炭酸ガス依存性メチシリン耐性Staphylococcus aureus（MRSA）による敗血症症例を経験したので報告する。患者は60歳台男性，入院時に採取された血液培養が陽性となり，Gram染色でCluster状のグラム陽性球菌を認めた。平板培地へのサブカルチャーを実施したところ，好気培養条件下では微小コロニーを認め，炭酸ガス培養では明瞭なコロニーを認めた。質量分析計でS. aureusと同定され，薬剤耐性遺伝子検査によりmecAを保有していたことから，抗菌薬はタゾバクタム／ピペラシリンからバンコマイシンに変更された。薬剤感受性試験では，好気培養では菌の発育不良により測定不能であったため，炭酸ガス培養で再検査を行い，菌の発育を確認したのちMRSAと判定し参考値として報告した。さらに，炭酸ガス依存性となる発育特性に着目し遺伝子解析を行ったところ，本菌株にmpsBのナンセンス変異を認めた。本症例は，炭酸ガス依存性MRSAによる敗血症という稀な事例に対し，発育特性を考慮した培養条件の工夫に加え，質量分析や遺伝子検査を併用したことで迅速な診断と適切な治療選択に寄与できた。微生物検査技師は，SCVsの特性を理解し，日頃よりコロニーの観察眼を鍛え，通常株と異なる発育状況に気付くことや，それらの状況を踏まえた適切な検査方法の選択が重要と考える。
We report a case of sepsis caused by carbon dioxide-dependent, methicillin-resistant Staphylococcus aureus. The patient was a man in his 60s, and blood cultures taken upon admission were positive, with Gram staining revealing Cluster-like Gram-positive cocci. Subculture on a plate medium revealed very small colonies under aerobic conditions, while clear colonies were observed under carbon dioxide conditions. Mass spectrometry identified the strain as S. aureus. Furthermore, drug resistance genetic testing revealed the presence of the mecA. Following this, the antibiotic was changed from tazobactam/piperacillin to vancomycin. Drug sensitivity testing was undetectable due to poor bacterial growth in aerobic cultures. Therefore, carbon dioxide cultures were retested. After confirming bacterial growth, the strain was diagnosed as MRSA and reported as a reference value. Additionally, genetic analysis focusing on the carbon dioxide-dependent growth characteristics of this strain revealed a nonsense mutation in the mpsB. In this rare case of sepsis caused by carbon dioxide-dependent MRSA, the use of culture conditions that took growth characteristics into consideration, combined with mass spectrometry and genetic testing, contributed to a rapid diagnosis and appropriate treatment. It is important for microbiology technicians to understand the characteristics of SCVs, train their skills on a daily basis to recognize growth patterns, and select appropriate testing methods based on these conditions.
