腹水における腺癌と悪性中皮腫の鑑別に，細胞診，セルブロックの免疫組織化学，セルブロックの透過電子顕微鏡観察を用いた一例を報告する。症例は70歳代女性で腹部膨満を主訴に受診し，画像検査で大量の腹水が認められた。腹水細胞診は，血性背景に核形不整が強く核内封入体と細胞質内空胞を伴う異型細胞を認め，腺癌が疑われた。しかし，オレンジG好性の細胞や異型細胞の辺縁不明瞭化，細胞質の重厚感がみられ，悪性中皮腫を否定できなかった。腹水セルブロックの免疫組織化学では，異型細胞はcytokeratin 7，PAX8，WT-1，ERが陽性で，p53過剰発現を認めたが，Ep-CAM，CEA，claudin 4は陰性であった。中皮マーカーはcalretininとD2-40が部分陽性，HEG1陽性を示した。高異型度漿液性癌を疑ったものの，腺癌に非典型的な染色性もみられたため，セルブロック検体の透過電子顕微鏡観察を行った。微絨毛の形状が最も保持された腫瘍細胞1個を同定し，長い順から10本の微絨毛についてそれぞれ長さ／直径（length-to-diameter ratio; LDR）値を計測した。微絨毛10本のLDR平均値は6.58で，10未満との腺癌の特徴を満たし，高異型度漿液性癌による悪性腹水と診断した。透過電子顕微鏡を用いた腫瘍細胞の微絨毛LDR値の計測は，腺癌と悪性中皮腫との鑑別に有用と考えられた。
We report a case in which cytological diagnosis, cell block immunohistochemistry, and transmission electron microscopy (TEM) were used on a cell block to differentiate between adenocarcinoma and malignant mesothelioma (MM) in ascites. A woman in her 70s came to our hospital with abdominal distention, and a large number of ascites were found in an imaging examination. Ascites cytology showed atypical cells with irregular nuclear shapes, nuclear inclusion bodies, and intracytoplasmic vacuoles on a hematogenous background, suggesting high-grade serous carcinoma (HGSC) of the female genital tract. However, MM could not be ruled out owing to the presence of squamoid orangeophilic cells and atypical cells with marginal obscuration and abundant cytoplasm. The immunohistochemistry of the ascites cell block showed that the atypical cells were positive for cytokeratin 7, PAX8, WT-1, and ER, and overexpressed p53. Ep-CAM, CEA, and claudin 4 were negative. Mesothelial markers were partially positive for calretinin and D2-40 and positive for HEG1. We performed a TEM observation of the ascites cell block after obtaining the immunohistochemical results. A tumor cell with a retained microvillus shape was identified, and the length-to-diameter ratio (LDR) was measured for each of the 10 microvilli from the longest to the shortest parts. The mean LDR of the 10 microvilli was 6.58, which was characteristic of adenocarcinoma with fewer than 10 microvilli, and malignancy in ascites due to HGSC was diagnosed. The LDR measurement of microvilli with TEM was considered useful for differentiating HGSC from MM in ascites.
腺癌と悪性中皮腫は手術の術式や化学療法の使用薬剤など治療法が異なり，両者を鑑別することはとても重要である1)～3)。体腔液細胞診では腺癌と悪性中皮腫の形態像が類似することがあるため4)～6)，近年は体腔液から作製したセルブロックの免疫組織化学的検索が行われている4),7),8)。しかし，免疫組織化学的にも診断困難な例が存在し，特に婦人科領域の高異型度漿液性癌は悪性中皮腫マーカーであるWT-1が陽性となることから，両者の鑑別に難渋する場合がある9)。セルブロックによる免疫組織化学が発達した現在では，体腔液を透過電子顕微鏡により診断する施設は少ないが，腺癌と悪性中皮腫の鑑別には，透過電子顕微鏡による検索が有用であることが報告されている10),11)。今回我々は，腹水の細胞診とセルブロックの免疫組織化学では鑑別に苦慮したため，透過電子顕微鏡を用い高異型度漿液性癌と悪性中皮腫を鑑別した一例を報告する。
患者：70歳代，女性。
主訴：食後のつかえ感。
既往歴：40歳時，子宮癌で子宮全摘（卵巣は温存），術後に放射線照射。
家族歴：前立腺癌（兄）。
現病歴：食後のつかえ感が出現し近医を受診した。腹部膨満あり腹水貯留を認め，精査加療目的に紹介受診となった。血液検査ではCA125が436 U/mL（正常値 < 35 U/mL）と上昇していた。Computed tomography（CT）検査で少量の左側胸水と大量の腹水を認めた。Fluorodeoxyglucose positron emission tomography（FDG-PET）検査では，腹膜に沿って線状或いは結節状に，FDGの集積がSUVmax 3.5と亢進していた。大網にはomental cakeがみられ，FDGがSUVmax 5.5まで上昇していた。経皮的に採取された腹水が病理に提出された。
