Factor VIIa/factor X製剤と高用量recombinant factor VIIa製剤の併用療法を施行した血友病Bインヒビター1症例の凝固能評価

Abstract

血友病インヒビター患者の止血管理にバイパス止血剤が併用されるが確立された療法はない．今回，活性化第VII/第X因子（FVIIa/FX）および高用量組換え（r）FVIIaの併用療法を施行した血友病Bインヒビター患者1例の凝固能を評価した．止血困難な出血時にFVIIa/FX，高用量rFVIIaの順で投与したところ，FVIIa/FXまたは高用量rFVIIaの投与前後でAPTTは短縮し，トロンビン産生およびFVII抗原量は増加した．一方，FX抗原量はFVIIa/FXの投与前後でのみ増加した．また，高用量rFVIIa単独投与に比して，FVIIa/FX投与翌日の高用量rFVIIa追加投与後の凝固能は強まった．併用療法に際して過凝固の徴候は見られなかった．FVIIa/FX投与による高濃度FX存在下でのrFVIIa追加投与は，血友病Bインヒビターの難治性出血に対する合理的な止血戦略となり得る可能性がある．

Translated Abstract

Sequential therapy with bypassing agents is sometimes used for hemostatic management in hemophilia patients with inhibitors, but there is no established therapy. In this study, we evaluated the coagulation capacity of a hemophilia B patient with inhibitors treated with factor VIIa/factor X (FVIIa/FX) and high-dose recombinant FVIIa (rFVIIa) sequential therapy. The patient, a teenage male, was treated with these agents in the order of FVIIa/FX and high-dose rFVIIa during major bleeding that was difficult to stop. The activated partial thromboplastin time (APTT) was shortened and thrombin generation and FVII antigen levels were increased after treatment compared to before treatment. On the other hand, FX antigen level was increased only after FVIIa/FX administration. Compared to high-dose rFVIIa single administration, the coagulation capacity after additional high-dose rFVIIa administration on the day after FVIIa/FX administration tended to be stronger. No signs of overcoagulation were observed with the sequential therapy. The results suggest that additional rFVIIa administration may be a reasonable hemostatic strategy for refractory hemorrhage in hemophilia B patients with inhibitors when plasma FX levels are maintained at high levels after FVIIa/FX administration.

1．緒言

先天性血友病患者の止血治療の基本は，欠乏する血液凝固第VIII因子（FVIII）または第IX因子（FIX）の補充であるが，反復輸注によりFVIIIまたはFIXに対する同種抗体（インヒビター）が発生することがある．一旦インヒビターが出現すると，通常のFVIIIまたはFIX製剤の止血効果は著しく低下するため，出血時にはバイパス止血療法や中和療法が選択される．バイパス止血療法は患者毎や出血エピソード毎に有効性の製剤間差がみられることがあるため，単剤で止血効果が乏しい場合は，他剤との併用投与により奏効することがある^{1, 2）}．しかしながら，その投与方法（投与間隔，投与量，投与順など）は確立しておらず，併用時には血栓症発症リスク増大の懸念もあるため，血小板数，フィブリノゲン，フィブリノゲン・フィブリン分解産物（またはD-dimer）などの血栓マーカー検査による慎重なモニタリングが必要となる^3）．

現在，国内で使用可能なバイパス止血製剤は，上市順に，活性化プロトロンビン複合体製剤（activated prothrombin complex concentrate: aPCC），遺伝子組換え活性型血液凝固第VII因子製剤（rFVIIa），乾燥濃縮人血液凝固第X因子加活性化第VII因子製剤（FVIIa/FX）の3剤があり，aPCCとrFVIIaの併用投与については国内外で多くの使用実績の報告がある ^4–11）．一方，FVIIa/FXは上市時期が最も遅く，国内でのみ使用可能という事情もあるため，併用に関する報告は限られている^{12, 13）}．

今回，難治性の破綻出血に際して，FVIIa/FX，高用量rFVIIaの順で投与することにより有効な止血が得られた血友病Bインヒビター1例を経験した．出血時の止血管理としての両剤の併用療法の報告は稀少であるため，併用療法中の凝固能について報告する．

2．対象および研究方法

対象は，20xx年5月4日から20yy年11月26日までの間に，むつ総合病院小児科で止血治療を受けた血友病Bインヒビター（10代，男性）である．小児期に重症血友病Bと診断され，FIX製剤の補充療法を受けていた．FIXに対するインヒビター（最高値61.1 BU/mLのハイレスポンダー）の発生以降，軽度な出血時には通常量のrFVIIa単剤を用いていたが，交通外傷などを含めた加重関節の出血を繰り返しており，rFVIIa単剤では止血困難な経験が多々あったことならびにaPCCには投与後蕁麻疹が出現したため使用困難であったことから，初期治療として，強い疼痛の場合はFVIIa/FX，弱い疼痛の場合はrFVIIaを選択していた．また，止血困難の際にはFVIIa/FX（FVIIa量として90 μg/kg，以下同様）および高用量rFVIIa（240 μg/kg）の併用療法を行っていた．