Small colony variants（以下，SCVs）は抗菌薬や環境因子などの影響により，特定の栄養要求性を持つ，通常株よりもゆっくりと成長する細菌の集団である1),2)。これらの特徴をもつSCVsには，Escherichia coli3)，Pseudomonas aeruginosa4)，Staphylococcus aureus5)，Staphylococcus epidermidis6)などで報告がある。SCVsのStaphylococcus aureusは通常株と同様の病原性を有するものの，チミジン依存性5)など発育特性の異なる株が存在することが知られている。また，その耐性機構や病原性についての解析がなされている7)。しかし，SCVsのMRSAの解析報告は少なく，さらに，炭酸ガス依存性MRSAによる敗血症の報告は，我々が検索し得た限り見当たらなかった。このような極めて稀な事例を経験したため，本菌の遺伝子解析も踏まえ報告する。
60歳台男性。統合失調症による約20年間のA病院精神科への入院歴があり，退院後はB施設に入所中であった。20XX年3月より右誤嚥性肺炎で再度A病院に入院していたが，5月X日にSpO2（末梢血酸素飽和度）が低下。翌朝より意識レベルの低下とショックバイタルを認めたため，当院に転院搬送された。
身体所見：SpO2 78%（マスク10 L），JCS III-300，体温36.2℃，血圧計測不可，心拍数74/min，橈骨動脈は触れず下顎呼吸。ADLは全介助であり，当院入院前から意思疎通は困難であった。当院で撮影された胸部X線写真では右肺野が白く描出されており，肺炎が示唆された。また，仙骨部には褥瘡が確認された。
既往歴：統合失調症，不眠症，パーキンソン症候群，腰痛症，便秘症，高脂血症，鉄欠乏性貧血，低血圧症，前立腺癌疑い。
2． 経過入院時の血液検査結果をTable 1に示す。C反応性蛋白（CRP）は10.12 mg/dLと上昇しており，強い炎症反応を認めた。微生物検査では，血液培養と喀痰培養が提出されたが，積極的な治療や輸血は行わない方針であったため，仙骨部に確認されていた褥瘡の培養は提出されなかった。バイタルや血液検査所見により，誤嚥性肺炎および敗血症性ショックと診断され，当院入院管理となった。
| 項目 | 値 |
|---|---|
| Na | 134 mmol/L |
| K | 3.3 mmol/L |
| Cl | 100 mmol/L |
| Ca | 7.0 mg/dL |
| UA | 3.6 mg/dL |
| UN | 23.7 mg/dL |
| CRE | 1.3 mg/dL |
| TP | 3.0 g/dL |
| ALB | 1.2 g/dL |
| A/G | 0.67 |
| GLU | 91 mg/dL |
| CRP | 10.12 mg/dL |
| WBC | 2.6 ×103 μL |
| RBC | 1.74 ×106 μL |
| HB | 5.9 g/dL |
| PLT | 122 ×103 μL |
入院中のバイタル経過と投与薬剤をFigure 1に示す。抗菌薬はタゾバクタム／ピペラシリン（TAZ/PIPC）が4.5 g × 3回／日で投与開始となった。バイタルは改善傾向にあったが，血液検査では白血球数（WBC），体温（BT）共に第3病日まで一時上昇したため，抗菌薬の継続投与および経鼻胃管などの栄養投与がなされた。救急外来で提出された血液培養よりMRSAが検出されたため，敗血症に対しバンコマイシン（VCM）1.0 g × 1回／日を2週間投与した。同時に誤嚥性肺炎も考慮しスルバクタム／アンピシリン（SBT/ABPC）3.0 g × 2回／日を2週間投与した。抗菌薬治療により炎症反応は改善され，経過は良好であった。家族の希望により，中心静脈カテーテル（CVポート）を造設し，中心静脈栄養，経管栄養を行い，第54病日に長期療養型施設へ転院された。
