血小板凝集能検査は血小板数低値の際，血小板同士のズリ応力が発生しにくく，血小板凝集能が過小評価となるリスクがある。そこで今回我々は，血小板凝集能検査時に血小板数を同時に評価するための血小板数推算法を開発した。当院で実施した血小板凝集能検査結果1,326検体を対象とし，測定時に得られる光学的パラメータのうち，測定開始時の多血小板血漿（PRP）および乏血小板血漿（PPP）の差（ベースラインPRP-PPP）を推定血小板数の予測因子とした。ベースラインPRP-PPPは血球計数装置で測定したPRP中の血小板数と極めて高い相関性（ρ = 0.924）を示したが，非線形近似であったため，30回ランダム分割サンプリングによる回帰式次数の決定を行った。その結果から二次式による予測モデルを構築した。本推定血小板数予測モデルにより求めた推定血小板数はPRP中の血小板数予測因子と同等の相関係数が得られ，臨床的な閾値である150 × 109/L未満を識別する性能は，AUROC = 0.99，感度70.8%，特異度99.6%と高精度であることが示された。本研究で開発した手法により，血小板数を別途測定することなく，血小板凝集能検査測定時に高精度な推定が可能となった。本法は血小板数減少の影響を考慮した的確な結果解釈を支援するとともに，検査ワークフローを効率化することが期待される。
Conventional platelet aggregation tests, which are performed without adjusting for platelet count, can be underestimated in thrombocytopenic samples. Therefore, knowing the platelet count is crucial for an accurate interpretation of the results. We developed a method to estimate the platelet count simultaneously during the aggregation assay. We analyze 1,326 platelet aggregation test samples. The difference in optical readings between platelet-rich plasma (PRP) and platelet-poor plasma (PPP) at baseline (baseline PRP-PPP) was used as a predictor. This baseline PRP-PPP showed an extremely high correlation (ρ = 0.924) with PRP platelet counts measured by a hematology analyzer, but the relationship was non-linear. Using 30-fo-ld random split sampling, we constructed a predictive model using a quadratic equation. The platelet counts estimated by our model demonstrated a strong correlation comparable to the direct measurements. The model showed high accuracy in identifying counts below the clinical threshold of 150 × 109/L, with an Area Under the Receiver Operating Characteristic (AUROC) curve of 0.99, a sensitivity of 70.8%, and a specificity of 99.6%. Our novel method enables a highly accurate estimation of the platelet count during the aggregation test without a separate measurement. This approach supports a more precise interpretation of results by accounting for the influence of low platelet counts and is expected to improve laboratory workflow efficiency.
血小板凝集能検査において試料中の血小板数は検査結果を判断する重要な因子となる。しかしながら，本邦における現行の診療報酬体系では血小板凝集能検査と血小板数測定が同時算定できない状況にある。臨床において血小板凝集能検査は，先天性血小板機能異常症の診断・重症度評価において中心的な役割を担っているだけでなく1),2)，脳神経外科領域における周術期管理，特に血管内治療として標準化されつつある二剤併用抗血小板療法の効果判定や出血合併症リスク層別化を目的として臨床現場で活用されている3),4)。また，くも膜下出血や外傷性脳損傷では炎症・内因性機序に基づく血小板機能障害が指摘され，術前および術後の止血能評価にも血小板凝集能検査の有用性が報告されている5)。
