臨床的効果改善にむけた悪性脳腫瘍に対するPhotodynamic therapy（PDT）の基礎的研究

Abstract

光線力学的療法（Photodynamic therapy: PDT）の主たる腫瘍殺傷効果は生成された一重項酸素による腫瘍細胞のアポトーシスやネクローシスとされており，その効果はおおむねレーザーの組織深達度に依存している．PDTは既に悪性神経膠腫を含む脳腫瘍に臨床応用されているが，更なる治療効果の向上が望まれる．その向上のために単純にレーザー強度をあげることは周辺正常組織損傷助長の点より現実的でないため，昨今は周辺正常組織損傷を抑えたままPDT効果を高めるための研究が行われている．光感受性物質の腫瘍集積のコントラストを上げることがその主たる解決策であるが，その根幹となる光感受性物質における腫瘍特異的集積現象の機序解明，およびその臨床応用に関する研究は現在も途上にある．このような現行の光感受性物質における腫瘍特異的集積現象の改善の研究に加え，次世代の光感受性物質を用いたPDTに関する基礎的・前臨床的研究，あるいは免疫療法との併用に関する研究も今後の重要なテーマであろう．これらの研究結果を臨床応用することにより，PDTは今後さらに重要な臨床的役割を担っていくことが期待される．

Translated Abstract

The main tumor killing mechanism of photodynamic therapy (PDT) is apoptosis and necrosis of tumor cells after generation of singlet oxygen species and this effect is mainly dependent on the depth of laser irradiation penetration. PDT using talaporfin sodium as a photosensitizer has already been applied clinically for high-grade glioma treatment and improvement of its further therapeutic effect is highly desired. Recently, basic research and preclinical evaluation of PDT to improve its effect while minimizing surrounding normal tissue damage has been performed, since simply raising laser power to improve PDT effect is not realistic in view of damage to surrounding normal tissue.

The main countermeasure might be the increase in accumulation of already known photosensitizers in tumor tissue. However, the search for mechanisms of tumor-specific accumulation of the photosensitizers and their interactions with key molecules of tumor cells is still underway. Using next generation photosensitizers and combination with immunotherapy, as well as increasing the tumor accumulation of existing photosensitizers, are important issues regarding basic research on and preclinical evaluation of PDT, and application of such new findings will result in the increase of the clinical role of PDT.

1.  悪性神経膠腫における光線力学的療法（Photodynamic therapy: PDT）

近年悪性神経膠腫に対し，術中電気生理モニタリング，覚醒下手術による脳機能マッピング，術中MRI，拡散テンソル画像を用いたtractographyなどにより安全かつ最大限の摘出術（Maximum safe resection）が可能となってきている．5-aminolevulinic acid（5-ALA）の経口投与により，生体内で産生されるポルフィリン（porphyrin）の1つであるprotoporphyrin IX（PpIX）による術中蛍光診断（Photodynamic diagnosis: PDD）も摘出率の改善や生検術の際の正確性向上に貢献している^1,2)．摘出率の向上に伴う予後延長効果が期待される一方で，Eloquentな部位においては，画像上造影効果のある領域の辺縁部ぎりぎり，あるいはわずかに造影部位を残存させた状態で摘出する必要性があることもあり，残存領域あるいは辺縁の浸潤領域からの再発率は依然として高く³⁾，局所治療効果を高めるための新たな手法が望まれている．

PDTは，腫瘍特異的集積性が高い光感受性物質（Photosensitizer）と励起レーザー照射による光化学反応を利用することで，腫瘍細胞選択的な治療効果を得ることをコンセプトとした手法である^4,5)．PDTにおける光化学反応は，機構の違いから励起三重項状態となった光感受性物質が直接的に生体組織と反応し生成されたフリーラジカルが溶存酸素である三重項酸素と反応して腫瘍細胞に傷害を与えるType 1，および励起三重項状態の光感受性物質から組織中の溶存酸素である三重項酸素へのエネルギー移動により生成された一重項酸素が腫瘍細胞に傷害を与えるType 2に大別される⁶⁾．この光化学反応の主役である一重項酸素は0.04～4 μ（マイクロ）秒と短寿命であり，使用するレーザーは低出力のものが用いられているため，正常細胞への障害性は著しく軽微であると考えられている．

