基礎検討
麻黄湯による緑膿菌病原因子の抑制効果についての基礎的検討
2021 年 70 巻 3 号 p. 595-601
詳細
2021 年 70 巻 3 号 p. 595-601
緑膿菌は湿潤環境中に棲息し，病原性が低く健常者には感染しても症状が出ることはほとんどない。しかし，免疫力の低下した易感染者には日和見感染症を引き起こすことがある。感染経路として，カテーテル汚染などによる外因性感染や患者腸管内に棲息する緑膿菌による内因性感染がある。緑膿菌は緑膿菌感染症の重症・難治化の原因となる種々の病原因子を産生する。漢方薬である麻黄湯は抗インフルエンザウイルス作用が報告されている。しかし，麻黄湯による緑膿菌の病原因子に対する影響についての報告はない。そこで，本研究では，麻黄湯による緑膿菌（PAO1株）の病原因子に対する影響をin vitroで検討することを目的とした。今回，増殖速度，biofilm形成能，motility（swarming, swimming, twitching），total proteaseと，ヒト結腸癌由来細胞caco-2を用いた内因性感染の確立に重要な細胞侵入性の検討を行った。増殖速度は麻黄湯添加により，4，8時間にて抑制を認めたが各検討に用いた18時間以降では抑制を認めなかった。swarming motilityでは61%，total proteaseでは15%の抑制を認め，細胞侵入性においても有意な抑制を認めた。
In healthy individuals, Pseudomonas aeruginosa infection is less toxic and rarely causes symptoms. However, it often causes opportunistic infections in immunocompromised hosts. P. aeruginosa infection routes may be exogenous (from contaminated catheters) or endogenous (involving infiltration of P. aeruginosa from the intestinal niche into the blood). P. aeruginosa also has several pathogenic factors that can facilitate evasion from the host immune system. Maoto, a herbal medicine, is reported to exert anti-influenza virus effects; however, the effects of Maoto on P. aeruginosa infection is unknown. In this study, we examined in vitro the effects of Maoto on the growth rate, biofilm formation, and protease-producing abilities of P. aeruginosa strain PAO1, as well as its swarming, swimming, and twitching motility and capacity of invading Caco-2 cells. PAO1 showed a significantly suppressed growth rate at 4 and 8 h after Maoto treatment, but showed no suppression after 18 h. The swarming motility was 61%, the total protease was 15%, and the cell invasion ability was significantly suppressed. These changes were accompanied by a significant reduction in the cellular invasive capacity of P. aeruginosa.
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は好気性のグラム陰性桿菌で水回りなどの日常生活環境中やヒト口腔内，ヒト腸管内に広く常在している。通常では病原性が低く健常者に症状が出ることはほとんどない。しかし，易感染者にしばしば肺炎や敗血症などの日和見感染症を引き起こし，時には重篤化することから，院内感染として問題視される代表的な菌種である1)。本菌の感染経路には，カテーテル汚染などから血液中に緑膿菌が侵入して起こる外因性感染や患者腸管内に棲息する緑膿菌が腸間膜を通過して血液中に侵入して起こる内因性感染がある2)。
さらに，緑膿菌は緑膿菌感染症の重症化や難治化の原因となる病原因子を多く産生する。緑膿菌が腸管から血液へ移行するメカニズムとして，鞭毛運動による腸上皮細胞への付着・侵入能やムチン層の分解，proteaseによるムチン層の粘性の低下が関与する。これらは，健常人のように恒常性の保たれた腸管内であれば，粘液による物理的バリアや鞭毛と優先的に結合する抗菌ペプチドによる化学的バリアにより腸管からの細菌の侵入を防ぐことができるため，内因性感染は防ぐことが可能である。しかし，易感染者では腸管内の恒常性が乱れることにより，緑膿菌のような鞭毛をもつ細菌が腸管細胞内へ侵入しやすくなる2)。緑膿菌の鞭毛や線毛を用いて行われるmotilityは緑膿菌の薬剤耐性化の要因の一つとなるbiofilm形成過程においても重要である3)。motilityとは，細菌が行う運動性のことであり，緑膿菌が行う運動性には，鞭毛を用いて液体中を移動するswimming motility，半固体表面を移動するswarming motility，線毛を用いて固体表面を移動するtwitching motilityがある。緑膿菌の鞭毛は免疫原性が高く，急性感染に際して強い炎症を引き起こす。しかし，鞭毛は宿主貪食細胞の認識の標的になっていることから，慢性感染において緑膿菌はアルカリプロテアーゼで自らの鞭毛の主成分であり宿主TLR5に認識される分子パターンであるFlagellinを分解し，遊離Flagellinを活性化することにより菌体への貪食細胞の攻撃を回避する4)。さらに，proteaseはムチン層の粘性の低下のみならず宿主補体などの溶解による宿主免疫回避機構にも関与する5)。