入院時に救急外来で実施された血液培養検査は，血液培養自動検出装置BD BACTEC FX（日本BD）の好気用レズンボトルおよび嫌気用レズンボトルを用いて2セット実施した。培養開始後21時間で好気用ボトルが，36時間で同一セットの嫌気ボトルが陽転化した。
グラム（Gram）染色ではCluster状のグラム陽性球菌を認め（Figure 2），Staphylococcus属が疑われた。分離培養にはCA羊血液寒天培地/VCMチョコレート寒天培地EXII（CA羊血液/VCMチョコレート培地，島津ダイアグノスティクス）を用い，35℃，好気培養で16時間実施した。CA羊血液培地上のコロニーの発育は，通常のStaphylococcus属と比較し発育が非常に弱かった。通常と異なるコロニーの発育状況を踏まえ，TSA II 5%ヒツジ血液寒天培地/BTB乳糖加寒天培地（血液/BTB培地，日本BD）およびポアメディアMRSA分離培地（MRSA培地，栄研化学）を35℃，好気培養，CA羊血液/VCMチョコレート培地を35℃，5%炭酸ガス培養で分離培養を実施した。16時間後，好気培養した血液/BTB培地およびMRSA培地では通常より小さめのコロニーの発育が認められた。しかし，5%炭酸ガス培養で培養したCA羊血液培地では黄色ブドウ球菌を想起させる黄色コロニーの発育が良好となり，両条件下で発育の差がみられた（Figure 3，4）。両者の発育の違いから，炭酸ガス依存性であるS. aureusを疑い，好気培養で発育が不良であったMRSA培地を5%炭酸ガスで延長培養したところ，発育が良好となった（Figure 4）。VCMを含むVCMチョコレート培地は，好気培養と5%炭酸ガス培養ともに発育は認められなかった。
Cluster状のグラム陽性球菌を認めた（B&M法）。
左より，血液/BTB培地，CA羊血液/VCMチョコレート培地，MRSA培地（それぞれ35℃，16時間培養）
左：CA羊血液/VCMチョコレート培地（35℃，5%炭酸ガス環境下で16時間培養）。右：MRSA培地（35℃，好気条件下で16時間培養後，5%炭酸ガス環境下で24時間延長培養）。VCMを含むVCMチョコレート培地には好気培養と5%炭酸ガス培養ともに発育が認められなかった。
形成されたコロニーを試料とし，質量分析計（MALDI Biotyper，ブルカー）でギ酸添加セルスメア法による同定検査を行ったところ，S. aureus（Score Value; 2.26）と同定された。参照データベースは当院で2021年2月11日に更新したBDAL（Ver. 10）9,607 MSPsを使用した。
入院時に提出された喀痰培養からは炭酸ガス依存性MRSAは分離されず，口腔内常在菌のみの発育が認められた。血液培養陽性判明後，感染巣の検索のため，第11病日に抗菌薬投与下を承知の上，仙骨部褥瘡培養を行ったところ，血液培養と同様の炭酸ガス依存性MRSAが検出された。
2． 薬剤感受性試験・薬剤耐性遺伝子検査好気培養での培地上の発育は通常より弱かったが，薬剤感受性試験（微量液体希釈法）の実施は可能と判断し，全自動同定・感受性検査システムBD Phoenix M50（日本BD）のPMIC-85パネルで測定を開始した。しかし，「感受性の結果は無効です」「パネルに菌の発育がありません」といったエラー表示が認められた。これらの結果から，BDマックス全自動核酸抽出増幅検査システム（日本BD）で薬剤耐性遺伝子検査を実施した。S. aureusに特異的なMREJ配列およびmecAを検出したため，主治医および抗菌薬適正使用支援チーム（Antimicrobial Stewardship Team; AST）に“MRSA疑い”として中間報告した。また，薬剤感受性試験の再検査は，微生物感受性分析装置DPS192ix（栄研化学，以下DPS192ix）で行った（Table 2）。感受性試験のプレートには，ドライプレート‘栄研’EP-32プレート（栄研化学）を用い，5%炭酸ガス環境下で培養した。16時間（VCMは24時間）培養後，DPS192ixで判定を行ったところ，コントロールウェルの発育がみられた。判定基準はCLSI M100-S28に準拠し，DPS192ixのオキサシリン（MPIPC）およびセフォキシチン（CFX）は耐性として判定された。最終的に，遺伝子検査・MRSA培地・薬剤感受性試験の結果を踏まえ，本菌株をMRSAと判定し，MIC値は参考値として報告した。
| 薬剤 | MIC（μg/mL） | 判定 |