2． 病理検体処理と標本作製方法細胞診は95%エタノールで固定後，Papanicolaou染色を行った。セルブロック作製にはチューブを使用した遠心分離法を用いた。塗抹標本作製後の沈渣を綿棒チューブに移し10%中性緩衝ホルマリンを加え一晩固定後に3,000 rpm，5分間遠心した。上清を捨て沈渣真上を刃物で切断した綿棒チューブをメッシュ袋またはガーゼで包み包埋カセットに入れ，自動包埋装置で脱水，パラフィン浸透，包埋を行った。免疫組織化学染色は，VENTANA BenchMark ULTRA（Roche Diagnostics），BOND-III染色装置（Leica Biosystems）を使用した。抗体はTable 1に示す。
| Antigen | Clone | Dilution | Source |
|---|---|---|---|
| Cytokeratin 7 | OV-TL 12/30 | 1:100 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA |
| ER | SP1 | Ready to use | Ventana Medical Systems, Inc., Arizona, USA |
| Ep-CAM | Ber-EP4 | Ready to use | Cell Marque Corporation, CA, USA |
| CEA | COL-1 | Ready to use | Nichirei Biosciences INC., Tokyo, JP |
| TTF-1 | SPT24 | Ready to use | Leica Biosystems, Nussloch, DE |
| Claudin4 | EPRR17575 | 1:400 | Abcam plc, Cambridge, UK |
| PAX8 | ― | 1:100 | Proteintech Group, Inc., IL, USA |
| WT-1 | 6F-H2 | Ready to use | Cell Marque Corporation, CA, USA |
| D2-40 | D2-40 | 1:50 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA |
| Calretinin | CAL6 | Ready to use | Leica Biosystems, Nussloch, DE |
| HEG1 | SKM9-2 | Ready to use | Nichirei Biosciences INC., Tokyo, JP |
| BAP1 | C-4 | Ready to use | Nichirei Biosciences INC., Tokyo, JP |
| p16 | E6H4 | Ready to use | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany |
| p53 | DO-7 | Ready to use | Leica Biosystems, Nussloch, DE |
セルブロック電子顕微鏡標本は以下のように作製した。1,500 rpm，5分の遠心後，buffy coatを崩さないよう上清を除去し，2.5%グルタールアルデヒドで90～120分固定（前固定）した。固定後，遠心管からbuffy coatを剥がし1 × 1 mm大に細切した。0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.2）で3回（各15分）洗浄し，1%オスミウム酸液で90分間固定（後固定）した。蒸留水でオスミウム酸液を軽く洗浄し50%，70%，90%，95%，100%，100%，100%のエタノール（各15分）で順に脱水した。プロピレンオキサイドで2回（各20分）置換し，エポキシ樹脂で包埋，重合してエポンブロックを作製した。ウルトラミクロトームで0.5～1 μm厚の準超薄切切片を作製し，トルイジン青染色を行い，光学顕微鏡下で腫瘍細胞の有無を確認した。確認後，70 nm厚の超薄切切片を作製し2重染色（電子染色）を行い，透過電子顕微鏡下（日立HT7800）で腫瘍細胞の形態観察とともに微絨毛を同定した。切片中の腫瘍細胞を全て観察し，そのうち最も微絨毛の形状が保持されている腫瘍細胞1個の観察し得る範囲において，微絨毛の数とそれぞれの長さを計測した。Burnsら11)の報告に基づき，基部が明確な微絨毛を対象として，長さは基部から先端まで，または微絨毛がそれ以上追えなくなった部位まで計測した。さらに，長い順から10本の微絨毛について直径（太さ）を計測し，微絨毛の長さ／直径（length-to-diameter ratio; LDR）値を算出した。
Papanicolaou染色標本で，血性背景に核小体明瞭で核形不整を有するN/C比大の異型細胞が乳頭状，孤在性に多数認められた（Figure 1a）。異型細胞は核内封入体と細胞質内空胞が目立っており（Figure 1b），腺癌の特徴と考えられた。一方で多核やオレンジG好性の細胞が散見され，異型細胞は細胞辺縁の不明瞭化，細胞質の重厚感の所見が見出された（Figure 1c）。少数，Hump様細胞も認められた（Figure 1d）。悪性中皮腫を示唆する所見も多く，腺癌との鑑別が細胞所見からは困難であった。
(a) Numerous papillary clusters and solitary cells were observed. (b) Atypical cells with a large nuclear/cytoplasmic ratio had nuclear inclusion bodies and intracytoplasmic vacuoles. (c) Multinucleated cells and squamoid orangeophilic cells were also observed. Atypical cells showed marginal obscuration and abundant cytoplasm. (d) A hump-like cytoplasmic process was observed. Papanicolaou staining: a, ×400; b–d, ×1,000.
