トルエンの代謝産物である尿中の馬尿酸（hippuric acid; HA）測定は，有機溶剤健康診断の中で最も対象者が多く，最低6ヶ月に1回の検査実施が義務化されている。現在，HA濃度はHPLC法によって測定されているため処理能力が低く，かつ特殊装置と技術が要求される。今回，HA測定の迅速性と簡便性を目的として，汎用生化学自動分析装置で測定できる酵素法試薬を考案した。本試薬をJCA-BM8040G（日本電子）装置で性能確認したところ，精確性，直線性，最小検出感度等の基礎性能およびHPLC法との相関性結果は良好，かつ類似構造のメチル馬尿酸の影響を受けないことから実用性の高い試薬と考える。
Hippuric acid (HA) is excreted in urine as a metabolic product of toluene, and HA measurement is the most popular health diagnostic test for special workers using organic solvents. This test is required by Japanese law to be carried out at least once every six months. Currently, HA is measured by high-performance liquid chromatography (HPLC). Measurement by HPLC requires a special instrument, and the test measurement output per unit time is smaller owing to batch processing. For high-speed processing and labor saving, we developed a new enzymatic reagent for HA measurement using an open-type automatic analyzer. The HPLC method was studied using JCA-BM8040G (JEOL, Tokyo, Japan), a clinical biochemistry analyzer, and we found that this method showed good accuracy, linearity, and sufficient LOD. In addition, there is a good correlation between the HPLC method and the absence of influence by methyl hippuric acid, which has a similar structure to HA. These findings suggest the usefulness of this new method for health diagnostics.
生体内でトルエンは肝臓で安息香酸に代謝され，さらにグリシン抱合を受け馬尿酸（hippuric acid; HA）として尿中に排出される1),2)（Figure 1）。トルエン曝露時間と尿中に排出される馬尿酸の濃度には高い正の相関があると報告されており，トルエン使用作業者の健康と作業環境の保全のために重要な検査となっている3),4)。なお，馬尿酸は安息香酸を含む清涼飲料水，果物などからも生成されるため，トルエン曝露を受けていない人からも検出される。
First, cytochrome P450 converts toluene into benzyl alcohol in the liver. Then, benzyl alcohol is oxidized to benzoic acid by alcohol dehydrogenase. Finally, hippuric acid is yielded after condensation of benzoic acid and glycine.
労働安全衛生法5)では，定められた業務あるいは特定の物質を取り扱う労働者を対象とした特殊健康診断（特殊健診）が事業者に義務づけられている。尿中HAはトルエン取扱者を対象に最低6ヶ月に1回の検査実施が義務化された検査項目で，有機溶剤健康診断の中で最も対象者が多い6)。現在，HA測定の多くはHPLC法で実施されているが，HPLC法の処理速度は1日で500検体程度であり，特殊健診時で大量の検体を処理する場合には数日の検査日数を要する。また測定後，クロマトグラムにて標準液と各検体の馬尿酸ピークの保持時間および形状の一致性を確認する必要があるため，結果報告までに時間を要する。
今回，HA測定において迅速性と簡便性を目的として，汎用生化学自動分析装置で測定できる酵素法を原理とするHA測定試薬を考案し，その性能を評価したので報告する。
本論文の要旨は，第67回日本医学検査学会（2018年5月，浜松市）の一般演題で発表した。
測定原理は5段階の酵素反応から成り立っており，①HAにHippurate hydrolaseを作用させてベンゾエイトを生成，②ベンゾエイトにベンゾエイトCoAリガーゼを作用させてAMPを生成，③AMPにアデニレートキナーゼを作用させてADPを生成，④ADPにピルビン酸キナーゼを作用させてピルビン酸を生成，⑤ピルビン酸に乳酸脱水素酵素を作用させて乳酸を生成する過程で，NADHが酸化されてNAD+になった際の340 nmにおける吸光度の減少量からHA濃度を算出した（Figure 2, 3）。各試薬成分および濃度をTable 1に示した。
HA quantification consists of five enzymatic reactions. HA concentration is calculated from decrease of absorbance at 340 nm, which is caused by NADH oxidation to NAD+ through pyruvic acid reduction, in the last step.
