今回，1971年のFFPE検体から腫瘍症例を選びp53免疫染色を施行，強陽性例の検体からDNA，RNAを抽出し，濃度及び分解度を測定した。さらに，PCR法にてp53遺伝子のExon 4～7領域で増幅の有無を確認した。増幅の認められた症例についてはシークエンス解析を行った。DNAは濃度60～330 ng/μL，OD比260/280で1.4～1.8，RNAは濃度450～1,145 ng/μL，OD比260/280で1.8～1.9で抽出することができた。DIN値は1.1～1.7，RIN値は1.4～2.4であった。PCRは200～300 bpでは増幅することができなかったが，おおむね170 bp以下に分けることでExon 5-1，5-2は6/6症例，Exon 7-1で6/6症例，7-2で5/6症例増幅が認められた。サンガー法にて，増幅を認めたすべてのサンプルで塩基配列を解読することができ，複数個所で変異を確認することができた。50年前のFFPE検体からでもある程度のDNA，RNAが抽出できたが，品質的には経年による核酸の分解がより進んでいたことがわかった。それでも，条件次第でPCRによる増幅，さらにはシークエンス解析も可能であったことから，長期保管FFPEブロックの分子病理学的有用性は大きいと考える。したがって，FFPE検体は長期保管（半永久的）することが望まれる。
AIM: In ordinary community hospitals, how to store and use archives of histopathological specimens is usually up to their policies, and there are no general rules for the disposal, storage, and usage of such specimens. In this study, we evaluated the feasibility of DNA and RNA analyses of 50-year-old formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue blocks. METHODS: DNA and RNA were extracted from 50-year-old FFPE tissue blocks immunohistologically positive for TP53, and the concentrations and degradation of DNA and RNA were analyzed. Polymerase chain reaction (PCR) analysis of p53 exons 4 to 7 was conducted, and in the samples that yielded PCR products, DNA sequencing (Sanger sequencing) was conducted. RESULTS: The concentrations of DNA and RNA were 60–330 ng/μL and 450–1,145 ng/μL, and the OD ratios of DNA and RNA at 260 nm/280 nm were 1.4–1.8 and 1.8–1.9, respectively. The DNA and RNA integration numbers were 1.1–1.7 and 1.4–2.4, respectively. PCR products were successfully obtained when using primers covering 170 base pairs (bps) and less, such as the first half of exon 5 (successful in 6 out of 6 cases), the last half of exon 5 (successful in 6 out of 6 cases), and the first half of exon 7 (successful in 6 out of 6 cases); they were not successfully obtained when using primers covering 200–300 bps. Several p53 mutations were identified. RESULTS: Although degraded, DNA and RNA could be extracted from 50-year-old FFPE tissue blocks, and archived blocks could be used for research and training in a community hospital. Determination of better storage conditions would be a challenge to be addressed in future studies.
組織の固定として10%ホルマリン水溶液をドイツの医師Blumが使用（1893年）してから120年以上が経過しており，今日では病理組織学分野における固定液として最も広く用いられている1)。その結果，長期にわたる保存が可能となっているわけであるが，当院でも1971年（昭和46年）病理診断科開設以来，病理診断報告書とホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded; FFPE）検体は全て院内で保管している2),3)（Figure 1）。われわれは，50年前のFFPE検体を用いて免疫染色，FISH法を行い，診断に適した標本作製が可能であることを確認（Figure 2）し，第70回医学検査学会にて報告した2)。
