 |
| X-MRSA | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 52 | 6 | 0 | ||
| Kanto chrom | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 59 | 6 | 0 | ||
| MRSA II | 24 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 49 | 10 | 0 | ||
| 4 | SCVs-MRSA | X-MRSA | 48 h | 68 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Kanto chrom | 48 h | 70 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 5 | SCVs-MRSA | X-MRSA | 48 h | > 100 | > 100 | 22 | 3 | 0 | 0 | 0 |
| Kanto chrom | 48 h | > 100 | > 100 | 12 | 5 | 0 | 0 | 0 | ||
| 6 | SCVs-MRSA | X-MRSA | 48 h | > 100 | 31 | 4 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Kanto chrom | 48 h | > 100 | 35 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 7 | Aerobic culture-delayed | Kanto chrom | 48 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 29 | 1 | 0 |
| MRSA | MRSA II | 48 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 34 | 3 | 0 |
患者113検体中MRSA陽性は15検体であった（Table 3）。24 hで陽性と判定された検体数は，MDRS-K 15，X-MRSA 15，関東クロモ 14，MRSA II 14検体であった。一方，MRSA陰性98検体は4種類のスクリーニング培地ですべて陰性となった。
| Incubation period (h) | Screening Medium | MRSA Positive | MRSA Negative | Sensitivity (%) | Specificity (%) | PPV (%) | NPV (%) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | MDRS-K | Positive | 15 | 0 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Negative | 0 | 98 | ||||||
| X-MRSA | Positive | 15 | 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Negative | 0 | 98 | ||||||
| Kanto chrom | Positive | 14 | 0 | 93.3 | 100 | 100 | 99.0 | |
| Negative | 1 | 98 | ||||||
| MRSA II | Positive | 14 | 0 | 93.3 | 100 | 100 | 99.0 | |
| Negative | 1 | 98 | ||||||
| 48 h | MDRS-K | Positive | 15 | 20 | 100 | 80.0 | 42.9 | 100 |
| Negative | 0 | 78 | ||||||
| X-MRSA | Positive | 15 | 5 | 100 | 94.9 | 75.0 | 100 | |
| Negative | 0 | 93 | ||||||
| Kanto chrom | Positive | 15 | 10 | 100 | 89.7 | 60.0 | 100 | |
| Negative | 0 | 88 | ||||||
| MRSA II | Positive | 14 | 4 | 93.3 | 95.9 | 77.8 | 98.9 | |
| Negative | 1 | 94 | ||||||
PPV: positive predictive value
NPV: negative predictive value
48 hでの陽性判定検体数は，MDRS-K 15，X-MRSA 15，関東クロモ 15，MRSA II 14検体であり（Table 3），24 hと比較して，関東クロモで1検体増加した。類似コロニーが検出されたが，同定の結果S. aureus以外の菌種と判明した偽陽性検体がMDRS-K，X-MRSA，関東クロモ，MRSA IIでそれぞれ17，5，10，4検体，感受性の結果MSSAと判明した偽陽性検体がMDRS-Kにおいて3検体あった。S. aureus以外の類似コロニーは同定の結果，coagulase-negative Staphylococci（CNS）やCorynebacterium sp.であることが確認された。なお，羊血寒のみMRSAが検出された検体は今回の検討では認められなかった。
3） MRSA発育結果に乖離がみられたMRSA株の解析MRSA発育成績の結果に乖離がみられた患者検体No. 81の株について，PCR法にてmecA遺伝子の保有を確認した。また，Miles & Misra法による48時間における発育支持能試験は，関東クロモの発育菌数が劣っていた（Table 4）。E-test（ビオメリュージャパン）を用いた cefoxitinのMICは16 μg/Lであった。
| Screening Medium | h | 10−1 | 10−2 | 10−3 | 10−4 | 10−5 | 10−6 | 10−7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MDRS-K | 48 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 0 | 0 | 0 |