The second reaction causes a decrease in absorbance, and the hippuric acid concentration is determined by the 2-point end method.
| Reagent 1 | Tris buffer (pH 9.5) | 20 mmol/L |
| Adenosine triphosphate (ATP) | 2 mmol/L | |
| Magnesium chloride | 2 mmol/L | |
| Phosphoenolpyrbic acid (PEP) | 2 mmol/L | |
| NADH | 0.5 mmol/L | |
| Hippurate hydrolase | 3 U/mL | |
| Lactate dehydrogenase (LD) | 12 U/mL | |
| Reagent 2 | HEPES buffer (pH 7.0) | 10 mmol/L |
| Zinc nitrate | 0.5 mmol/L | |
| Coenzyme A (CoA) | 4 mmol/L | |
| Benzoate ligase | 20 U/mL | |
| Adenylate kinase | 15 U/mL | |
| Pyruvate kinase | 30 U/mL |
Reagent 1 consists of ATP, Magnesium chloride, PEP, NADH Hippurate hydrolase and LD in Tris buffer and reagent 2 consists of Zinc nitrate, CoA, Benzoate ligase, Adenylate kinase and Pyruvate kinase in HEPES buffer. The concentration of each constituent is in the Table 1.
JCA-BM8040G生化学自動分析装置BioMajestyTM（日本電子株式会社）とした。
3） 測定パラメータ検体1.5 μL（前希釈機能で5倍希釈された検体），第1試薬60 μL，第2試薬20 μL。測定波長は主波長340 nm，副波長694 nmとした。
4） 標準液自家調製したHA水溶液濃度0.000 g/Lと2.000 g/Lの2濃度とした。
5） 分析方法2ポイントエンド（検体盲検補正）法とした。
2． 比較対照法装置として汎用HPLC Prominence（株式会社島津製作所），カラムにTSKgel Super-ODSカラム（東ソー株式会社）を用いたHPLC法とした。
3． 実験方法 1） 同時再現性HA濃度が低濃度（0.5 g/L付近），中濃度（1.5 g/L付近），高濃度（2.8 g/L付近）の尿検体を各20回測定し，平均値，変動係数（CV）を求めて精度を確認した。
2） 正確性全国衛生労働団体適合性主催の外部精度管理調査試料6種類を各3回測定し，目標値と各平均値および両者の割合（各平均値／目標値 × 100）を求め，目標値 ± 5%以内を正確性ありとした。
3） 直線性プール尿試料にHAを添加した5 g/L以上の高濃度HA検体を，同プール尿試料で10段階希釈した各検体を2回測定し，希釈系列0/10と1/10を結ぶ線を延長し，各希釈系列の測定値と理論値との差が±5%以内を直線性ありとした。
4） 検出限界および定量限界HA濃度0.2 g/L以下の尿検体を，生理食塩水（生食）で10段階希釈した各希釈尿試料を20回測定し，生食の平均値 + 3SDと各希釈尿試料の平均値 − 3SDが重ならない最低濃度を検出限界とした。また，各検体の20回測定のCVが10%以下となる最低濃度を定量限界とした。
5） 共存物質の影響プール尿試料に共存物質のヘモグロビン（Hb）50 mg/dL，ビリルビンF（Bil-F）21.1 mg/dL，ビリルビンC（Bil-C）21.1 mg/dL，乳び1,490 FTU，アスコルビン酸500 mg/dL，尿酸100 mg/dL，尿素5,000 mg/dL，グルコース1,000 mg/dL，クレアチニン500 mg/dL，p-メチル馬尿酸3 g/Lとなるようにそれぞれ溶解し，同プール尿試料で各共存物質添加尿を5段階希釈（1/5～5/5）した各検体のHA濃度を2回測定し平均値を求めた。プール尿試料のHA濃度を2回測定した平均値を基準HA値として，各検体の5段階希釈のHA平均値と基準HA値との差が±10%以内を影響なしとした。尚，Hb，Bil-F・Cおよび乳び試料は，干渉チェック・Aプラス（シスメックス株式会社）を用いた。
6） 酵素法と比較対照法との相関試験患者情報が匿名化された被検尿100例を，酵素法と比較対照法で測定し，二法の相関性を回帰式，相関係数（r）から評価した。
7） 尿の遠心操作の有無による影響馬尿酸濃度が0.3 g/L以上で，目視で混濁を認めた混濁尿10種の遠心前・後のHA値を，対応のある2標本t検定で評価した。
