TP抗体測定試薬「TPAb―ラテックス「生研」」の基礎性能評価および既存試薬との比較検討

廣垣 鼓; 生戸 健一; 佐藤 伊都子; 今西 孝充; 矢野 嘉彦; 千藤 荘

doi:10.14932/jamt.25-87

Abstract

新しく開発されたリコンビナント抗原を用いたTP抗体測定試薬「TPAb―ラテックス「生研」」の基礎的性能評価および既存試薬4種（LA法3種，CLIA法1種）との比較検討を行った。2019年9月～2020年10月までにRPR陽性もしくはTP抗体陽性となった患者235例およびRPR・TP抗体ともに陰性であった患者100例を無作為に抽出し，残余検体合計335件を対象とした。陽性濃度域の精度はCV 3.00%以内，測定範囲は5–500 U/mL，プロゾーンチェック機能も有し，共存物質の影響もなく基礎性能は良好で日常検査に有用であると考えられた。LA法による対照試薬3種類との定性一致率は試薬A：97.0%，試薬B：95.8%，試薬C：92.8%であった。定性不一致検体（18例）のイムノブロット法では，本試薬陰性例ではその殆どでIgGが検出され，既感染例と考えられた。本試薬陽性例（5例）は全例でIgGまたはIgMが確認でき，本試薬の非特異反応による偽陽性が不一致の原因とは考えにくかった。また，IgM（TpN17）を有する検体では，本試薬が唯一陽性と判定された。セロコンバージョンパネル測定結果では，イムノブロット法が検出した31日目に最も早期に陽性判定しており，本試薬はTpN17-IgMへの反応性が高く，感染早期検体の感度が優れている可能性が示唆された。

Translated Abstract

The basic performance of the newly developed TP antibody measurement reagent ‘TPAb-Latex ‘SEIKEN’’ was evaluated and compared with four pre-existing reagents. The basic performance of ‘SEIKEN’ demonstrated the following favorable outcomes: the precision exhibited a coefficient of variation (CV) of less than 3% within the concentration range pertinent to positive decision-making; the measurement range extended from 5 to 500 U/mL; the prozone check functioned effectively; and there was no interference from coexisting substances. The overall percentage agreement with the three pre-existing reagents, which were based on the latex agglutination turbidimetric assay, was Reagent A 97.0%, Reagent B 95.8%, and Reagent C 92.8%, respectively. Immunoblotting identified the presence of IgG and/or IgM in all samples deemed positive by ‘SEIKEN’ (5 specimens) among the 18 specimens that exhibited discordant results with the reference reagents. Consequently, the disagreement is unlikely to be attributed to false positives resulting from non-specific reactions of ‘SEIKEN’. Furthermore, the specimen tested positive exclusively with the ‘SEIKEN’, which identified the presence of IgM (TpN17). The ‘SEIKEN’ successfully detected TP antibodies in the seroconversion panel in agreement with immunoblotting on day 31, marking the earliest detection among the reagents tested. This indicates that the ‘TPAb-Latex ‘SEIKEN’’ exhibits high reactivity to TpN17-IgM and potentially possesses enhanced sensitivity during the early stages of infection.

I　はじめに

梅毒はTreponema pallidumによる性感染症の一つで，全身に多彩な症状を引き起こすため臨床症状だけで診断することは困難なこともある。梅毒の感染報告数は年々増加しており，それに伴い先天性梅毒も増加傾向にある。また早期梅毒（第1期・第2期）は最も感染性が高い時期であり，この病期の患者を血清学的検査で見落とさないことが重要である¹⁾。