本研究では，上記期間中に生じた関節出血のうち，中等度以上で通常量のrFVIIa単剤では止血が不十分と予想された右足関節内，左足関節内，左膝関節内の出血エピソード3件（いずれも低力価インヒビター）に対して，患者の同意を得た上で，重症度の違いに応じて，それぞれ初期治療として「FVIIa/FX投与翌日（24時間後）の高用量rFVIIa追加投与（併用投与）」，「FVIIa/FX単独投与」，「高用量rFVIIa単独投与」を施行し（Fig. 1），それぞれ投与前と投与後30分後に採取した血漿検体を用いて，FVII抗原量（FVII:Ag），FX抗原量（FX:Ag），活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time: APTT），トロンビン産生およびD-dimerを測定した．測定試薬として，FVII:AgはAsserachrom® VII:Ag Kit（Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine, France），FX:AgはHuman FX ELISA Kit（Abcam, Cambridge, UK），APTTはデータファイ・APTT®（SIEMENS, Marburg, Germany），トロンビン産生はFluCa kit®，PPP-Reagent LOW®，Thrombin Calibrator（いずれもThrombinoscope BV，Maastricht，the Netherlands）を使用した．D-dimerは株式会社エスアールエルに測定を外注した（測定試薬：LATECLE Dダイマー試薬（カイノス，Tokyo，Japan），測定機器：JCA-BM8020（日本電子，Tokyo，Japan））．

Fig. 1

Administration and blood sampling schedule

血漿検体は，3.2％クエン酸ナトリウム入り採血管で採血後（クエン酸ナトリウム：血液＝1：9），3,000 rpm（1,400×g）で10分間室温での遠心により分離し（残存血小板数は未測定），8時間以内に測定可能な場合は室温で保存し，8時間を超える場合は–20°Cで凍結保存した．なお，投与前後で測定系に影響を与えるヘマトクリット値に大きな変化はみられなかった．

本研究は，むつ総合病院（むつ病000～314）およびKMバイオロジクス株式会社（2020年9月25日No. 20-03）の倫理審査委員会の承認ならびに対象者および代諾者の同意を得た上で，既存試料を用いる観察研究として実施した．

3．結果

1）抗原量検査

各製剤投与前後の抗原量検査（FVII:AgおよびFX:Ag）の結果をFig. 2^{14, 15）}に示す．FVII:AgはFVIIとFVIIaそれぞれの抗原量の合算値を示し，各製剤の投与前後におけるFVII:Agの変動は製剤由来のFVIIa抗原量の変動とした．「併用投与」の高用量rFVIIa追加投与前後（前日にFVIIa/FX投与済み）ではFVII:Agは1.30 μg/mL（約26 nM）増加した．なお，投与前のFX:Agは24.25 μg/mL（約411 nM）と高値であった．「FVIIa/FX単独投与」の前後ではFVII:Agは0.43 μg/mL（約8.6 nM），FX:Agは9.88 μg/mL（約167 nM）増加し，「高用量rFVIIa単独投与」の前後ではFVII:Agは1.69 μg/mL（約33.8 nM）増加した．

Fig. 2

Change of FVII and FX antigen levels

FVII:Ag, factor VII antigen; FX:C, factor X antigen.

※1 24 hours after FVIIa/FX dosing and before rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

※2 after rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

2）凝血学的検査

凝血学的検査の結果をTable 1に示す．「併用投与」，「FVIIa/FX単独投与」，「高用量rFVIIa単独投与」のいずれも投与前後でAPTTは14.3～38.6秒短縮し，D-dimerは0.10～0.14 μg/mL微増した．

Table 1 Various coagulation/fibrinolysis markers

	FVIIa/FX and rFVIIa Sequential administration			FVIIa/FX Single administration			High-dose rFVIIa Single administration
	before※1	after※2		before	after		before	after
APTT (sec) (normal range: 26–36 sec)16)	55.6	41.3		105.8	76.8		113.4	74.8
D-dimer (μg/mL) (normal range: <1.0 μg/mL)17)	1.35	1.49		0.82	0.95		0.89	0.99
TG parameters
Peak thrombin (nM)	33.93	51.92		9.03	49.9		4.11	21.91
ETP (nM・min)	556.30	779.57		251.40	923.68		133.68	442.22

APTT, activated partial thromboplastin time; TG, thrombin generation; ETP, endogenous thrombin potential.

※1 24 hours after FVIIa/FX dosing and before rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

※2 after rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

トロンビン産生試験により得られたトロンボグラム（トロンビン産生の波形）をFig. 3に，トロンボグラムから得られた各パラメータをTable 1^{16, 17）}に示す．「併用投与」，「FVIIa/FX単独投与」，「高用量rFVIIa単独投与」のいずれも投与前後でトロンビン産生は増加した（Fig. 3A～C）．「併用投与」は，前日にFVIIa/FXを投与しており，高用量rFVIIaの追加投与前でもpeak thrombinおよびendogenous thrombin potentialは，「高用量rFVIIa単独投与」後よりも高値を示した．「併用投与」後のトロンボグラムは「FVIIa/FX単独投与」後と同様なパターンを呈し，「高用量rFVIIa単独投与」後に比して，強いトロンビン産生が示された（Fig. 3 D）．

Fig. 3

Thrombogram on the different conditions

HD-rFVIIa, high-dose rFVIIa; sequential, FVIIa/FX + high-dose rFVIIa.