血小板凝集能検査における標準法は多血小板血漿（platelet-rich plasma; PRP）を用いた透過光度法（light transmission aggregometry; LTA）であり，Bornの報告以来，研究および臨床の両面で広く利用されてきた1),2),6)～8)。さらに現在は，多電極凝集計やVerifyNowなどの前処理が少なく迅速な全血ベースの測定法に加え，ATP放出量測定やフローサイトメトリーによる活性化マーカー解析など，多様なプラットフォームが普及している5),9),10)。PRPや全血などの試料形態の違いに加え，血小板凝集刺激剤（アデノシン二リン酸（adenosine diphosphate; ADP），コラーゲン，エピネフリン，およびアラキドン酸）の違い，最大凝集や反応速度，曲線下面積などの出力指標の違いなど，各種測定法によって様々な違いがあるため，相互比較および標準化は依然課題が残る1),7),11)。
国際血栓止血学会（International Society on Thrombosis and Hemostasis; ISTH）の科学・標準化委員会血小板機能専門部会は，LTA標準化に関する提言を公表し，PRP調製から測定までの品質管理項目を詳細に定義している12)。同提言では，採血から測定までの時間管理，遠心条件の明確化，溶血・乳糜検体の評価，PRP中の血小板数の測定・記録の必須化と不要な希釈の回避，装置・試薬ロット差を抑える内部精度管理について強調されている。これらはPRPを恣意的に調整するよりも現状のPRP品質を正確に把握し，誤差要因を管理・補正する体制への移行を示している12),13)。血小板凝集反応は機能に加え，血小板数という量的要因に強く依存する。LTAではPRP中の血小板数が低いと最大凝集率が過小評価され，高値では光学信号がプラトーとなる可能性が示されている12),14)。また，全血法ではヘマトクリット，赤血球数，フィブリノゲン濃度など他成分の影響が無視できない15),16)。実臨床ではPRP中の血小板数が約150 × 109/Lを下回ると再現性が低下しやすいとの報告があり2),12)，この値は注意すべき閾値として現場で用いられている。したがって，測定結果の評価には血小板数情報を加味した解釈が不可欠である。
近年，LTAでは患者本来の生理的状態を反映させるため血小板数を調整せずに測定する方法が推奨されている一方で，PRP中血小板数の情報が欠落すると結果解釈の妥当性が損なわれる可能性があるという課題が残る。
本研究の目的は，この課題に対しLTA測定時に取得可能なベースライン透過光量の差からPRP中血小板数を外部測定なしに推定する数式モデルを構築し，その有用性を検証することである。とくに，臨床上の注意閾値とされる150 × 109/L未満の識別性能とモデル化の妥当性および，汎化性能に基づく次数の最適化とPRP中血小板数に対応する実用的な閾値の導出を行う。
本研究は岐阜大学大学院医学系研究科医学研究等倫理審査委員会の承認を得て実施した（承認番号2022-086）。対象は2022年8月から2025年4月までに当院検査部へ血小板凝集能検査の測定依頼のあった1,326検体とし，血小板凝集能検査結果および血球数算定結果を用いた。対象の内訳は男性767名，女性559名，年齢の中央値（四分位範囲）は72（62–76）歳であった（Table 1）。なお，本対象群においてPRP中血小板数が150 × 109/L未満の検体は1,326件中175件（13.2%）であった。
| Overall | Male | Female | p value | |
|---|---|---|---|---|
| Sex (male/female), n | 1,326 | 767 | 559 | — |
| Age (years) | 72 (62–76) | 73 (64–77) | 69 (60–76) | 0.001 |
| WBC (109/L) | 5.86 (4.82–7.18) | 6.24 (5.17–7.66) | 5.43 (4.41–6.46) | < 0.001 |
| RBC (1012/L) | 4.16 (3.75–4.55) | 4.32 (3.93–4.71) | 3.99 (3.59–4.33) | < 0.001 |
| HGB (mg/dL) | 12.7 (11.6–13.8) | 13.4 (12.4–14.4) | 12 (10.9–12.8) | < 0.001 |
| HCT (%) | 38.6 (35.3–41.8) | 40.1 (37–43.1) | 36.7 (33.6–39.6) | < 0.001 |
| PLT (109/L) | 219 (182–263) | 210 (180–251) | 231 (190–279) | < 0.001 |
| Maximum aggregation ratio | ||||
| ADP 1.0 μM induced | 30 (20–41) | 29 (18–40) | 32 (21–43) | 0.011 |
| ADP 10.0 μM induced | 73 (63–79) | 73 (64–79) | 73 (62–79) | 0.68 |
| Collagen 1.0 μg/mL induced | 39 (21–64) | 36 (20–58) | 43 (23–70) | < 0.001 |
| Collagen 5.0 μg/mL induced | 76 (63–84) | 75 (62–84) | 77 (65–86) | < 0.001 |