梅毒血清学的検査にはウシ心筋のアルコール抽出液から分離精製したリン脂質（カルジオリピン－レシチン－コレステロール）を抗原に用いる脂質抗原法（serological test for syphilis；STS法）と梅毒病原体（Treponema pallidum）を抗原とするTP抗体検査がある。STS法の一種である（rapid plasma reagin法：RPR法）はスクリーニング検査や治療により値が低下していくことから治療効果の判定に用いられているが，生物学的偽陽性などのように非特異反応も認められる。またTP抗体検査は特異性には優れるが治療後も陽性が持続するため治療効果を反映しない。そのため梅毒の診断および治療には両法を組み合わせることがガイドラインにおいても推奨されている²⁾。さらに，近年RPR陰性，TP抗体のみ陽性の早期顕性梅毒の報告も増えておりTP抗体のみ陽性でも注意すべきとの報告もある³⁾。

今回，デンカ株式会社が独自で開発したリコンビナント抗原を用いたTP抗体測定試薬「TPAb―ラテックス「生研」」の基礎性能評価および既存試薬との比較検討を実施し，その有用性を評価した。

II　対象および方法

1．対象

2019年9月～2020年10月までに当院外来・入院患者でRPR陽性もしくはTP抗体陽性となった患者235例およびRPR・TP抗体ともに陰性であった患者100例を無作為に抽出し，残余検体合計335件を対象とした。院内保存期間後に−80℃に凍結保管し，全検体を同時測定した。

2．分析装置と測定試薬

1）測定機器はBM6070（日本電子株式会社）およびARCHITECT^® i2000SR（アボットジャパン合同会社）を用いた。

2）検討試薬はTPAb―ラテックス「生研」（以下，検討試薬：デンカ株式会社），対照試薬は4種の既存試薬（試薬A，試薬B，試薬C，試薬D）を用いた。各測定試薬の試薬情報はTable 1に示す。判定基準は添付文書に従った。

Table 1　Details of the reagents

	Requirement	Insert	Insert	Insert	Insert
Reagents/Machinery	TPAb-Latex ‘SEIKEN’/BM6070	Reagent A/BM6070	Reagent B/BM6070	Reagent C/BM6070	Reagent D/ARCHITECT i2000SR
Test principle	LA	LA	LA	LA	CLIA
Antigen	Recombinant TpN15,17,47	Recombinant TpN15,17,47	Recombinant TpN17,47	Solubilized bacteria	Recombinant TpN15,17,47
Unit	U/mL	U/mL	COI	T.U.	S/CO
Measuring range	5.0～500	5～500	0.3～20.0	5～250	—
Reference intervals	Negative: < 10 Reserve: 10～20 Positive: ≥ 20	Negative: < 10 Reserve: 10～20 Positive: ≥ 20	Negative: < 0.5 Reserve: 0.5～1.0 Positive: ≥ 1.0	Negative: < 10 Positive: 10 ≥	Negative: < 1.00 Positive: ≥ 1.00

測定試薬の試薬情報

LA; Latex agglutination, CLIA; Chemiluminescence immunoassays.

3．検討項目

1）基礎性能

①精度は，デンカコントロール試料2濃度およびプール血清2濃度を用いて併行精度は20回連続測定，室内再現精度は2回連続測定1日2回，15日間測定を実施した。

②希釈直線性は，高濃度プール血清を生理食塩液で10段階希釈系列を作製し実施した。

③プロゾーンは，高濃度試料を生理食塩液で希釈系列を作製し実施した。

④定量限界は，低濃度血清をそれぞれ5重測定し，定量測定法のバリデーション算出用プログラムValidation-Support-V61（日本臨床化学会）を用いて算出した。

⑤共存物質の影響は，干渉チェック・Aプラス（シスメックス株式会社），イントラリポス^®（大塚製薬株式会社）を陽性プール血清に添加し，測定値への影響を検討した。

2）相関性

TP抗体陽性・陰性を含む335検体について，対照試薬で測定し，検討試薬との定量相関および定性一致率を算出した。定量相関は，Shapiro-Wilk検定により検体値の分布が正規分布に従わないことを確認し，Passing-Bablok法による直線回帰式およびスピアマンの順位相関係数を算出した。また，定性判定の一致性を統計的手法（Bowker検定，McNemar検定，統計解析ソフトJMP16）により評価した結果，有意差なしとなった対照試薬3種（試薬A，試薬B，試薬C）について，判定不一致となった検体18例についてイムノブロット法（MIKROGEN）を用いて精査しカットオフバンドと同等以上の濃さで検出された抗体を含有抗体として判定した。