近年，漢方薬は顆粒や細粒などのエキス製剤の出現で，従来の煎じ薬にみられる煎じる手間が省けることによる簡便さから，現代人の生活に取り入れられ，広く利用されるようになってきた6)。漢方薬とは生薬を複数組み合わせて薬効を高めたものであり，麻黄湯は麻黄，杏仁，桂皮，甘草を含有する漢方薬である。麻黄はエフェドリンなどのアルカロイドを含有し，交感神経刺激による気管支拡張作用を有し，杏仁は鎮咳・去痰作用を有する。桂皮は，シンナムアルデヒドを主成分とし代謝や血流の改善作用を有し，甘草はステロイド様抗炎症作用を有する7)。このように，漢方薬は様々な作用を有する生薬の組み合わせによる相乗効果が期待できる。また，麻黄湯はインフルエンザ治療に用いられることがあり，エンドソーム酸性化を阻害することによるインフルエンザウイルスの脱殻阻害作用などが報告されている8)。しかし，緑膿菌の病原因子に対する麻黄湯の影響についての報告は我々の知る限りではない。麻黄湯による緑膿菌の病原因子を減弱させることができれば緑膿菌感染症治療の一助になる可能性がある。
そこで，本研究では緑膿菌の病原因子に着目し，麻黄湯を用いてその抑制効果についての基礎的研究を行った。
漢方薬は，麻黄湯（ツムラ株式会社，東京）を使用した。
2． 使用菌株菌株は，緑膿菌標準株 PAO1（American Type Culture Collection，ATCC BAA-47，米国）を使用した。
細胞はヒト結腸癌由来細胞caco-2（ATCC HTB-37，米国）を使用した。
3． 麻黄湯抽出液の作製方法1 mLの1% Dimethyl sulfoxide（DMSO，富士フイルム和光純薬株式会社，大阪）中で麻黄湯を100 mg溶解して，37℃で一晩振蕩させた。その後，抽出液を15,300 rpm，20分の条件で遠心分離し，得られた上清を麻黄湯抽出液とした9),10)。
4． 増殖速度の検討緑膿菌PAO1の各病原因子の検討を行う前の基礎的検討として増殖速度の検討を行った。5 mLの1%麻黄湯含有Mueller-Hinton broth（MHB，日本BD，東京）と非含有のMueller-Hinton brothに菌液を10 μL接種し，振盪培養し，4，8，12，24時間でサンプルを10 μL回収した。滅菌生理食塩水にてサンプルの10倍希釈系列を作製し，Mueller-Hinton agar（MHA，日本BD）に菌液を塗布し，培養後にコロニー数から菌数の算定を行った。
5． Biofilm formationの測定1%麻黄湯含有MHBと非含有MHBに菌液を107 CFU/mLになるように調整した。96穴プレート（ビーエム機器株式会社，東京）に作製した菌液を200 μLずつ接種し，37℃で18時間培養した。培養後に各well内の菌液を除去し1%クリスタルバイオレット（東京化成工業株式会社，東京）を200 μLずつ接種し，室温で10分間染色した。その後，well内をpH 7.2に調整したphosphate buffered saline（PBS）で5回洗浄した。各wellを十分に乾燥させ，99%エタノールを200 μL添加し，15分間静置することで色素を抽出した。抽出された色素は波長570 nmにおける吸光度にて測定した11)。
6． Motility assay 1） Swimming motilitySwimming motilityを測定するために，NaCl（富士フイルム和光純薬株式会社，大阪）0.5%，Tryptone（関東化学株式会社，東京）1%になるように調整し寒天濃度0.3%の培地を作製した。作製した培地9 mLに対して1 mLの麻黄湯抽出液（10%）を添加し，1%麻黄湯抽出液含有のswimming培地を作製した。Controlとして，麻黄湯抽出液未添加の1% DMSOを1 mL添加した。培地中央に滅菌生理食塩水を用いて109 CFU/mLに調整した菌液を10 μL滴下し，30℃，18時間で培養した。培地上に形成された混濁部分の直径を測定した12),13)。
2） Swarming motilitySwarming motilityを測定するために，Nutrient broth（関東化学株式会社）0.82%，細菌用寒天（関東化学株式会社）を0.5%になるように調整し，寒天濃度0.5%の培地を作製した。作製した培地を冷ましてからGlucose（富士フイルム和光純薬株式会社）濃度が0.5%になるようにろ過滅菌して添加した。上記同様に培地を作製し培地中央に滅菌生理食塩水を用いて109 CFU/mLに調整した菌液を10 μL滴下し，35℃，24時間で培養した。培地上に形成された混濁部分の直径を測定した12),13)。
3） Twitching motilityTwitching motilityを測定するために，LB broth（日本BD）2%，細菌用寒天を1%になるように調整し，寒天濃度1%の培地を作製した。上記同様に培地を作製し培地の中央に滅菌爪楊枝で穿刺し，穿刺部に滅菌生理食塩水を用いて109 CFU/mLに調整した菌液を10 μL接種し，37℃，48時間培養を行った。培地上に形成された混濁部分の直径を測定した12),13)。