| APAL | 6.8 (5.7–8.3) | 6.8 (5.7–8.3) | 7 (5.6–8.3) | 0.93 |
| CPAL | 5.8 (4–7.9) | 5.5 (3.9–7.4) | 6.1 (4.3–8.7) | < 0.001 |
WBC; white blood cell counts, RBC; red blood cell counts, HGB; hemoglobin, HCT; hematocrit, PLT; platelet counts, ADP; adenine diphosphate, APAL; ADP induced platelet aggregation level, CPAL; collagen induced platelet aggregation level
血小板凝集能検査はLTAを測定原理とした測定が可能な全自動血液凝固測定装置CN-6000（シスメックス株式会社）を用いた。血小板凝集能の惹起物質にはADPおよびコラーゲン（いずれもシスメックス株式会社）とし，評価指標にはADP惹起血小板凝集レベル（ADP induced platelet aggregation level; APAL）およびコラーゲン惹起血小板凝集レベル（collagen induced platelet aggregation level; CPAL）を用いた。血小板凝集能検査はISTHのコンセンサスに示される条件の下，PRPならびに乏血小板血漿（platelet poor plasma; PPP）を分離した検体を用いた。分離したPRPは多項目自動血球分析装置XN-9100（シスメックス株式会社）にて血小板数の測定を行った。以降の血小板凝集能検査の測定手順は装置標準パラメータにて測定を行った。
2） PRP中の血小板数予測PRP中の血小板数の予測ため，血小板凝集能検査時に得られる光学的パラメータのうち，血小板凝集惹起物質添加前（ベースライン）におけるPRPおよびPPPの透過光量を取得した。予測式の算出はPython 3.9.5およびライブラリであるnumpy 1.26.4，pandas 2.2.1，scikit-learn 1.5.2を用いた。
3） 統計解析統計解析はJMP® Student Edition 18.2.2（JMP Statistical Discovery LLC）を用いた。相関はスピアマンの順位相関係数（ρ）で評価した。これは事前の探索的解析で各変数が正規性から逸脱し，PRP_PLTとベースラインPRP−PPP（およびPAL指標）との関係が線形ではないが単調であることを確認したためであり，線形性・二変量正規性を前提とするピアソン相関よりも外れ値の影響を受けにくいスピアマン相関が適切と判断した。二値性能は混同行列から全体一致率（accuracy），精密度＝陽性適中率（precision = positive predictive value; PPV），感度（sensitivity = recall），特異度（specificity），陰性適中率（negative predictive value; NPV），F1 scoreを算出した。受信者動作特性（receiver operating characteristic; ROC）解析では目的変数をY = 1（PRP_PLT < 150 × 109/L）とし，連続スコアはPredicted PLTを用いて曲線下面積（area under the curve; AUC）を算出した。モデル選択は5:5無作為分割 × 30回のモンテカルロ交差検証により行い，各次数（1〜3次）の最小二乗誤差（mean squared error; MSE）を検証群で計算し，平均 ± 標準偏差で比較した（同点時は低次数を採用）。参考として平方根平均二乗誤差（root mean squared error; RMSE）と平均絶対誤差（mean absolute error; MAE）も各反復で算出し，次数別に平均 ± 標準偏差で要約した。有意水準は両側α = 0.05とした。
解析スクリプト一式（analysis.py，requirements.txt，README.md）はGitHub Gistに公開した（https://gist.github.com/HidekazuISHIDA/c3de225f1adbb7e47d4740f54de8f9ff）。
血小板凝集能検査の過程で得られたPRPを多項目自動血球計数装置にて血小板数の測定を行った。その血小板数と血小板凝集能検査評価指標であるAPALおよびCPALとの相関性について検証した。その結果，PRP中の血小板数全濃度域ではAPAL ρ = 0.156，CPAL ρ = 0.238（Figure 1a, b）であったが，PRP中の血小板数150 × 109/L未満に限定した場合は，APAL ρ = 0.290，CPAL ρ = 0.351（Figure 1c, d）と全濃度域に比較し相関性が強くなった（Figure 1）。
a. PRP_PLT and adenosine diphosphate induced PAL (APAL) in whole samples.
b. PRP_PLT and collagen induced PAL (CPAL) in whole samples.
c. PRP_PLT and APAL in platelet count less than 150 × 109/L samples.
d. PRP_PLT and CPAL in platelet count less than 150 × 109/L samples.