なお，本研究は倉敷芸術科学大学倫理審査の承認を得て行い（承認番号：19-06），尿検体はファルコバイオシステムズに尿中馬尿酸の依頼があり，測定および報告済みの残余検体を，株式会社ファルコバイオシステムズの個人情報保護法に基づき，承諾を得て使用した。
3濃度付近の尿検体を20回測定した時の平均とCVは，低濃度が平均0.5019 g/LでCV 0.97%，中濃度が平均値1.4888 g/LでCV 0.78%，高濃度が平均値2.8080 g/LでCV 0.72%であった（Table 2）。
| Level | Low | Middle | High |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.508 | 1.481 | 2.825 |
| 2 | 0.508 | 1.491 | 2.790 |
| 3 | 0.501 | 1.501 | 2.817 |
| 4 | 0.508 | 1.492 | 2.801 |
| 5 | 0.504 | 1.492 | 2.834 |
| 6 | 0.499 | 1.488 | 2.784 |
| 7 | 0.499 | 1.496 | 2.786 |
| 8 | 0.494 | 1.482 | 2.806 |
| 9 | 0.496 | 1.478 | 2.821 |
| 10 | 0.498 | 1.483 | 2.802 |
| 11 | 0.499 | 1.465 | 2.824 |
| 12 | 0.499 | 1.484 | 2.821 |
| 13 | 0.503 | 1.503 | 2.765 |
| 14 | 0.513 | 1.474 | 2.812 |
| 15 | 0.506 | 1.495 | 2.815 |
| 16 | 0.496 | 1.499 | 2.788 |
| 17 | 0.503 | 1.468 | 2.813 |
| 18 | 0.499 | 1.496 | 2.813 |
| 19 | 0.503 | 1.508 | 2.790 |
| 20 | 0.502 | 1.499 | 2.853 |
| Mean (g/L) | 0.5019 | 1.4888 | 2.8080 |
| SD (g/L) | 0.00487 | 0.01168 | 0.02030 |
| CV (%) | 0.97 | 0.78 | 0.72 |
The mean and coefficient of variation of the three urine samples measuring 20 times were 0.5019 g/L and CV 0.97% for low concentration, 1.4888 g/L and CV 0.78% for middle concentration, and 2.8080 g/L and CV 0.72% for high concentration.
全国衛生労働団体適合性主催の精度管理調査試料6種類の目標値と各平均値および両者の割合（%）は，試料1が0.52 g/L，0.5143 g/L，−1.10%，試料2が1.11 g/L，1.0890 g/L，−1.89%，試料3が1.10 g/L，1.0803 g/L，−1.79%，試料4が0.81 g/L，0.7970 g/L，−1.60%，試料5が2.46 g/L，2.4343 g/L，−1.04%，試料6が2.56 g/L，2.5197 g/L，−1.57%と全て5%以内となり正確性があった（Table 3）。
| Sample | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Target (g/L) | 0.52 | 1.11 | 1.10 | 0.81 | 2.46 | 2.56 |
| 1 | 0.519 | 1.080 | 1.088 | 0.802 | 2.447 | 2.524 |
| 2 | 0.519 | 1.103 | 1.080 | 0.784 | 2.440 | 2.510 |
| 3 | 0.505 | 1.084 | 1.073 | 0.805 | 2.416 | 2.525 |
| Mean (g/L) | 0.5143 | 1.0890 | 1.0803 | 0.7970 | 2.4343 | 2.5197 |
| Bias from Target (g/L) | −0.0057 | −0.0210 | −0.0197 | −0.0130 | −0.0257 | −0.0403 |
| Bias from Target (%) | −1.10 | −1.89 | −1.79 | −1.60 | −1.04 | −1.57 |
The difference between target values and the average values of the six external quality control samples were −1.10% for sample 1, −1.89% for sample 2, −1.79% for sample 3, −1.60% for sample 4, 1.04% for sample 5 and −1.57% for sample 6.