7． Skim milk agar assayTotal protease産生の阻害効果を検討するために，skim milk agar assayを行った。麻黄湯添加と未添加のLB broth（日本BD）5 mL中に108 CFU/mLの菌液を10 μL接種し，18時間振盪培養した。これらの培養液をメンブランフィルター（0.2 μm，ADVANTEC，米国）でろ過滅菌し，1.5% skim milk含有LB寒天培地（富士フイルム和光純薬株式会社）の中央に10 μL滴下した。この培地を37℃，24時間培養後，培地上のclearance zoneを測定した11),14)。
8． 緑膿菌PAO1の細胞侵入性の検討24穴プレートに10% FCS添加D-MEM（富士フイルム和光純薬株式会社）で培養し，約1.0 × 105/mLに調整したcaco-2を1 mL分注し，37℃，5% CO2条件下にて48時間培養した。培養後，FCS free D-MEM培養液にて3回洗浄し，1%麻黄湯添加と非添加のFCS free D-MEMを900 μL添加した。各wellに1.5 × 108 CFU/mLの菌液を100 μL添加し，3時間反応させた。反応後に細胞内へ侵入した菌数をカウントするために，FCS含有D-MEMで200 μg/mLに調整したゲンタマイシン硫酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社）を洗浄したwellにそれぞれ1 mL添加後，1時間反応させ，caco-2細胞周囲の菌を殺菌した。反応後の上清にすべての菌が殺菌されたことをMH agarを用いて確認した。well内をPBS 1 mLで3回洗浄し，0.5%に調整したTriton X-100（ロシュ・ダイアグノシティックス株式会社，東京）を添加し，室温で15分間反応させ，caco-2を破壊し，MH agarを用いてcaco-2内に侵入した菌数の算定を行った15),16)。
9． 統計分析各検討は3回繰り返し，今回行った検討において，1%麻黄湯添加と麻黄湯未添加との間の有意差を決定するために，t検定を行った。
PAO1の増殖速度の結果をFigure 1に示す。1%麻黄湯の添加により4時間後，8時間後で有意な減少を認めたが（p < 0.05），12時間以降では，麻黄湯非添加（Control）と1%麻黄湯添加の生菌数の間に有意な差はなかった（p > 0.05）。
Growth rate was compared between control and 1% Maoto extract (four hours later: p = 0.0023, eight hours later: p = 0.0074). Error bars indicate the standard deviations for three measurements.
PAO1のbiofilm形成能の結果をFigure 2に示す。Controlにおけるbiofilm形成能を示す吸光度の平均値は2.757であり，1%麻黄湯添加における吸光度の平均値は2.645であった。1%麻黄湯の添加によるbiofilm形成能の有意な減少は認められなかった（p > 0.05）。
Biofilm formation was compared between control and 1% Maoto extract (p = 0.053). Error bars indicate the standard deviations for three measurements.
PAO1のswarming motilityの結果をFigure 3に示す。Controlにおけるswarming zoneの平均値は13.38 mmであり，1%麻黄湯添加における平均値は5.27 mmであった。（p < 0.05）1%麻黄湯の添加により，緑膿菌のswarming motilityは約61%の抑制を認めた。swimming motilityとtwitching motilityは有意な抑制は認められなかった（データは示さず）。
Swarming motility was compared between control and 1% Maoto extract (p = 0.015). Error bars indicate the standard deviations for three measurements.
PAO1のtotal proteaseの結果をFigure 4に示す。Controlにおけるtotal proteaseの産生を示すclearance zoneの平均値は19.1 mmであり，1%麻黄湯添加における平均値は16.3 mmであった（p < 0.05）。1%麻黄湯の添加により，緑膿菌のtotal protease 産生能は約15%の抑制を認めた。
Total protease production was compared between control and 1% Maoto extract (p = 0.0032). Error bars indicate the standard deviations for three measurements.
PAO1のcaco-2細胞への侵入性の結果をFigure 5に示す。Controlにおけるcaco-2細胞内へ侵入した菌数の平均値は5,567（CFU/mL）であり，1%麻黄湯添加における侵入菌数の平均値は37（CFU/mL）であった（p < 0.05）。
Number of bacteria invading caco-2 was compared between control and 1% Maoto extract (p = 0.00094). Error bars indicate the standard deviations for three measurements.