PRP_PLT were weakly correlated with both APAL and CPAL as a whole, nevertheless were more strongly correlated with PALs in samples with platelet counts less than 150 × 109/L.
PRP中の血小板数の予測を行うにあたり，PRP透過光量のみでは装置の光学的特性に影響を受ける可能性があるため，PRPとPPPの透過光量の差（ベースラインPRP-PPP）を推定パラメータとした。
PRP中の血小板数とベースラインPRP-PPPを比較したところ，全濃度域で高い相関性（ρ = 0.924）を示し，PRP中の血小板数150 × 109/L未満に限定した場合でも中等度の相関性（ρ = 0.711）を維持していた（Figure 2）。
a. In whole samples.
b. In platelet count less than 150 × 109/L samples.
ρ; Spearman’s correlation coefficient
PRP_PLT showed a highly correlation with Baseline PRP-PPP and remained reasonably preserved even at platelet counts of less than 150 × 109/L samples.
PRP中の血小板数とベースラインPRP-PPPは非線形関係にあったため，ランダムに計算式導出用のデータと検証用データに5:5で分割し，計算式導出用データから1次式，2次式，3次式を作成し，検証用データに適用し，MSEを算出した。それを30回繰り返し，MSEが最小となる次数を予測式に用いることとした（Figure 3a）。本研究ではPRP中血小板数150 × 109/L未満の検体が175/1,326例（13.2%）と少数であった。そこで各反復で検証群を大きく確保（約663例）し，低値症例を十分に含め，一般化誤差の推定分散を低減する目的で5:5の分割を採用した。本手順はモンテカルロ交差検証に相当し，データを無作為に学習／検証＝5:5に分割して30回反復した。各反復で1・2・3次の多項式モデルを学習し，検証データの誤差を算出して平均 ± 標準偏差を比較し次数を選択した。モンテカルロ交差検証は単一の任意分割に依存せず，誤差の平均とばらつきを直接評価でき，過学習による楽観バイアスを抑えたモデル選択が可能である点で統計学的に堅牢である。併せて評価指標としてRMSEとMAEも各反復で算出し，次数ごとに平均 ± 標準偏差で要約した。
a. Overview of degree determination using the Monte Carlo cross-validation.
b. Average of mean squared error (MSE) and standard deviation by 30 repetitions of random sampling.
c. Derivation of the final model.
PRP_PLT; platelet rich plasma samples, Baseline PRP-PPP; differences in optical density between platelet rich plasma and platelet poor plasma at baseline
To estimate PRP_PLT, the degree of the estimation formula was determined by random sampling (Monte Carlo method) repeated 30 times. Using the determined degree (2nd degree), a prediction formula was created for all sample data, and the threshold for a platelet count less than 150 × 109/L was calculated.
30回モンテカルロ交差検証によるMSEの平均 ± 標準偏差は，1次式1,528 ± 130.7，2次式1,285 ± 84.5，3次式1,293 ± 84.3（Figure 3b）であり，2次式が最も収束していた。RMSEでも2次式が最小で，MAEは3次式が最小（26.7）であったが2次式との差は0.1 × 109/Lと僅少であった（Table 2）。MSEの結果と汎用性から2次式を採用し，全データを用いて最終的な予測式PRP_PLT = 64.855 + 0.2047 × (PRP-PPP) + 5.421 × 10−4 × (PRP-PPP)2を導出した（PRP_PLT: 109/L, PRP-PPP: mOD）。また，最終予測式にPRP_PLT = 150 × 109/Lを代入し5.421 × 10−4x2 + 0.2047x + 64.855 = 150を解いて正の実根を閾値としたところ，PRP-PPP = 250.2 mODとなった（Figure 3c）。なお，MSE，RMSE，MAEの反復平均はTable 2に示した。
| Degree | MSE Mean ± SD |
RMSE Mean ± SD |
MAE Mean ± SD |
|---|---|---|---|
| 1 | 1,529 ± 130.7 | 39.1 ± 1.67 | 28.5 ± 0.75 |
| 2 | 1,286 ± 84.5 | 35.8 ± 1.18 | 26.8 ± 0.66 |
| 3 | 1,293 ± 84.3 | 35.9 ± 1.17 | 26.7 ± 0.64 |
MSE; mean squared error, RMSE; root mean squared error, MAE; mean absolute error, SD; standard deviation
予測式により求めた予測血小板数とPRP中の血小板数の相関性を検証した。その結果，全体ρ = 0.924，PRP中の血小板数150 × 109/L ρ = 0.711であり，実測値の相関性であるPRP中の血小板数とベースラインPRP-PPPと有効桁数内で同等の相関係数が得られた（Figure 4）。
a. In whole samples.
b. In platelet count less than 150 × 109/L samples.