| X-MRSA | 48 h | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 29 | 1 | 0 |
| Kanto chrom | 48 h | 20 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
類似コロニーを含めたMRSA以外の菌が発育した検体数と株数，菌種内訳をTable 5に示した。24 hではMDRS-KおよびX-MRSAでCNSが多く発育する傾向が認められ，48 hにおいてその発育数も増加した。一方，関東クロモとMRSA IIではCNSの発育抑制は優れているものの48 hでCorynebacterium sp.が発育する傾向が認められた。
| MDRS-K | X-MRSA | Kanto chrom | MRSA II | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h (n = 35) | 48 h (n = 51) | 24 h (n = 13) | 48 h (n = 40) | 24 h (n = 9) | 48 h (n = 21) | 24 h (n = 8) | 48 h (n = 20) | |
| S. epidermidis | 28 | 43 | 7 | 31 | 2 | 5 | 1 | |
| S. capitis | 1 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 4 | 5 |
| S. caprae | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | |||
| S. haemoliticus | 5 | 5 | 3 | 5 | 4 | 5 | 3 | 4 |
| S. lugdunensis | 2 | 5 | 5 | 4 | 6 | |||
| S. hominis | 1 | 2 | ||||||
| Corinebacuterium sp. | 1 | 2 | 5 | 4 | ||||
| MSSA | 3 | |||||||
| Total | 37 | 60 | 13 | 46 | 9 | 23 | 8 | 22 |
n: number of false positive samples
今回我々は，MRSA監視培養を導入するにあたり，4種類のスクリーニング培地の比較検討を行った。菌株の発育成績ではSCVs-MRSAと好気培養遅発育MRSAの結果が乖離した。非色素性もしくは，非溶血性，目玉焼き状コロニー，ピンポイントコロニーの形態を特徴とするSCVs-MRSAの中には，発育にチミジンを要求する株が存在する10)。X-MRSAと関東クロモは，このチミジン依存性SCVs-MRSAの検出を可能にしたスクリーニング培地である。関東クロモでチミジン依存性SCVs-MRSAが検出できることは西尾ら11)により報告されており，SCVs-MRSAも24 hで判定可能であったとの報告であるが，今回の我々の検討で使用したSCVs-MRSAの菌株では，検出はできたものの，陽性と判定できるまでのコロニー形成に3株中2株で48 hを要した。またX-MRSAについても同様の結果であった。さらに，好気培養遅発育MRSAについては，発育にCO2を要求するS. aureusの存在が報告されており，CO2培養でないと見逃される懸念があるとされるが12)，今回の検討で使用した，羊血寒48 hの好気培養では発育しないMRSA株も，48 hであれば関東クロモおよびMRSA IIでは陽性と判定できるコロニー形成を認めた。これらのことから栄養要求の高いMRSAにおいては，24 hの培養時間では不十分であるものの，スクリーニング培地での48時間培養で，検出率を高められる可能性がある。また，患者検体からも培地の種類により発育結果が異なる株が検出された。我々の結果と同様に各種スクリーニング培地は24 hに比べ48 hで検出率が上がることが以前より報告されており11),13),14)，スクリーニング培地は48時間まで観察する必要があると考える。また，MDRS-Kを除いた3培地では48 hにおいてもMSSAの発育は認められず，関東クロモとMRSA IIでMSSAが夾雑菌として発育しないことは西尾らの報告11)とも一致する。
今回の結果と培地のコストより，当院ではX-MRSAを採用することとした。X-MRSAを使用した場合，MSSAの発育がなかったことから，24 h，48 hともに薬剤感受性試験でのMICによるMRSAの確認を省略できる可能性がある。ただし，24 h判定で偽陽性となる患者検体はなかったものの，48 hではCNSが類似コロニーを呈して発育することが確認された。これらのことから，48時間で発色コロニーが発育した場合は，同定検査でS. aureusを確認する必要があり，24 hで発育した場合は，同定をせずにMRSA陽性の報告ができると考えている。また，類似コロニーを呈さない夾雑菌としてもCNSの発育が多かったため，鼻腔検体等，CNSが多く存在する検体については，しっかりと塗り広げて分離することが必要である。さらに，CFX感性MRSAなど，どの培地を選択した場合でも，スクリーニング培地では検出不可能な菌株が存在することは念頭に入れておく必要がある。そのうえでX-MRSAを使用した監視培養の手順としては，48 hを最終判定とし，24 hで陽性となった検体については同定・感受性検査を行うことなくMRSAの迅速報告が可能となると考える（Figure 3）。
当院では，従来，MRSA検出を羊血寒からの釣菌，同定，薬剤感受性試験で行っていた。これを本手順に置き換えることにより，スクリーニング培地のみで同等精度の結果を最短24 hで報告できるため，作業効率の向上や検査コストの削減が期待できる。
今回我々はMRSA監視培養検査導入のため，4種類のMRSAスクリーニング培地を比較検討した。その性能成績から，48 hを最終判定とし，24 hでの判定ではスクリーニング培地の発育有無のみで，48 h判定では発色コロニーの同定を追加することで，結果報告ができる可能性が示された。この検査手順によりスクリーニング培地のみで正確性，迅速性に優れた監視培養検査が可能と考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