Hematoxylin-Eosin（HE）染色標本で，細胞診と同様に核形不整の目立つ異型細胞を認めた（Figure 2a）。腺癌，特に高異型度漿液性癌と悪性中皮腫との鑑別を目的に免疫組織化学を行った（Table 1）。腺癌のマーカーは，cytokeratin 7（Figure 2b）とERが陽性，Ep-CAM（Figure 2c），CEA，TTF-1，claudin 4は陰性であった。PAX8（Figure 2d）とWT-1（Figure 2e）は陽性であった。WT-1以外の悪性中皮腫マーカーは，D2-40（Figure 2f）とcalretinin（Figure 2g）が部分陽性，HEG1（Figure 2h）が陽性であった。BAP1の発現消失所見は得られず，p16は陰性だった。p53（Figure 2i）は80%以上の強発現がみられ過剰発現と判断された。免疫組織化学の結果からは高異型度漿液性癌が疑われたものの，いくつかの腺癌マーカーが陰性で，悪性中皮腫マーカー陽性の所見もみられたため，診断を確定することができなかった。
(a) Papillary clusters and solitary cells were observed (hematoxylin and eosin staining). The atypical cells were positive for CK7 (b) and negative for Ep-CAM (c). PAX8 (d) and WT-1 (e) were positive. D2-40 (f) and calretinin (g) were focally positive for the atypical cells. HEG1 (h) was positive. p53 (i) overexpression was observed. a–i, ×400.
透過電子顕微鏡下では，腫瘍細胞の微絨毛が観察され，細胞質が核内に嵌入した核内細胞質封入体の像が見出された（Figure 3a）。形状が保持された微絨毛は113本認められ，微絨毛の平均LDR値は4.65（最小1.72～最大8.71）であった。微絨毛の長い順から10本についてLDR値を計測し（Figure 3b），その結果をTable 2に示した。微絨毛10本の平均LDR値は6.58と10未満であり，腺癌の特徴を有していた。以上より高異型度漿液性癌と診断した。
(a) Microvilli on the cell surface (arrow) and a nuclear cytoplasmic inclusion (arrowhead) were observed in the tumor cell. (b) Microvilli with a clear base were identified, and the length and diameter of 10 microvilli were measured from the longest to the shortest. a, ×2,000; b, ×25,000.
| Number | Length (nm) | Diameter (nm) | LDR |
|---|---|---|---|
| No.1 | 812.1 | 106.1 | 7.65 |
| No.2 | 805.0 | 109.3 | 7.37 |
| No.3 | 794.3 | 91.2 | 8.71 |
| No.4 | 792.2 | 114.9 | 6.89 |
| No.5 | 737.4 | 97.2 | 7.59 |
| No.6 | 704.3 | 135.4 | 5.20 |
| No.7 | 679.6 | 103.5 | 6.57 |
| No.8 | 655.9 | 98.4 | 6.67 |
| No.9 | 615.1 | 135.5 | 4.54 |
| No.10 | 531.7 | 114.3 | 4.65 |
| Mean | 6.58 | ||
臨床像および病理所見より，卵管あるいは卵巣の漿液性癌腹膜播種と判断された。術前化学療法を行った後に試験開腹術が行われた。漿液性腹水を1,900 mL認め，播種結節が多数みられる癌性腹膜炎を呈しており，骨盤内の観察は難しく卵巣は不明瞭であった。大網が切除され，組織学的に高異型度漿液性癌の像で，卵管あるいは卵巣原発として矛盾しなかった。
組織型が治療選択に関わる腹水貯留の悪性腫瘍症例において，腹水細胞診，腹水セルブロックによる免疫組織化学で診断確定に至らず，透過電子顕微鏡により高異型度漿液性癌と悪性中皮腫とを鑑別した。近年，婦人科系臓器（子宮以外）の高異型度漿液性癌は，卵管采由来とする説が有力であり，卵巣や腹膜原発とされてきた高異型度漿液性癌の大部分は卵管原発である可能性が示されている12)。高異型度漿液性癌が進行し悪性中皮腫と同じような広がりを示した場合，両者の鑑別は臨床的に困難であり，腹水や開腹生検などで細胞診や組織診を行い，組織型を確定する必要がある。