3）セロコンバージョンパネルの測定

LA法の対照試薬3種（試薬A，試薬B，試薬C）について，セロコンバージョンパネルPSS901（SeraCare Life Sciences社）を使用し，検討試薬と対照試薬の梅毒感染の経過に伴うTP抗体の推移を比較し評価した。

III　結果

1．基礎性能

①併行精度および室内再現精度は，それぞれ変動係数（CV）は，0.46～5.45%，1.97～6.42%であった（Table 2）。

Table 2　Repeatability and intermediate precision

	Repeatability (n = 20)				Intermediate precision (n = 60, 2 duplicate assay × 2 run × 15 days)
	Control		Pooled serum		Control		Pooled serum
	Low	High	Low	High	Low	High	Low	High
MEAN (U/mL)	6.75	104.20	32.38	115.23	6.95	104.09	38.34	355.59
SD (U/mL)	0.37	0.48	0.56	0.77	0.45	2.15	0.75	8.71
CV (%)	5.45	0.46	1.73	0.67	6.42	2.06	1.97	2.45

検討試薬の併行精度等結果

②希釈直線性は，TP抗体濃度は555.9 U/mLまで原点に収束する直線性が認められた（Figure 1）。

Figure 1　 Dilution linearity

検討試薬の直線性結果

③プロゾーンチェック機能が働いたため，影響は認められなかった（Figure 2）。

Figure 2　 Prozone phenomenon (P: Prozone check)

検討試薬のプロゾーンチェック結果

④回帰式から求めたCV 20%となる定量限界の濃度は3.3 U/mLであった（Figure 3）。

Figure 3　 Limit of quantitation

検討試薬の定量限界結果

⑤干渉物質の血清中TP抗体濃度に及ぼす影響は，遊離型ビリルビン・抱合型ビリルビンともに30 mg/dL，ヘモグロビンでは500 mg/dL，乳びでは3,000 FTU，イントラリポスでは0.5%まで認められなかった（Figure 4）。

Figure 4　 Effect of coexisting material on measurement of anti-TP antibody concentration

検討試薬の共存物質の影響結果

2．相関性

既存試薬（x）と検討試薬（y）について，測定範囲内における定量相関性は，試薬Aに対しては直線回帰式はy = 0.95x − 1.32，相関係数はrs = 0.95であった。試薬Bに対してはy = 14.14x − 0.96，rs = 0.97，試薬Cに対してはy = 2.84x − 102.0，rs = 0.38であった（Figure 5）。それぞれの試薬との定性一致率は試薬A：97.0%，試薬B：95.8%，試薬C：92.8%，試薬D：89.0%であり，試薬Dはp < 0.0001となった（Table 3）。定性不一致検体18例についてイムノブロット法を測定した結果，1件（No. 149）はIgG，IgMとも検出せず，検討試薬は陰性だった。残りの17件はIgGは検出されたが，IgMが確認できた検体は4件（No. 151, 74, 78, 314）のみだった。特にNo. 314（TpN17）は，対照試薬は全て陰性で検討試薬のみ陽性と判定していた（Table 4）。

Figure 5　 Correlation analysis of TPAb-Latex ‘SEIKEN’ and existing reagents by specimens

検討試薬と既存試薬の相関結果

Table 3　Qualitative agreement rates of TPAb-Latex ‘SEIKEN’ and existing reagents by specimens