ρ; Spearman’s correlation coefficient
Predicted PLT showed a highly correlation with PRP_PLT and remained reasonably preserved even at platelet counts of less than 150 × 109/L samples.
PRP中の血小板数150 × 109/L未満の予測閾値となる250.2 mODにより二値判定した混同行列は真陽性（< 150 × 109/L）34例，偽陰性14例，偽陽性5例，真陰性（≥ 150 × 109/L）1,273例であった（Figure 5a）。これに基づく指標はaccuracy 0.986，precision（PPV）0.872，sensitivity（recall）0.708，specificity 0.996，NPV 0.989，F1 score 0.782であった。ROC解析では目的変数Y = 1（PRP_PLT < 150 × 109/L）とし，連続スコア＝−Predicted PLT（値が小さいほど陽性寄りのため符号反転）を用いてAUC = 0.990を得た（Figure 5b）。
a. Confusion matrix between the reference platelet count in platelet-rich plasma (PRP_PLT; rows, < 150 / ≥ 150 × 109/L) and the model-predicted platelet count (Predicted PLT; columns, < 150 / ≥ 150 × 109/L). Cell counts: TP = 34, FN = 14, FP = 5, TN = 1,273 (n = 1,326). Reported metrics: Accuracy 0.986, Precision (= PPV) 0.872, Sensitivity (= Recall) 0.708, Specificity 0.996, NPV 0.989, F1 score 0.782.
b. Receiver-operating characteristic (ROC) curves with outcome Y = 1 for PRP_PLT < 150 × 109/L and score X = Predicted PLT (lower values indicate positive). Curves are shown for the whole cohort (AUC = 0.990) and for the low-count subset restricted to PRP_PLT < 150 × 109/L (AUC = 0.826). Axes: x = 1 − Specificity (False Positive Rate), y = Sensitivity (True Positive Rate).
AUC, area under the curve; TP, true positive; FN, false negative; FP, false positive; TN, true negative; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value.
本研究では血小板凝集能測定時に得られるベースライン透過光量データから，PRP中の血小板数を高精度に予測する実用的な数式モデルを構築し，その有用性を検証した。ベースラインPRP-PPPは実測血小板数と極めて強い相関性を示し，これに基づき開発した予測モデルは臨床的閾値である血小板数150 × 109/L未満を高い精度（特異度99.6%）で識別可能であった。
血小板凝集能検査は採血後，時間とともに血小板活性が変化するという特性上，外部委託することが困難な臨床検査のひとつである。しかしながら，近年では一部の全自動血液凝固測定装置でLTAによる血小板凝集能測定が可能となったこともあり8)，臨床現場での広がりを見せている。従来，LTAを測定原理とした血小板凝集能検査における血小板数の取り扱いは測定の標準化を目的として血小板数を一定範囲に調整することが推奨されてきた14)。しかし，近年ISTHでは患者本来の生理的状態を反映させるため，原則として血小板数を調整せず，測定することが推奨されるようになった12),13)。これにより血小板凝集能の結果を正しく解釈するためにも，血小板数を正確に評価することが不可欠となった。血小板数が少ないと血小板同士の衝突頻度に起因するズリ応力が発生しにくくなり，血小板凝集能が過小評価される危険性がある12),14)。本研究結果においても実測血小板数とPALの間に弱い相関性を認め，血小板数150 × 109/L未満の症例で相関性が強くなることが示唆されており，血小板凝集能は血小板数と併せて評価することが重要となる。