透過電子顕微鏡は，数百倍～数百万倍の倍率まで観察でき，細胞の超微細構造の観察が可能である。体腔液に出現する中皮細胞は，形態学的に上皮細胞との鑑別がしばしば難しく，透過電子顕微鏡観察においても卵管上皮細胞と中皮細胞は類似している13),14)。しかし，腺癌と悪性中皮腫は透過電子顕微鏡観察において鑑別が可能で，LDR値が異なることが報告されており10),11),15)，LDRの平均値が10以上では中皮腫，10未満では腺癌が示唆される10),11)。本症例はLDRの平均値が6.58で腺癌の特徴を呈していた。
Warholら10)やBurnsら11)の報告において，LDR値を計測する上で，対象とする腫瘍細胞数や範囲についての記述はみられない。微絨毛数の記載より当時は撮影した写真上に含まれる限られた領域について計測したと推測される。現在は透過電子顕微鏡下で観察しデジタル下で計測することが可能であるものの，微絨毛の長さと太さが計測可能な超高倍率の状態で，視野を次々に移すことは非常に繊細な作業である。我々は現実的に可能な方法として，最も微絨毛の形状が保持された腫瘍細胞1個を同定し計測の対象とした。Burnsら11)が検討した各症例の微絨毛数は18～60本であるのに対し，本症例は113本の微絨毛について検討しており，LDR値の判定には十分な微絨毛数と考えた。さらに，既報ではLDRの平均値は微絨毛の長い順に5本10)，あるいは10本11)により算出することが強調されている。超薄切切片では微絨毛が切片の平面から見えなくなることがあり11)，形状および長さが保持された微絨毛でLDRの平均値を算出することが，腺癌と悪性中皮腫の鑑別には重要と考えられた。
セルブロック検体を用いた透過電子顕微鏡観察の報告は少ない。しかし，体腔液が十分量の場合は検体採取が生検よりも容易であり，また新鮮検体であれば変性が乏しく，セルブロック検体でも良好な細胞像が得られる15),16)。本症例のように，十分量の新鮮な体腔液から得られたセルブロック検体を透過電子顕微鏡で観察する手法は，腺癌と悪性中皮腫の鑑別に有用と考えられた。セルブロック検体の透過電子顕微鏡を用いた検索における注意点として，観察前の準超薄切切片の光学顕微鏡観察時に，腫瘍細胞か非腫瘍細胞かを十分に検討することが挙げられる15)。セルブロック検体には腫瘍細胞と非腫瘍細胞が混在していることを認識し，腫瘍細胞を観察対象とすることが重要である。
体腔液の細胞診では腺癌と悪性中皮腫の鑑別が形態学的に困難な場合がある4)～6)。一般的に腺癌では核形不整が明らかで，核内封入体は腺癌で認められる17)。本症例も核内封入体が目立っていた。一方で，悪性中皮腫の症例でも核内封入体がみられたことが報告されており18)，必ずしも両者の鑑別は容易ではない。本症例は，多核やオレンジG好性細胞の出現，異型細胞の辺縁不明瞭化，細胞質の重厚感など，悪性中皮腫を疑う所見も出現しており19)，形態像から両者を鑑別することは困難であった。
セルブロック法は検体を固形化することにより免疫組織化学が可能であり，体腔液細胞診の形態診断を補う役割を担っている7),20)～22)。しかし，固定やパラフィンブロック作製の過程で細胞が変性するため，細胞診ほどの詳細な細胞形態の観察は難しい。さらに，免疫組織化学で用いられる染色マーカーは，必ずしも高異型度漿液性癌と悪性中皮腫を区別できるわけではない。Calretinin，D2-40，WT-1は代表的な悪性中皮腫のマーカーであるが，漿液性癌においてもcalretininは31%，D2-40は13%，WT-1は83～100%の症例に陽性である23)。近年報告されている悪性中皮腫マーカーのHEG1も，漿液性癌の18%に陽性との報告もある24)。本症例でも悪性中皮腫マーカーの一部が陽性となった。一方，ER陽性，WT-1陽性，p53の過剰発現の所見は高異型度漿液性癌を示唆するものであったが，代表的な腺癌マーカーであるEp-CAM，CEA，claudin 4は本症例では陰性であった。悪性中皮腫との鑑別は，単独ではなく複数のマーカーを組み合わせるパネル染色が有用とされているものの，本症例は解釈に難渋した。セルブロック法および免疫組織化学の有用性と限界を理解して，診断に用いる必要がある。
本症例は，細胞診，セルブロック検体の免疫組織化学および透過電子顕微鏡における形態観察が重要であった。体腔液では腺癌などの腫瘍細胞とともに，必ず中皮細胞が混在するため，免疫組織学的な陽性細胞の判別は形態像と合わせて行われる。透過電子顕微鏡においても同様で，腫瘍細胞か非腫瘍細胞かの判別を行わなくてはならない。細胞検査士が日常行っている細胞形態を識別する技術は，電子顕微鏡での超微形態的鑑別にも大いに役立つものと考えられる。体腔液など鑑別に苦慮することが予想される症例に対しては，細胞診だけでなく，セルブロック法や透過電子顕微鏡観察，今後はがんゲノム診断も見据えた検体処理を行い，多角的な検索が行えるような対応が求められる。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