		Reagent A p < 0.4459				Reagent B p < 0.0508				Reagent C p < 0.0593			Reagent D p < 0.0001
		Positive	Pending	Negative	Total	Positive	Pending	Negative	Total	Positive	Negative	Total	Positive	Negative	Total
		≥ 20	10–20	< 10	Match rate	≥ 20	10–20	< 10	Match rate	≥ 10	< 10	Match rate	≥ 1.00	< 1.00	Match rate
TPAb-Latex ‘SEIKEN’	Positive	182	1	1	184	183	0	1	184	179	5	184	183	1	184
	≥ 20	182	1	1	98.9%	183	0	1	99.5%	179	5	97.3%	183	1	99.5%
	Pending	1	4	1	6	2	3	1	6	5	1	6	5	1	6
	10–20	1	4	1	66.7%	2	3	1	50.0%	5	1	0.0%	5	1	0.0%
	Negative	1	5	139	145	2	8	135	145	13	132	145	30	115	145
	< 10	1	5	139	95.9%	2	8	135	93.1%	13	132	91.0%	30	115	79.3%
	Total	184	10	141	335	187	11	137	335	197	138	335	218	117	335
	Match rate	98.9%	40.0%	98.6%	97.0%	97.9%	27.3%	98.5%	95.8%	90.9%	95.7%	92.8%	83.9%	98.3%	89.0%

検討試薬と既存試薬の定性一致率結果

Table 4　Measured values of 18 decision-disagreed samples with 4 reagents, infection history and result of immunoblotting (ND: Not-detected, +: Positive, +/−: Reserve, −: Negative)

No.	TPAb-Latex ‘SEIKEN’ (U/mL)		Reagent A (U/mL)		Reagent B (COI)		Reagent C (T.U.)		Infection History	Immunoblot
No.	TPAb-Latex ‘SEIKEN’ (U/mL)		Reagent A (U/mL)		Reagent B (COI)		Reagent C (T.U.)		Infection History	IgM	IgG
10	5.0	−	21.7	+	1.2	+	120.7	+	Past	ND	15, 17, 47, TmpA
18	6.3	−	8.2	−	0.5	+/−	64.7	+	Unknown	ND	17, 47, Tp453, Tp257, TmpA
31	6.9	−	< 5.0	−	0.3	−	23.2	+	Unknown	ND	15, 17, 47, Tp453, Tp257, TmpA
47	5.7	−	11.0	+/−	0.6	+/−	46.6	+	Past	ND	15, 17, 47, Tp257, TmpA
65	7.1	−	9.8	−	0.6	+/−	43.7	+	Past	ND	15, 17, 47, Tp257, TmpA
68	6.8	−	10.8	+/−	0.7	+/−	44.4	+	Past	ND	15, 17, 47, Tp257, TmpA
85	7.7	−	10.7	+/−	0.6	+/−	131.8	+	Unknown	ND	15, 17, 47, Tp257, TmpA
124	< 5.0	−	< 5.0	−	0.3	−	12.5	+	Past	ND	15, 17, 47, Tp453, Tp257, TmpA
149	< 5.0	−	< 5.0	−	2.3	+	51.2	+	Unknown	ND	ND
151	9.8	−	9.0	−	0.8	+/−	11.0	+	Unknown	47	17, Tp453, Tp257
177	< 5.0	−	< 5.0	−	0.5	+/−	38.9	+	Unknown	ND	17
224	5.3	−	9.1	−	0.5	+/−	39.2	+	Past	ND	17, 47
269	< 5.0	−	11.5	+/−	0.4	−	12.5	+	Unknown	ND	15, 17, 47, Tp453, Tp257, TmpA
74	142.4	+	167.0	+	11.4	+	< 5.0	−	Unknown	47	17, Tp453, Tp257, TmpA
78	90.4	+	129.3	+	8.2	+	< 5.0	−	Unknown	15	17, Tp453, Tp257, TmpA
134	124.7	+	172.3	+	10.1	+	< 5.0	−	Unknown	ND	17, Tp453, Tp257, TmpA
291	64.0	+	64.7	+	3.8	+	< 5.0	−	Unknown	ND	15, 17, 47, Tp453, Tp257
314	36.8	+	< 5.0	−	< 0.3	−	< 5.0	−	Unknown	17	15, TmpA