a：FISH（CEP12 (Orange) & CEP17 (Green)），b：FISH（CEP8 (Green)）
シグナルは容易に観察可能であり，異数性も確認できた。
c：HER2-IHC，d：HER2-FISH
IHC強陽性症例でFISHを施行すると，HER2遺伝子の増幅が確認できた。
一方，病理組織からのDNA抽出は通常新鮮材料を用いて行われるが，生材料が採取できないあるいは過去の症例について解析しようとする場合には，FFPE検体より抽出することになる。1985年にGoelzら4)によってFFPE検体からのDNA抽出が報告されて以来，分子病理学は急速な進展を見せている5)。次世代シーケンス（next generation sequencing; NGS）においては，10～20年前のFFPE検体でも品質に問題なくシーケンスデータが得られたという報告がある6),7)。その反面，3年以下の保存と9～12年の保存では抽出したDNAの断片化に差があった，との報告もある8)。すなわち，保管期間において核酸の経年劣化は避けられないという結果であった。そこで今回は，50年前のFFPE検体から核酸抽出，DNA，RNAの品質分析，シーケンスによる遺伝子解析を試み，今後の有用性について追加検討したので報告する。
1989年に最初のp53変異が報告されて以来9)，p53遺伝子変異は多くの癌に認められており10),11)，p53（DO7）染色強陽性で高い遺伝子変異率を示す，また77.3%には遺伝子変異が認められているといった報告もある12),13)。さらには，日常的にp53の免疫染色が行われていることから，今回の遺伝子解析のアプローチにはp53を用いた。まず，1971年のFFPE検体の中から，外見的に損傷の少ないと思われる腫瘍症例を20症例選び薄切，ヘマトキシリン・エオジン（hematoxylin-eosin; HE）染色を行った。次に，p53（DO7）の免疫染色を行い，強陽性（核の濃染）（Figure 3）であった6例（胃癌2例，食道癌，乳癌，骨腫瘍，下部食道噴門部癌）の検体についてDNA，RNAを抽出後，p53遺伝子変異報告頻度の高いホットスポットであるExon 4～7領域のPCR法を行い，増幅の認められた症例についてはサンガーシークエンス解析を行った。
核が濃染している強陽性症例
10 μm × 5枚を薄切し，Gene Read DNA FFPE Kit（QIAGEN）にてDNAを，AllPrep DNA/RNA抽出キット（QIAGEN）にてRNAを抽出し，NanoDrop（超微量分光光度計）を用いて吸光度を計測した。また，Tape Station 4150（Agilent）にてDNAとRNAの分解度であるDIN値（DNA Integrity Number），RIN値（RNA Integrity Number）を測定した。
2） PCR法p53遺伝子のExon 4～7領域をGeneAtlasE02（astec）によりPCR法で増幅させ，アガロースゲル電気泳動にてバンドの検出を確認した。また，増幅を認めなかったものについてはプライマーを分割して行った（Table 1）。
| Component | Vol./Sample (μL) |
|---|---|
| Template DNA | 1.0 |
| 2× PCR Buffer for KOD FX Neo | 10.0 |
| 2 mM dNTP | 4.0 |
| 25 μM forward primer | 0.2 |
| 25 μM reverse primer | 0.2 |
| KOD FX Neo | 0.2 |
| Dw | 4.4 |
| Total | 20.0 |
| Step 1 | 94°C | 2 min. |
| Step 2 | 98°C | 10 sec. |
| 60°C | 30 sec. | |
| 68°C | 30 sec. | |
| Step 3 | 4°C | Hold |
| Exon | Forward primer (5'->3') | Reverse primer (5'->3') | size |
|---|---|---|---|
| 4 | ACC TGG TCC TCT GAC TGC TC | TTG AAG TCT CAT GGA AGC CAG | 355 |
| 5 | TTG TGC CCT GAC TTT CAA CTC | ACC AGC CCT GTC GTC TCT C | 263 |
| 6 | TCA GAT AGC GAT GGT GAG CAG | GGA GGT CAA ATA AGC AGG | 313 |
| 7 | CAC ATC TTG GGC CTG TGT TAT C | GGG TCA GAG GCA AGC AGA G | 204 |
| Exon | Forward primer (5'->3') | Reverse primer (5'->3') | size |
| 4-1 | TGA CTG CTC TTT TCA CCC ATC | AGA AGA TGA CAG GGG CCA G | 218 |
| 4-2 | ACC AGC AGC TCC TAC ACC G | TTG AAG TCT CAT GGA AGC CAG | 187 |
| 5-1 | TTG TGC CCT GAC TTT CAA CTC | TGC TTG TAG ATG GCC ATG G | 162 |
