抄録
単細胞緑藻のChlamydomonasは、RNAを鋳型とするRNA合成酵素遺伝子を持っていない。そのため、強力なノックダウンを実現するためには、大量の2本鎖RNAを安定的に供給する事が必須である。ところが、Chlamydomonas ではPol II酵素の強力なプロモーターであるrbcS2の上流配列を用いてinverted repeatを転写させ、ヘアピンRNAを生産させるように設計しても、一過的で不安定なノックダウンしか実現できない。そこで、我々はヒト細胞においてtRNAプロモーターを用い、RNAiの誘起が成功していることに注目した。spectinomycin耐性賦与遺伝子aadAを標的にし、Asp tRNA直後にaadAの5’-近傍の150bpで構成したinverted repeat DNA配列を連結し、silencerコンストラクトを作製した。これをaadAが発現している細胞に導入したところ、spectinomycin耐性が劇的に低下し、ヘアピンRNAの蓄積が確認された。ヘアピンRNAが効率よく転写され、かつ核外に輸送される系を確立するために、現在tRNAのアクセプターステム部に変異を導入した6種類のDNAコンストラクトを作成し、強く、かつ安定的にRNAiを誘起でき改変tRNA遺伝子を選抜している。