定性不一致18例の結果

3．セロコンバージョンパネル測定

検討試薬は感染後31日目から陽性となったが，試薬Aは59日目，試薬Bは52日目，試薬Cは45日目に陽性となった。イムノブロット法では，31日目でIgMのみ検出（TpN17, TpN47），45日目以降でIgM，IgGが共に検出された（Table 5）。

Table 5　Result of seroconversion panel and immunoblotting (ND: Not-detected, +: Positive, +/−: Reserve, −: Negative)

Days Since 1st Bleed	Panel Member	TPAb-Latex ‘SEIKEN’ (U/mL)		Reagent A (U/mL)		Reagent B (COI)		Reagent C (T.U.)		Immunoblot
Days Since 1st Bleed	Panel Member	TPAb-Latex ‘SEIKEN’ (U/mL)		Reagent A (U/mL)		Reagent B (COI)		Reagent C (T.U.)		IgM	IgG
0	PSS901-01	< 5.0	−	< 5.0	−	< 0.3	−	< 5.0	−	ND	ND
5	PSS901-02	5.0	−	< 5.0	−	< 0.3	−	< 5.0	−	ND	ND
10	PSS901-03	< 5.0	−	< 5.0	−	< 0.3	−	< 5.0	−	ND	ND
13	PSS901-04	< 5.0	−	< 5.0	−	< 0.3	−	< 5.0	−	ND	ND
31	PSS901-05	30.9	+	< 5.0	−	0.3	−	< 5.0	−	17, 47	ND
45	PSS901-06	51.9	+	< 5.0	−	0.4	−	22.7	+	17, 47, TmpA	47, Tp453, TmpA
48	PSS901-07	65.8	+	5.5	−	0.6	+/−	49.6	+	17, 47, Tp453, TmpA	47, Tp453, TmpA
52	PSS901-08	114.7	+	13.4	+/−	1.9	+	110.4	+	17, 47, Tp453, TmpA	15, 17, 47, Tp453, TmpA
59	PSS901-0	370.0	+	91.6	+	12.1	+	230.7	+	15, 17, 47, Tp453, TmpA	15, 17, 47, Tp453, Tp257, TmpA

セロコンバージョンパネルの結果

IV　考察

日本性感染症学会が2018年に公開した性感染症　診断・治療ガイドライン³⁾にある梅毒の診断基準にはPCR法での陽性が記載されている。しかしながら梅毒のPCR法は国立感染症研究所や一部の地方衛生研究所で試験的に行われているのみであり，保険未収載である。そのため梅毒の診断は血清学的検査がゴールドスタンダードとされている⁴⁾。近年，国内で流通している診断薬は多数市販されており，診断薬メーカーにより固相抗原（培養抗原とリコビナント抗原）や判定基準（カットオフ値や定性・定量）も異なるため，検査方法間または診断薬メーカー間で判定不一致が生じる例が多数報告されている^5)～9)。

新たに開発された検討試薬の基礎性能評価を行った結果，併行精度，室内再現精度はともに陽性濃度域はCV 3.00%以下と良好であった。また，測定範囲は従来の定量試薬（試薬A）と同等に5 U/mL～500 U/mLを確認でき，プロゾーン現象も適切にエラー表示されることが確認できた。TP抗体試薬の乳び検体での影響についても報告されているが¹⁰⁾，検討試薬は干渉チェック・Aプラス乳び，イントラリポスとも5%以内の変動率であり乳び検体の影響は受けにくいことが確認でき，基礎性能は良好であると考えられた。