| 5-2 | TGC AGC TGT GGG TTG ATT C | ACC AGC CCT GTC GTC TCT C | 168 |
| 7-1 | CTC ATC TTG GGC CTG TGT TAT C | CCA GTG TGA TGA TGG TGA GG | 128 |
| 7-2 | GTA ACA GTT CCT GCA TGG GC | GGG TCA GAG GCA AGC AGA G | 136 |
PCR産物をExo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit（New England Biolabs）を用いて精製した。Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い，3130xl Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific）にてサンガー法によるシークエンス解析を行った。
DNAはOD比A260/A280で1.4～1.8，濃度60～330 ng/μL，RNAはOD比A260/A280で1.8～1.9，濃度450～1,145 ng/μLで抽出することができた（Table 2）。DIN値は1.1～1.7，RIN値は1.4～2.4であった（Figure 4）。PCRはExon 4（355 bp），5（263 bp），6（313 bp）においていずれも増幅することができなかった。Exon 7（204 bp）は2/6症例で増幅が認められた。そこでExon 4と5と7については2分割（Exon 4-1：218 bpと4-2：187 bp，Exon 5-1：179 bpと5-2：168 bp，Exon 7-1：128 bpと7-2：136 bp）にして行ったところ，Exon 4-2で2/6症例，Exon 5-1と5-2は6/6症例，Exon 7-1で6/6症例，Exon 7-2で5/6症例において増幅が認められた。プライマーのサイズを概ね170 bp以下にすることが必要であった（Figure 5）。サンガー法にて増幅を認めたすべてのサンプルで配列を解析することができた。また，複数の検体で変異を確認することができ，p53データベース（http://tp53.isb-cgc.org）14)により転写活性化能も評価することができた【Exon 5で（c.464 C>A: p.Thr155Asn, non-functional）（c.541C>T: p.Arg181Cys, partially functional），Exon 7で（c.733G>A: p.Gly245Ser, non-functional），（c.705_709 del）】（Figure 6a, b）。
| Sample | DNA | RNA | ||
|---|---|---|---|---|
| concentration (ng/μL) | 260/280 OD ratio | concentration (ng/μL) | 260/280 OD ratio | |
| a | 195.13 | 1.78 | 446.68 | 1.84 |
| b | 329.07 | 1.37 | 785.82 | 1.79 |
| c | 80.89 | 1.80 | 547.70 | 1.91 |
| d | 64.36 | 1.83 | 458.56 | 1.93 |
| e | 126.63 | 1.83 | 1,144.57 | 1.94 |
| f | 119.54 | 1.76 | 563.15 | 1.88 |
DIN値は1.1～1.7，RIN値は1.4～2.4であり，核酸の分解はかなり進んでいた。
Exon 5と7について2分割（Exon 5-1：179 bpと5-2：168 bp，Exon 7-1：128 bpと7-2：136 bp）にして行ったところ，Exon 5-1と5-2は6/6症例，Exon 7-1で6/6症例，Exon 7-2で5/6症例において増幅が認められた。
Sequencing analysis of exon 5 and 7 of the p53 gene. Case E was detected a heterozygous variant of c.541T>C of exon 5.
近年，癌治療の分野では個別化治療が進んでおり，分子標的薬の選択や治療効果の予測において，過去のFFPE検体を用いる機会が増加している15)。当院でも遺伝子変異解析等の追加検査で，数年前のFFPE検体から再薄切した未染色プレパラートを用いることも少なくない。現在，FFPE検体保管に関する法的規制やガイドラインはなく，保管状況は施設ごとさまざまである。病理学会は，病理解剖承諾書記載事項として，ブロックは半永久的に保管されることを提言している。また，FFPE検体は保険医療機関および保険医療養担当規則（昭和32年4月30日）に規定される「診療に関する諸記録」とみなすべきであって，一定期間，病院ないし施設で保管の義務を有する，とも提言しており16)，法的根拠は曖昧である。カルテやその他の報告書等の保管期間は5年とされており，FFPE検体も「診療に関する諸記録」として5年以上の保管義務はないようにも受け取れる。また，日本病理学会では「ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程」を発行しており，次世代シーケンシングに基づく臨床がんゲノム検査には，作製後3年以内のFFPEブロックを使用することを推奨している17),18)。それでも，多くの病院，大学では廃棄することなく保管しているのが現状である。しかし，その一方で古いFFPE検体では核酸の経年による品質低下は避けられないといった報告も数多くある8),12),19)。そこで今回，50年前のFFPE検体での有用性について検討した。