本研究で使用したCNシリーズは血小板凝集惹起物質濃度の自動調整や自動添加機能により測定標準化に寄与する装置ではあるが，血小板数を推定する機能は搭載されていない。そのため，従来は血球計数装置での別途測定が必要であった。血小板数推定機能としてはDSメディカル株式会社のヘマトレーサーシリーズなどが存在するが，その正確性について詳細に検証した報告は乏しく臨床現場で広く活用されるには至っていない。そのため，本研究で開発した手法は血小板凝集能測定時に同時推定可能であることから，実臨床における利便性ならびに有用性が高い方法であることが考えられる。特に本モデルの構築にあたっては，30回のランダムサンプリングを繰り返す，いわゆるモンテカルロ交差検証を実施した。この統計学的に堅牢な手法を用いることで，モデルの安定性と信頼性を高めている17)。さらに，30反復で得られた検証誤差の平均が最小かつ分散が小さいモデル（2次式）を採択したことにより，分割依存性のばらつきを低減し，より再現性の高いモデル選択を担保した。加えて，Figure 5およびTable 2に示すとおり，二値指標と回帰誤差の双方で一貫して良好な成績を示し，2次式モデルの選択妥当性が統計的にも臨床的にも裏付けられた。なお，高血小板数域（> 600 × 109/L）では，LTAの光学特性によりPRP−PPPの信号が上限へ漸近（プラトー）することが理論上想定される14)。本研究の全濃度域における検討でも，高値症例は相対的に少数であったが，高値域で残差のばらつきがやや増大し，最終二次モデルは軽度に下方推定する傾向が観察された。一方で単調な関係は保たれており，本研究の主目的である150 × 109/L未満の識別性能への影響は限定的であった。将来的には，高値域のデータを拡充した外部妥当性の検証を行うとともに，装置依存の光学プラトーを考慮した非線形変換や線形化の適用可能性についても検討したい。
本手法の第一目的は血小板凝集能検査の結果解釈支援である。例えば，血小板凝集能の低下が見られた際に本予測式で低血小板数が指摘されれば血小板数減少に伴う結果を考慮する必要があること示唆する。特に本モデルの特異度は99.6%と極めて高いため，本法で血小板数が150 × 109/L以上と予測された場合の血小板凝集能の低下は真の血小板機能低下を示唆する可能性が高いと言える。また，本法の応用的活用として，血小板凝集能測定装置の光学系に対する新しい品質管理ツールとなりうる。血小板凝集能測定装置の光学原理に基づく本予測値と，血球計数装置の実測値を定期的に比較監視することで，光源ランプの劣化といった装置の性能変化を早期に検知できる可能性がある。これは日々の患者検体を利用した低コストかつ実用的な精度管理手法となる。
本研究にはいくつかの限界が存在する。第一に，提示した予測式は単一施設，単一機種のデータに基づくため，外部妥当性の検証が今後の課題である。第二に感度が70.8%であり，全ての低値検体を検出できるわけではないため，あくまでスクリーニングツールとして位置付けるべきであると考えられる。また，強度の乳糜や溶血といった既知の干渉要因の影響についてもさらなる検討が必要である12)。
本研究では統計学的に堅牢なモンテカルロ交差検証を経て，血小板凝集能測定装置のデータからPRP中の血小板数を高精度に予測する手法を確立した。この手法は血小板数を調整せずに測定し結果は血小板数と合わせて解釈するという近年の血小板凝集能検査の潮流において，結果解釈に必須となる情報を迅速に提供可能となる。また，従来は血小板凝集能測定とは別に血球計数装置での測定が必要であった工程を省力化できることから検査全体のワークフローを改善できる可能性がある。本法は臨床的有用性と技術的有用性の両側面から血小板凝集能検査の質の向上と効率化に大きく貢献しうるものである。
本研究は血小板凝集能測定時のベースライン透過光量からPRP中の血小板数を正確に推定する新規かつ実用的な手法を開発し，その有用性を実証した。
本手法は血小板数を調整しない近年の血小板凝集能検査において，結果を的確に解釈するための新たなツールとなり，日常のワークフローを改善する可能性を示したものであり，血小板凝集能検査の検査前プロセスの省力化と検査後プロセスの精度向上に寄与する可能性がある。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
当院検査部において血小板凝集能検査に携わったすべてのスタッフの皆様に，心より感謝申し上げます。