しかし，一般的に抗原抗体反応を原理とする免疫測定法では，IgM型RFの影響を受ける可能性がある¹¹⁾。デンカ社内データより干渉チェック・RFの影響はRF 450 IU/mLまで認められなかったが，RFの反応性は個体差があるため患者検体測定には注意が必要である。

定量相関において，検討試薬と試薬Aおよび試薬Bは0.9以上の高い相関を示した。試薬Bに対しては直線回帰式の傾きが大きく異なっていたが，測定単位が異なるためと考えられた。検討試薬と試薬Cは，定量的な相関性は無いと考えられた。検討試薬はリコンビナント抗原を使用しており，試薬Cは可溶化菌体を抗原としているため，使用抗原の違いが測定値に影響していると考えられた。定性一致率の評価において，対照試薬Dは有意差有りとなった。定性一致率が89.0%となったのは，検討試薬が陰性，試薬Dが陽性の不一致検体が占めたためだった。試薬Dの判定を真の判定とし，ROC解析により検討試薬のカットオフ値の解析を実施したところ現行値20.0 U/mLに対し解析値は2.5 U/mLとなり，カットオフ値が大幅に低下した。このことから，試薬Dでは感度を重視して陽性の拾い落としが少なくなるようカットオフ値が設定されていると考えられ¹²⁾，検討試薬とカットオフ値設定のコンセプト^13),14)が異なると判断し，試薬Dとの不一致検体は解析対象外とした。

不一致18例のイムノブロット法では，検討試薬陰性の不一致（13件）は1例を除いてIgGが検出され，既感染検体の可能性が高いことが考えられた。No. 149は乳び，溶血は陰性で検体性状に異常は見られず，また，IgMとIgGのいずれも検出されなかったことから，既存試薬B，Cの偽陽性であると考えられた。既存試薬Cのみで陽性判定となったNo. 151は，47-IgMおよび複数のIgGが検出されたが，セロコンバージョンパネル測定において47-IgMが検出された31日目は陰性判定であったことから，既存試薬CはIgGに反応して陽性判定となった可能性が考えられた。検討試薬陽性（5件）は全てIgGまたはIgMが検出されたことから，検討試薬の特異反応であると考えられた。その内No. 74，78，314はIgMも確認されており，検討試薬は試薬A～Cと比較してIgMへの反応が高いことが示唆された。しかし，No. 151は47-IgMが検出されたが検討試薬は陰性だった。セロコンバージョンパネル結果では，イムノブロット法がIgM（TpN17，TpN47）を検出した31日目に検討試薬は最も早期に陽性判定しており，対照試薬と比較して早期にIgM型TP抗体を検出できていた。そのため，検討試薬は47-IgMではなく17-IgMに対する反応性が高いと推察された。一方で，IgGを含む検体に対しては，検討試薬は既存試薬よりも反応性が低い傾向が見られた。一般的にIgGはIgMよりも親和性が高いが，IgMが5量体をとるのに対しIgGは単量体であることから，試薬中の抗原との反応効率はIgGの方が低いと考えられる。検討試薬ではIgGの反応効率の低さが反映されたと推察されるが，治癒後検体よりも感染初期・現感染の検体に対して陽性判定することが重要と考えられ，検討試薬では，IgMや多量のIgGが含まれる感染初期・現感染検体での拾い落としが発生する可能性は低いと考える。

以上より，検討試薬はTpN17-IgMへの反応性が高く，感染早期検体の感度が優れている可能性が示唆された。

V　結語

デンカ株式会社が新たに開発したTP抗体測定試薬「TPAb―ラテックス「生研」」は，日常検査に有用であり，既存試薬（LA法）と比較して梅毒感染の早期発見が可能であることが示唆された。

なお，本研究は神戸大学大学院医学研究科医学倫理審査委員会の承認を得て，検体の採取や分析は対象患者に情報公開を行った上で実施した（承認番号B190268）。

COI開示

本論文に関連して，著者が開示すべき利益相反（COI）はありません。

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責任著者(Corresponding author)

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