その結果，50年前のFFPE検体から抽出されたDNA純度は1.4～1.8，RNA純度は1.8～1.9であり，品質的には想定以上に経年による核酸の分解が進んでいたことが分かった。PCR法では250～350 bp程度のプライマーを用いたが，バンドは得られず，160 bp程度の配列にする必要があった。これは，ホルマリン固定によりDNA，RNAとタンパク質のアミノ基間でクロスリンクが生じ，DNA，RNAが断片化したためと考える。また，260 nmに近い吸光度をもつタンパク，RNAなどの夾雑物の影響も大きかったと考えられた。当院は少なくとも20年前まで，外科手術材料の切り出しは外科医が週1回行っており，過固定FFPE検体が過半数であったと予測される。過剰なホルマリン固定がDNA，RNAのさらなる断片化を招いた可能性は高い。また，非緩衝ホルマリン（酸性ホルマリン）固定液を使用していたと推測され，それも分解が進んだ一因と考える。もとより，50年前当時は，分子病理学的解析という概念はなく，プレアナリシス工程の重要性については今日まで考慮されておらず，ホルマリンの組成，液量，固定時間など厳守されていなかったと思われる。「ゲノム研究用，診療用病理組織検体取扱い規程」によると，DIN値は2.3以上でアンプリコンシークエンスが可能なライブラリ作成が70%以上で可能としている19)。今回のサンプルのDIN値はアンプリコンシークエンシングをするには品質は悪いといえるが，サンガーシークエンシングであれば問題は少なかったと思われる。また近年，FFPE組織から核酸を抽出する際，その方法を比較したところ，phenol-chloroform isoamyl alcohol（PCI）法が10～40年前の症例でも品質の低下は大きかったものの，ハウスキーピング遺伝子でのPCRによる増幅を確認できたという報告もある20)。さらには，長期保存の影響について，ひとつには残留ホルマリンなどの有機化合物の存在があるのではないかと考える。調べる術はないが，50年前当時，プロセッシング（脱水・脱脂・パラフィン浸透）を減圧と加圧を繰り返し行うことを自動化した密閉式自動固定包埋装置もなく，その工程における液の置換が不完全だったことは想像に難くない。このような条件下で作成されたFFPE検体が，熱や湿度などの室内環境の悪い部屋で長期間にわたり保管されたことで品質低下を招いたとも考えられる。一方，われわれはPCRに関与する因子である使用酵素やプライマー設計を含めた構成試薬の選択，増幅条件を設定するなど工夫することで，半世紀にわたり決して良いとはいえない環境下で保管されたFFPE組織ブロックでも，多くの分子病理学的解析ができた。これは，長期的な家族性の病態や歴史的検索が可能であることを証明できたことにくわえ，retrospectiveな研究を行う上で非常に重要であり，有用性は計り知れないと考える。FFPE検体は，世界中の医療機関や検査センターで毎日作製・蓄積されているが，保管や廃棄については法令がないため，それらの状況は施設ごとさまざまである。FFPE検体が遺伝子発現解析に有効活用できることが発見されたのは数十年前のことであり，今後の有効活用に対して国内外での期待は高まっている21)。診療を念頭においた遺伝子パネル解析におけるFFPE検体の利用は，複数の国内の臨床研究プロジェクトで進んでいるが，検体品質には施設間差が認められるとの報告もある22)。
FFPE検体からの遺伝子発現解析技術を確立できれば，過去の膨大な疾患データを生かした研究が可能となり，疾患の治療や予防に大きく貢献できると考える3)。若年性腫瘍であれば，数十年後の再発で，過去のFFPE検体による遺伝子解析が治療に直結する可能性もある。医療機関におけるFFPE検体は良性検体から悪性検体まで膨大であり，保管症例の絞り込みは今後必要になると思われ，ゲノム診療用病理組織検体取扱いには慎重な管理が求められる。われわれ病理検査技師は，病理組織診断のために日々標本作製や管理をしており，確定診断後のFFPE検体の取り扱いに関してはこれまで問われることがなかった。近年，コンパニオン診断に過去のFFPE検体を用いる機会が増えてきていることから，今後は各医療施設でのFFPE検体保管環境は標準化されるべきと考える。がんゲノム医療中核拠点，連携病院でなくてもFFPE検体を拠点病院に提供する機会は今後更に増えていくと予想される。精度の高いコンパニオン診断を行うためには，検体の品質管理は検査結果を左右するため非常に重要である。現在のFFPE検体に関しては規程を遵守した管理がなされていれば，今後の有用性は大きい。しかし，過去の古いFFPE検体については，さらなる品質の低下を防ぐ意味でも症例を限定し核酸抽出まで行い保存するなど，保管に関する議論が今後必要になっていくと思われる。
50年前のFFPE検体からでも，ある程度のDNA，RNAが抽出できたが，品質的には想定以上に核酸の分解が進んでいた。条件次第でPCRによる増幅，サンガー法によるシークエンスで変異の検出も可能であった。長期保管FFPE検体の分子病理学的有用性は大きいと考え，保管環境問題についての議論が今後必要になっていくと思われる。
本研究は，静岡済生会総合病院の倫理・コンプライアンス委員会の承認を得て行った（承認番号No. 2-13-01）。
本論文の要旨の一部は，第71回日本医学検査学会（2022年，WEB開催）において発表した。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
