ガラス化保存ウシ胚盤胞の栄養外胚葉におけるカテプシンBの動態

抄録

【目的】カテプシンB（CTSB）はリソソームプロテアーゼであり，細胞内消化や細胞死に関与する。我々は，これまでにウシ卵子・胚の品質の程度や暑熱曝露の有無によるCTSBの動態変化を明らかにし，卵子・胚の品質や障害指標としての利用可能性を提示した。CTSBを指標としたガラス化保存による障害評価はウシ卵子やヒツジ卵子で報告されているが，ウシ胚盤胞では未報告である。ウシ胚盤胞では，ガラス化保存を含む凍結保存により，胚内側の内部細胞塊（ICM）と比べて，胚外側の栄養外胚葉（TE）における高頻度のDNA損傷が報告されていることから，ガラス化保存ウシ胚盤胞のTEにおける障害評価が重要であると考えられる。本研究ではウシ胚盤胞のTEにおいて，ガラス化保存による障害とCTSBの関連性解明を目的とした。【方法】体外受精・発生させたウシ胚盤胞をガラス化保存し，加温・回復培養に供した後の生存胚を実験に用いた。まず，Magic Red®によるCTSB活性検出とTUNEL染色をガラス化保存胚盤胞全体で行った。その後，定量的な解析を行うため，ブレードを用いた顕微操作により胚盤胞をICMとTEに切断分離し，単離したTEにおけるCTSB活性の測定およびqPCRによるCTSB遺伝子の発現解析を行った。また，CTSBとアポトーシスとの関連が報告されていることから，アポトーシス関連遺伝子も同時に発現解析を行った。【結果】ガラス化によってウシ胚盤胞全体のDNA損傷レベルが上昇した。また，無処理対照胚と比較して，ガラス化保存胚盤胞のTEにおけるCTSB活性の上昇が観察され，この結果は単離したTE単独においても同様であった。さらに，ガラス化保存後単離TEにおいて，CTSB遺伝子とアポトーシス関連遺伝子（BAX, CASPASE-9, CASPASE-3）の発現上昇が確認された。これらの結果から，ガラス化保存によりウシ胚盤胞のTEにおけるCTSBの遺伝子発現および細胞内活性が上昇し，ミトコンドリアを介したアポトーシスが亢進されたことが示唆された。