麻黄湯による緑膿菌に対する抗菌活性は報告されていない。今回，微量液体希釈法にて最小発育阻止濃度の測定を行ったが，麻黄湯成分の沈殿や濁りが強かったことから増殖曲線を測定することで抗菌活性を検討した。12時間以降にて麻黄湯添加による抗菌活性は認められなかったが，緑膿菌は様々な病原因子を産生し緑膿菌感染症の重症化や難治化に関与することから，薬剤への耐性化や病原因子を減弱させる薬剤や成分を探索していくことは重要と考える。
そこで，抗菌薬耐性化に関与するbiofilmやそのbiofilm形成過程に関与するmotility，宿主免疫系の回避の一助となるtotal protease，病原性が相互的に作用する細胞侵入性について検討を行った。biofilmは，緑膿菌が宿主免疫系や抗菌薬を回避する方法の一つであり1)，菌体外多糖などで構成される三次元構造をもった細菌の共同体である。biofilm内の細菌には，抗菌薬が浸透しづらく，白血球などの貪食も受けにくいことから，biofilm形成能を低下させることは重要である。このbiofilm形成過程では鞭毛を用いて液体内を移動するswimming motility，半固体表面を移動するswarming motility，Type 4 pili線毛を用いて固体表面を移動し微小コロニーを形成するtwitching motilityが関与する1),3)。その中でも，今回の検討で1%麻黄湯添加による抑制効果を示したswarming motilityは，biofilm形成やbiofilmからの離脱による感染層の広がりや環境汚染17)，宿主細胞への侵入性2)に関与する重要な病原因子である。また，proteaseは，自己鞭毛成分や宿主補体などの溶解による宿主免疫系の回避，腸上皮のムチン層粘性の低下による細胞侵入性の一助となる2),4),5)。
また，緑膿菌PAO1の各病原因子の検討を行う前の基礎的検討として増殖速度の検討を行った。麻黄湯の濃度1%では，12時間以降の増殖曲線に差がみられず，麻黄湯による混濁や着色が各種病原因子の測定に影響が少なかったことから，各種病原因子への検討は1%麻黄湯を用いた。生菌数の差のない12時間以降であれば緑膿菌の菌数の差による病原因子への影響は否定できることから各種病原因子の判定は18時間以降で行った。
漢方薬やシナモンオイルによる，緑膿菌PAO1のbiofilm形成能とswarming motility，total protease産生の抑制については複数の報告がある11),18)。1%麻黄湯添加によりswarming motilityとtotal protease産生は抑制したが，biofilm形成能は抑制しなかった。biofilm形成過程には，3つのmotilityが関与する。biofilm形成能に抑制が認められなかったのはswimming，twitching motilityにて抑制が認められなかったことやmotility以外の要素である菌体外多糖の産生能などの関与が大きい可能性が示唆された。また，線毛運動であるtwitching motilityでは1%麻黄湯添加による抑制が認めらなかったことから，1%麻黄湯は線毛運動の抑制効果はないことが考えられる。そして，抑制の認められたswarming motilityと同じ鞭毛運動であるswimming motilityでも抑制が認められなかったことから，麻黄湯は運動をコードする遺伝子のうち特定のものを抑制する可能性が考えられ，今後，検討を深めていく必要がある。
また，桂皮と主成分が同じであるシナモンオイルにてswarming motility，total protease，biofilm形成能の抑制が，甘草と主成分が同じグリチルリチンにて増殖速度，biofilm形成能の抑制が報告されていることから，桂皮や甘草が抑制に関与する可能性も高いと考えられる11),19)。しかし，biofilm形成能に関しては，既報と異なる結果となったことから，生薬の組み合わせによる拮抗作用の可能性も示唆される。
1%麻黄湯添加によりPAO1の細胞侵入性が抑制されたという結果から，麻黄湯は緑膿菌の細胞内への侵入能低下に関与する可能性が示唆された。これは，細胞侵入性に関与する鞭毛運動であるswarming motilityを抑制したことやムチン層の粘性の低下により細胞侵入性を促進させるtotal proteaseを抑制したことによると考えられる。また，麻黄湯成分の物理的な粘稠性が各種病原因子の抑制に関与した可能性も考えられることから，今後，さらに検討を深めていく必要がある。
麻黄湯は生薬である麻黄，杏仁，桂皮，甘草を含有する漢方薬であることから，各種病原因子の抑制に関与した生薬や成分，さらに，マウスなどを用いてin vivoにおける麻黄湯の効果を検討していく必要がある。
本研究では，麻黄湯を用いてin vitroにおける緑膿菌標準株であるPAO1の病原因子への影響についての基礎的研究を行った。1%麻黄湯添加により，増殖速度，swarming motility，total protease産生能，細胞への侵入性において，有意な抑制効果を認めた。今後，研究を深めていく上での基礎的データとなるものと考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本論文の投稿に際して，漢方薬をご提供下さいましたツムラ株式会社に深謝申し上げます。