※1 24 hours after FVIIa/FX dosing and before rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

※2 after rFVIIa dosing (refer to Fig. 1)

3）臨床的効果

本研究における出血エピソード3件に対する各治療の臨床的効果を以下に示す．なお，いずれのエピソードも過凝固を示す臨床症状はみられなかった．

i）右足関節痛（May 4–6, 20xx）：疼痛が強かったため，FVIIa/FXを単回投与したが，疼痛に変化がなかったため，投与24時間後に高用量rFVIIaを投与し疼痛はやや改善した．FVIIa/FX投与から48時間後に再び高用量rFVIIaを投与し疼痛が大幅に改善したため，治療を終了した．

ii）左足関節痛（July 5, 20yy）：疼痛が強かったため，FVIIa/FXを単回投与し疼痛が大幅に改善したため，治療を終了した．

iii）左膝関節痛（Nov 9–10, 20yy）：疼痛が弱かったため，高用量rFVIIaを単回投与し疼痛はやや改善した．投与から24時間後にはほぼ疼痛が消失したため，治療を終了した．

4．考察

酵素反応速度論では，基質濃度がK_m値より十分に高い場合は，基質を追加しても酵素反応速度の上昇はわずかだが，基質濃度がK_m値付近の場合は，酵素反応速度は基質濃度に依存して上昇するとされている．酵素FVIIaの基質であるFXの生理的な血漿中濃度（約140 nM）は，K_m値（リン脂質存在下で250 nM，組織因子（TF）/リン脂質存在下で205 nM）^18）より若干低いため，FVIIa/FX投与によりFVIIaとFX濃度を同時に上げることで，FVIIaの酵素反応（FX活性化）速度は促進される^19）．

今回，血友病Bインヒビターの止血困難な破綻出血に対して，FVIIa/FX投与翌日の高用量rFVIIa追加投与を施行し，良好な止血管理が行えた症例を経験した．抗原量検査の結果，FVIIa/FX単独投与後にFVII:Ag（FVIIとFVIIaの合算値）およびFX:Agは上昇した．また，FVIIa/FX投与翌日（併用投与前）のFVII:AgはFVIIの生理的血漿濃度（約0.5 μg/mL（10 nM））と同程度であったが，FX:AgはFXの生理的血漿濃度（約8 μg/mL（140 nM））に比べて高濃度で維持されていた．これは，両因子の抗原量の半減期（FVIIa 3.5～4.9時間，FX 22.8～27.5時間）^20）を反映した結果と考えられる．また，凝血学的検査の結果，FVIIa/FX投与翌日の高用量rFVIIa追加投与では，高用量rFVIIa単独投与に比してトロンビン産生の亢進がみられた．トロンビン産生の亢進は，高濃度のFX存在下において，FVIIaの凝固活性が増強されたことを裏付けるものである．FVIIa/FX投与翌日の高用量rFVIIa追加投与前であっても，高用量rFVIIa単独投与と同等以上のトロンビン産生の亢進がみられた．FVIIa/FXのin vitro試験^17）または臨床試験^{21, 22）}で報告されたように，生理的な濃度のFVIIa存在下でFX濃度を上昇させることにより，バイパス経路が活性化され，止血が得られる可能性が示唆された．さらに，併用療法の前後でD-dimerは大きく変動しておらず，過凝固を示す臨床症状もなかったことから，安全性への懸念は低いと考えられた．

以上より，難治性の出血に際して，FVIIa/FXの投与後，さらに止血を要する場合にはrFVIIaの追加投与が治療オプションとなり得る（FVIIa/FXは添付文書上，初回投与から36時間以上，追加投与から48時間以上の間隔をあける必要がある）．血漿中FX濃度が高い状況下でのrFVIIa追加投与により凝固能が増強されることが今回示唆されたことから，FVIIa/FXとrFVIIaの併用療法は合理的な止血戦略になり得ると考えられた．

なお，本症例は単施設の観察研究の1例のみの結果であり，併用療法の投与用量，投与間隔，または投与の順番も単一条件，血栓マーカーもD-dimerのみと限定的であった．また，血漿検体の処理条件は日本検査血液学会の推奨条件^23）を準拠できていない部分があり，残存血小板による本解析への影響については検討できていない．併用療法を最適化するためには，今後更なる症例数の追加が待たれる．今後は多施設で例数を増やし，投与条件を検討の上，併用療法を最適化する必要がある．

＊本研究成果の一部は第43回日本血栓止血学会学術集会にて発表した．

著者全員の利益相反（COI）の開示：

中畑　徹：本論文発表内容に関連して開示すべき企業等との利益相反無し

髙見英輔，大隈浩一，中野宏俊：役員・顧問職・社員など（KMバイオロジクス）

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