PDTにおいては後者の機序が主とされているが，詳細な腫瘍細胞死のメカニズムについて次節にのべる．

2.  PDTによる腫瘍細胞死のメカニズム

PDTにより誘発される細胞死の主たる機序はアポトーシスであるが⁷⁾，他にもオートファジー，パラプトーシスがあり，稀にネクローシスも生じるといわれている⁸⁾．また免疫学的機序⁹⁾や血管内皮障害による機序なども提言されている．

PDTによるアポトーシスについては，近年の研究により次のような機序が提唱されている．すなわち，PDTによりミトコンドリア膜内のBcl-2などのanti-apoptotic proteinにphotodamageが生じ，機能喪失する．これによりミトコンドリア内のチトクロームCが細胞質内へ放出され，アポトーシスが誘導される．一方，PDTによりライソゾームへのphotodamageも生じ，ライソゾーム内からプロテアーゼが放出されBIDタンパクの亀裂が生じ，その結果pro-apoptotic proteinである転写型BID（tBID）が細胞質内に増加し，tBIDがミトコンドリア内のチトクロームCの喪失を促しアポトーシスが誘導される⁸⁾．

オートファジー，パラプトーシス，ネクローシスによる細胞死についても簡潔に述べておく．オートファジーは，飢餓状態にある細胞の構成要素をうまく再利用するためのシステムである．PDT後の細胞死のプロセスにおいて，オートファジーあるいはオートファジーに関連したタンパク質が関与している．詳細はまだ不明な部分もあるが，特にライソゾーム関連の細胞死において，オートファジー関連タンパク質のATG7¹⁰⁾やATG5¹¹⁾が関与しているという報告もある．ネクローシスは直接的細胞膜損傷による細胞膜破壊や細胞融解が起きる現象であるが，PDTにおいて，光感受性物質の過量投与やレーザーの過量照射に伴い生じることがある^8,12)．パラプトーシスとは，アポトーシスとは異なるメカニズムによる細胞死であり¹³⁾，アポトーシスによくみられるカスパーゼ活性化，細胞核のクロマチンの凝集，細胞核の断片化は生じない．顕微鏡下による観察で，PDT後のパラプトーシスを起こした細胞では細胞質内の小胞体やミトコンドリア内に著明な空隙変性を来すが，一方で核内の変化は生じない¹³⁾．

PDTによる微小血管の障害については，病理学的には血管内皮の陥凹による基底膜の露出や血栓形成が認められ，血管内皮の障害，血管閉塞が関与するとされる．基底膜の細胞外マトリックスに関与するインテグリンなど膜タンパクの機能低下が原因の1つと考えられているが^14,15)，血管内皮のNO反応性低下も報告されている．血管透過性の亢進も起こることが知られており，血管内皮細胞に細胞間隙が形成されることで生じるが¹⁶⁾，ヒスタミンやVEGFの関与も報告されている．なお，PDT後にリンパ球や好中球，マクロファージが照射組織へ浸潤し，免疫反応を賦活化することが知られているが，本現象もこの血管透過性亢進と関係が深い．