|---|---|---|
| PCG | > 8 | R |
| SBT/ABPC | > 16 | R |
| MPIPC | > 2 | R |
| CEZ | > 16 | R |
| CAZ | > 16 | R |
| CMZ | > 32 | R |
| CFPM | > 16 | R |
| CTRX | > 32 | R |
| CCL | > 16 | R |
| CPDX | > 4 | R |
| CFDN | > 2 | R |
| IPM/CS | > 8 | R |
| MEPM | > 8 | R |
| AMPC/CVA | > 8 | R |
| TAZ/PIPC | > 8 | R |
| GM | ≤ 0.5 | S |
| EM | > 4 | R |
| CAM | > 4 | R |
| AZM | > 4 | R |
| CLDM | > 2 | R |
| MINO | 8 | I |
| ST | ≤ 5 | S |
| LVFX | > 4 | R |
| CPFX | > 2 | R |
| LZD | 1 | S |
| RFP | ≤ 0.25 | S |
| DAP | 0.5 | S |
| VCM | 2 | S |
| TEIC | 1 | S |
| CFX | > 8 | R |
| GM_2 | ≤ 500 | |
| EM/CLDM | > 0.5 |
S（感性），I（中等度耐性），R（耐性）。使用機器：微生物感受性分析装置DPS192ix（栄研化学）。
後日，本菌の炭酸ガス依存性の原因を調べるため，信州大学医学部保健学科検査技術科学専攻（病因・病態検査学領域）松本竹久先生に遺伝子解析を依頼した。今回，S. aureusでの重炭酸イオンの供給に関与しているMpsABをコードするmpsABに着目し解析を行った。本菌株の遺伝子配列をATCC29213株と比較すると，mpsAは1,485 bp/1,485 bp（100%）一致しており，変異はみられなかった。しかし，mpsBに関しては，2,706 bpのうち1,486番目のCがTに変異しており，それにより496番目のアミノ酸であるグルタミンのコドンが終止コドンに変異していた。すなわち，mpsBにナンセンス変異が生じたことにより，炭酸ガス依存株となったと考えられた。また，数世代継代培養を行い，性状が復帰した株についても遺伝子解析を行った結果，1,488番目のGがTに変異し，炭酸ガス依存性株で終止コドンとなっていた496番目のコドンが，チロシンのコドンへと変異していた。
炭酸ガス依存性MRSAによる敗血症の治療に貢献した症例を経験した。本症例は，血液培養からの検出菌がSCVsであることを早期に察知し，炭酸ガスを要求するという特徴を考慮しながら適切な検査を行うことができた貴重な一例である。また，コロニーの非典型的な発育性，遺伝子検査の追加によって，適切な抗菌薬への変更が可能となり，救命に寄与した。
本患者は当初看取り方針であったため，仙骨部に確認されていた褥瘡からの培養は提出されていなかった。しかし，感染巣の探索を目的としてASTが介入し，培養検査が行われた。その結果，血液培養と同様に炭酸ガスを要求するMRSAが検出され，褥瘡が感染巣であると考察された。
SCVsは特別な栄養や培養条件を必要とするため，日常検査では見逃されやすく薬剤感受性試験も苦慮することが多い6)。そのため，生化学性状および通常培地での発育状況の異変に気付いた際には，SCVsを疑い，その後の培養条件に留意する必要があると考える。当院ではこれまでにSCVs分離の経験が少なく，標準法も定まっていないことから培養条件や報告方法に検討を要した。本症例では，培養条件を柔軟に変更できる感受性試験機器を別法として用いることで，炭酸ガス依存性菌株に対しても妥当な結果が得られ，このような工夫が奏功したと考える。
SCVsの存在や特徴は臨床医にほとんど知られていないため，臨床に詳細を直接報告することが望ましいとされている8)。本症例では，ASTに炭酸ガス依存性の株が検出されたことと，薬剤感受性試験の結果が参考値である旨を報告した。ASTを通じて主治医とコミュニケーションをとることで円滑な治療方針決定に貢献することができたと考えられる。