希釈系列1/10～9/10までの測定値と理論値の差は全て±5%以内となり，理論値の5.37 g/Lまで直線性があった。希釈系列10/10は理論値5.91 g/Lに対し測定値5.50 g/Lとなり，差が−6.9%であった（Figure 4）。
HA is added to the pool urine sample and adjusted to a concentration of 5 g/L or higher to make a high concentration sample of HA. The pooled urine sample was diluted by 10 steps so that the high concentration sample was linearly diluted with the pooled urine sample.
生食の平均値 + 3SDと各検体の平均値 − 3SDが重ならない検出限界濃度は0.038 g/Lであった（Figure 5）。各検体の20回測定でCV 10%以下となる実効感度濃度は0.065 g/Lであった（Figure 6）。
Measuring a 10 dilution samples series, Limit of Detection (LOD) was determined as 0.038 g/L which is the least value whose average −3SD did not overlap saline’s average +3SD.
Measuring a 10 dilution samples series, Limit of Quantification (LOQ) was determined as 0.065 g/L which is the least value whose CV was less than 10%.
Hb，Bil-F，Bil-C，乳び，アスコルビン酸，尿酸，尿素，グルコース，クレアチニン，p-メチル馬尿酸の共存物質10種類のHA測定への影響は，各共存物質の最大濃度まで基準HA値 ± 10%以内となり，影響はなかった（Figure 7a–j）。
The effects on HA measurement of 10 types of co-existing substances were examined, Hb, Bil-F, Bil-C, chyle, ascorbic acid, uric acid, urea, glucose, creatinine, and p-methylhippuric acid. The HA measurement values were all within +/−10% of the reference up to maximum concentration of each substance, therefore, the no effects of co-existing substances were found.
比較対照法を（x），酵素法を（y）として相関性をみたところ，回帰式はy = 1.043x − 0.001，相関係数r = 0.997となり，良好な一致性と相関性があった（Figure 8）。
When the correlation was evaluated using the comparative method (x) and the enzyme method (y), the regression equation was y = 1.043x − 0.001 and the correlation coefficient r = 0.997, which was good consistency and correlation.
混濁尿10種について遠心前・後のHA測定値を，対応のある2標本t検定で解析したところp = 0.982となり，遠心前・後に有意差がなかった（Figure 9）。
10 samples of turbid urine were measured before and after centrifugation. The resulting HA values were analyzed by paired-samples t-test and there were no significant difference before and after centrifugation.
酵素法による尿中馬尿酸試薬の基礎性能をみたところ，同時再現性，正確性，直線性，検出感度，定量感度，共存物質の影響およびHPLC法との相関性において，すべて良好な結果であった。これらから，本酵素法が馬尿酸に特異的に反応していること，検出波長が紫外部の340 nmで共存物質の影響を受けにくいこと，目的物質のHA濃度が約1 g/L（約5.6 mmol/L）と血中グルコース同等の高濃度であり，検体量を少なくできたことから，精度と正確さを備えた方法になったと思われる。また，混濁尿において，遠心の前・後の測定値に有意差がなかったことから，遠心なしで測定しても問題ないと思われた。
有機溶剤中毒予防規則によって，トルエン曝露の多少を判定するための目安として定められた尿中馬尿酸の「分布区分」は，1.0 g/L以下が分布1，1.0 g/L超～2.5 g/L以下が分布2，2.5 g/L超が分布3であり，本酵素法はこれらの区分を十分に区別できる試薬と考える。
我々が考案した汎用生化学自動分析装置対応の酵素法による尿中馬尿酸試薬は，基礎性能が良好かつHPLC法の測定値と一致していた。本試薬は医療施設にある汎用生化学自動分析装置に搭載することで，尿中馬尿酸濃度を迅速かつ簡便に測定できる有効性の高い試薬になると考え，今後，実用化試薬に向けて試薬調製後の安定性，装置内にセットした際の安定性などの頑健性試験を行う予定である。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本研究は，筆者が顧問を務める株式会社ファルコバイオシステムズ総合研究所の協力を得て実施した。