3.  細胞障害可能な深達度の拡大に関する基礎的研究

PDTに使用する第二世代光感受性物質であるtalaporfin sodium（Fig.1）は植物クロロフィル由来の光感受性物質であるクロリン骨格を基本にアスパラギン酸がアミド結合した分子量799.69の単一物質であり，664nmの赤色域レーザー光で励起される¹⁷⁾．talaporfin sodiumはすでに2004年には本邦で早期肺がんに対するPDT用薬剤として保険適応を獲得している．これまで，脳腫瘍に対してはporfimer sodium（polyhematoporphyrin ether/ester）といったhematoporphyrin誘導体（hematoporphyrin derivative: HPD）やtemoporfinを用いたPDTの臨床研究が複数行われてきたが¹⁸⁾，talaporfin sodiumを用いた悪性脳腫瘍に対するPDTの医師主導治験¹⁹⁾ならびに保険収載を契機として，本剤を用いたPDTが飛躍的に拡大した．また前述した5-ALAも術中蛍光診断のみならずPDTとしての効果が期待され，従来より基礎・臨床研究が行われているが，PDDとして製剤化された近年において再注目されている²⁰⁾．また，同製剤を放射線治療の増感剤として治療に用いるという着想もあり，基礎的研究が行われている²¹⁾．

Fig.1 

Photosensitizers used for photodynamic diagnosis and/or therapy

A: Protoporphyrin IX (PpIX) accumulated in tumor cells after intake of 5-aminolevulinic acid (ALA) that is a photosensitizer used as photodynamic diagnosis (PDD) for high-grade gliomas. B: Hematoporphyrin IX (HpIX) is a dicarboxylic acid which derives from PpIX. C: Talaporfin sodium is also a photosensitizer used in PDT. All compounds have a cyclic structure called as porphyrin.

このようにPDTは，既に悪性脳腫瘍に臨床応用されている治療法ではあるものの，光感受性物質を取り込みにくい腫瘍細胞が存在する問題や664 nm付近のPDT半導体レーザーでは浅い組織深達度（5 mm程度）しか得られない点など，いくつかの改善すべき問題を有するため，現在もこれらを克服するための基礎的研究が行われている．

PDT効果や組織深達度を高めるため，最も理解しやすい方法は照射エネルギーを上昇させることであろう（Table 1A）．一重項酸素の発生量は光量，細胞内蛍光物質量に相関し，照射エネルギーの上昇によって細胞障害可能な深達度を深くすることができる^22,23)．実際に照射エネルギーを上昇させることにより悪性神経膠腫の予後を改善できたとする報告もある²⁴⁾．一方で照射エネルギーの上昇によって周囲正常組織の損傷は大きくなることが知られているため，血管内皮の損傷による正常血管の脳梗塞リスクを鑑み，悪性神経膠腫の実臨床においては，肺がんや食道がんのPDTに比しエネルギー密度を27 J/cm²（150 mW/m²で3分）に下げて行っている．また，vitroの研究や我々の研究室における動物モデルを用いた研究結果より^25,26)，talaporfin sodiumの投与量や投与からレーザー照射までの時間を変化させることでも，腫瘍反応性を変化させられる可能性がある．

Table 1  Proposed methods that improve photodynamic therapy (PDT) effect

A　腫瘍細胞への殺傷効果の増大

照射エネルギーの増大

照射波長の最適化

照射方法の最適化（照射距離の改善，内視鏡，反射鏡の利用など）

照射環境の最適化（温度調整，摘出口腔壁の平たん化など）

光感受性物質の改善（種類，濃度，投与時期の変更）

B　正常組織への侵襲の軽減

物理的遮蔽（遮蔽シートの利用など）

腫瘍集積コントラストの改善（光感受性物質の種類の変更，併用薬剤の使用）

正常組織を保護する薬剤の開発

4.  光感受性物質および腫瘍特異的集積現象の改善に関する研究

PDT効果を高めながらも，周辺正常組織損傷を抑える一番の方法は，光感受性物質の腫瘍特異的集積を高めること，すなわち腫瘍集積のコントラストを上げることであろう（Table 1B）．talaporfin sodiumにおける腫瘍特異的な集積現象は，腫瘍細胞が特異的に光感受性物質を取り込むことで起こっていると考えられている．その機序としては，1990年代より様々な研究が行われており，low density lipoprotein (LDL) receptorあるいはその関連タンパク^27,28)やアルブミン結合^29,30)，heme carrier protein (HCP)-1の関与^31-33)など様々な報告がある．しかしながら，機序解明は完全ではなく更なる研究の余地があろう．この機序解明に関する基礎的研究こそが，腫瘍特異的蛍光物質集積現象の改善に大いに貢献すると考えられる．