本症例では，血液培養検査が細菌検査室の非稼働時間帯に陽性となり，日直技師による好気培養のサブカルチャーが運用手順であるため，初期にはSCVsであることを把握できていなかった。最終的に，培養したコロニーの大きさが通常のS. aureusと比較し明らかに微小であったことから，好気培養と炭酸ガス培養の両方を行い比較することで発育の違いに気づくことができた。発育速度やコロニーの大きさ，溶血環など，菌種ごとの特徴を日頃より把握し，観察することで，SCVsのような変異株にも気づくことができると考える。当院採用のMRSAスクリーニング培地の添付文書での培養条件は好気的条件下であるが，SCVsを疑った時点で炭酸ガス培養を追加した結果，良好な発育，および卵黄マンニット反応が認められた。よって正確な判定が可能となり，MRSAとしての最終判定に寄与した。一部の市販培地ではチミジン依存性SCVsへの改良がなされているが9)，それらに当てはまらないSCVsの検出は検査技師の観察力と気付きに依存する面が大きいと考える。
菌種同定について，SCVsは発育不良や非特異的な性状を示すため，生化学的同定キットでは正しい同定結果が得られないことがある6)。当院では質量分析計を導入しており，本症例の菌株のように発育が悪く少量のコロニーからでも正確な菌名同定が可能であった。また，薬剤感受性試験の発育不良が判明した時点で薬剤耐性遺伝子検査を開始し，mecAを迅速に検出することで，薬剤感受性試験の再検査結果を待たずに抗菌薬の適正変更につなげることができた。SCVsでは，生化学性状を用いた菌名同定検査や薬剤感受性試験が正確に行われないことも多く，菌量や発育状況に左右されない質量分析や遺伝子検査は極めて有用と考えられた。
SCVsとなる機序は抗菌薬の曝露や環境因子といわれている2)。本症例では，以前の報告10)にあるように，統合失調症による療養型医療施設への長期入所や，慢性期病院への入退院など，患者が抗菌薬曝露や長期投与リスクのある環境におかれていたことがSCVsとなった要因の一つと推察される。細菌の発育には，脂肪酸合成や細胞内pHの恒常性維持のために重炭酸イオンが不可欠である11)。通常のS. aureusは，MpsAB輸送系を介し，細胞内の代謝で生じたCO2由来の重炭酸イオンを，効率よく細胞内に取り込むことができると考えられている12)。しかし，何らかの原因でmpsABに変異が生じた株では，この輸送系が機能しない。そのため，十分な量の重炭酸イオンを供給できず，増殖のためには高濃度（5%）の炭酸ガス環境を必要とすると考えられている7),12),13)。すなわち，通常株はMpsABを介して大気中から重炭酸イオンを取り込み増殖できるが，一方，遺伝子変異によりMpsAB合成が阻害された株では重炭酸イオンの取り込みが著しく制限されるため，高濃度炭酸ガス依存性を示す。本菌株では，このmpsに変異がみられた。mpsBの496番目のコドンにナンセンス変異が生じたことでMpsBの機能が不全となり，細胞内での重炭酸イオンの供給が不足したことで高濃度の炭酸ガスを要求するようになったため，コロニーの小集落化などSCVsの特徴を呈したと推測される。チミジン・ヘミンなどアミノ酸の栄養要求を示すSCVsは報告があるが，炭酸ガス依存性のMRSAによる症例は報告が少なく，本症例は非常に貴重な症例であると考える。
これらの特殊な培養条件を必要とするSCVsについて，日頃からコロニーに対する観察眼を鍛え，いち早く異変に気付くことや，その特徴について理解を深めることが重要である。このような非特異的な菌株と遭遇した場合は，培養条件の工夫を積極的に行うことや，質量分析および遺伝子検査を併用することで，臨床に寄与できると考えられる。
炭酸ガス依存性S. aureusによる敗血症の一例を経験した。検査室で，通常株と比較した明らかな発育差によってSCVsであると気づき，患者救命へと寄与した。本症例のようにSCVsを疑うコロニーが発育した場合には，培養条件を変更するなどその株に合致した条件で培養を行うことが重要である。加えて，SCVsにおける培養検査の不安定性を補完する手法として耐性菌の遺伝子を検出する検査も患者救命のために有用である。
本論文の要旨は，第71回日本医学検査学会にて発表した。
本症例は，当施設の倫理委員会で承認されたものである（承認番号 第1229号）。
本論文に関連して，著者が開示すべき利益相反（COI）はありません。
本論文を執筆するにあたってご指導いただきました信州大学医学部保健学科検査技術科学専攻，松本竹久先生に深謝いたします。