我々は，上記に示した機序に関連する物質のうち，特にHCP-1（SLC46A1）に注目している．HCP-1はマウス十二指腸よりHemeを輸送する12回膜貫通タンパクとして発見され，マウス腎臓やラット肝臓や脾臓での発現が確認されている．Hemeとポルフィリンの構造が相同であることからHCP-1がポルフィリン環を持つ物質の取り込みに関与するとする報告がある³¹⁾．本学の消化器内科研究グループの研究において，ラット由来の正常胃粘膜細胞RGM1には発現のないHCP-1がそのがん様変異細胞RGK1には強く発現し，さらに遺伝子挿入によって強制発現させることでポルフィリン集積量が増加し，ノックダウンによってポルフィリン集積量が減少した³²⁾．また我々の研究グループと前述のグループの共同研究におけるグリオーマの手術検体やcell-lineを用いた検討で，HCP-1は腫瘍細胞で発現が認められその発現率は悪性度と関連すること，HCP-1発現量とヘマトポルフィリン誘導体の取り込み量が相関することを示した³⁴⁾．その機序としては，腫瘍環境内において過剰産生されているミトコンドリア内のreactive oxygen species（mitROS）が一酸化窒素を介して低酸素誘導転写因子（HIF1α）を安定化し，その下流にあるHCP-1の発現亢進を引き起こすと考えられている^35,36)．

以上の点より，我々はFig.2に示すとおりHCP-1発現が低い細胞と高い細胞において，レーザー照射後の蛍光強度や一重項酸素によるPDT効果が異なる，すなわちHCP-1などの光感受性物質のトランスポーターがPDT効果のカギとなる物質であると考えている．さらに，我々はこの増強剤としてNSAIDsの一種であるインドメタシンに注目している．インドメタシンは正常胃粘膜細胞においてROSを産生する電子伝達系において脱共役を引き起こすことでROSの産生を亢進させるが，我々は悪性神経膠腫においても，インドメタシンの投与によって，ラット脳腫瘍細胞内の活性酸素量が増加しHCP-1発現が亢進することと同時にヘマトポルフィリン誘導体の腫瘍特異的集積効果が増強することを見出した³⁷⁾．この知見は，悪性神経膠腫患者に対するインドメタシン投与によるROSの産生亢進がHCP-1の発現亢進を介して，腫瘍特異的蛍光物質集積現象を2割程度増強できる可能性を示唆している．

Fig.2 

Schematic illustration of expression mechanism of porphyrin transporters and PDT effect in brain tumor cells.

Porphyrin transporters including heme carrier protein (HCP)-1 are expressed in brain tumors. Dose of singlet Oxygens produced after injection of a photosensitizer coupled with laser irradiation in a transporter low-expressing tumor cell (A) is lower than in a high-expressing tumor cell (B)

また，第二世代光感受性物質であるtalaporfin sodiumを超える腫瘍特異的集積を有する次世代の光感受性物質も開発・臨床応用され始めている^38-40)例えば，従来の光感受性物質の概念とはかなりコンセプトを異にするが，他がん腫において，腫瘍特異性抗体反応を利用した光感受性物質に近赤外光線を行う近赤外光線免疫療法（光免疫療法，Near infrared photo-immunotherapy: NIR-PIT）が開発されている^38,39)．NIR-PITは癌細胞や免疫抑制性の細胞を標的とする分子標的薬に光吸収体を結合した複合体を患者に投与した後に近赤外線をあて，標的細胞を物理的に破壊しICDを強力に惹起することにより非照射部位に対しても免疫学的機序により腫瘍殺傷をもたらすというコンセプトであり，すでに2015年より再発頭頸部扁平上皮がんに対する臨床治験がはじまっており，現在，日本を含む世界各国で臨床試験が開始されているところである．

5.  PDTと免疫，およびその臨床応用

以前よりPDTによる腫瘍殺傷の機序として，上述の機序以外にTGFやTNF等のサイトカインを介した免疫学的機序⁴¹⁾が推察されていたが，近年PDTによる腫瘍細胞死のメカニズムとして，PDT自体が免疫原性細胞死（immunogenic cell death: ICD）を惹起するという機序が提唱されている⁹⁾．PDTが癌細胞に作用し，HMGB1，Calreticulin，ATPなどのDamage-associated molecular patterns（DAMPs）や炎症性サイトカインを放出させ，その結果，樹状細胞やNK細胞が刺激され，腫瘍障害性リンパ球がサイトカインを放出すると考えられている⁹⁾．それ以外にもHSPなど多彩な免疫機構に影響を与えることが分かっており，他がん種において免疫機序を利用した治療や免疫療法との併用について研究が行われている⁴²⁾．脳腫瘍においては，liposomally formulated phospholipid-conjugated indocyanine green（LP-iDOPE）を用いたPDTにおいて，アポトーシスやネクローシスのみならず，CD8+ T細胞とmacrophage/microgliaの集簇も起こり免疫学的機序が関わっていることが示されている⁴³⁾．

PDTに用いる光感受性物質そのものが腫瘍免疫に関わるとする報告もある．グリオーマ細胞と5-ALAを用いた基礎研究において，励起レーザー照射を行わなくとも5-ALA投与自体が，cyclooxygenase (COX)-2とmicrosomal prostaglandin E (PGE) synthase-1抑制を介しマクロファージによるPGE₂産生を抑制し，腫瘍免疫に作用することが示されている⁴⁴⁾．また，腫瘍免疫や腫瘍増殖に関係の深い腫瘍幹細胞に関連したPDT研究も行われている．最近の研究では，5-ALAの投与により膠芽腫のstem-like cellにPpXIが集積し，PDTによる殺傷効果が増強されることが示されている⁴⁵⁾．

局所療法と免疫療法を併用する研究は，従来より放射線と免疫療法の併用として盛んに行われてきたが⁴⁶⁾，近年局所療法であるPDTがICD惹起などにより免疫を賦活する機序を利用し，PDTと免疫療法を併用することをコンセプトとした研究が他がん種で活発化している．先述のNIR-PITも厳密にはPDTと免疫療法との併用療法とは表現するべきではないが，光照射後の反応による免疫賦活機序を最大限に活用している点では類似している．他がん種では様々な種類のPDTと免疫療法を含む幾多の療法との組み合わせが研究されてきているが^47-50)，脳腫瘍については研究が開始されたばかりであり，今後の発展が期待される．

6.  PDTの基礎的研究のまとめ

このように本稿では，PDTにおける腫瘍特異的集積現象の改善に関する研究や，腫瘍殺傷の機序に関連する研究，新規光感受性物質の研究，PDTと免疫療法の併用に関連した研究を紹介した．今後脳腫瘍においても腫瘍特異的集積を改善した次世代の光感受性物質が臨床応用される可能性があることに加え，talaporfin sodiumをグリオーマ以外の悪性脳腫瘍に臨床応用するための基礎的研究も行われている⁵¹⁾．PDT研究および臨床応用は今後も躍進していくことが期待される．

謝辞

本稿の執筆にあたり筑波大学医学医療系消化器内科　松井裕史先生および脳神経外科Alex Zaboronok先生，同科（現Ludwig Cancer Research-San Diego）三木俊一郎先生，産業医科大学脳神経外科　山本淳考先生にご助言を頂きましたことを深謝いたします．

利益相反の開示

利益相反なし．

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