高等植物では、花成誘導や胚乳のインプリンティングなど発生にかかわる様々な現象においてエピジェネティックな遺伝子の発現制御が行われていることが知られている。しかし、植物の個体としての形態形成において重要なステップであると考えられる維管束組織の形成過程でエピジェネティックな遺伝子発現制御が行われているか否かは、未だに明らかにされていない。そこで、道管の分化過程におけるクロマチンの動態に関する知見を得るために、単離した葉肉細胞の状態から管状要素分化過程を観察することのできるヒャクニチソウの培養系を用いて研究を開始した。まずDNA メチル化酵素阻害剤5-azacytidine とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤TSA の添加実験を行った。いずれの阻害剤を添加した場合でも、細胞分裂には大きな影響はみられなかったが、阻害剤の濃度および添加時間に依存的に管状要素への分化が阻害された。これは管状要素分化過程においてもクロマチンリモデリングが遺伝子の発現制御に関与している可能性を示唆している。また、新たに開発したヒャクニチソウジーンチップzinnia-17k を用いてマイクロアレイ解析を行っているので、その結果も合わせて報告する。

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カルジオリピン(CL)は、真正細菌から動植物のミトコンドリアにまで広く存在する特徴的な構造をもったリン脂質である。私たちは真核多細胞生物で初めてCL合成酵素遺伝子CLSを同定し、その遺伝子にT-DNAが挿入されたタグラインclsを解析することで、CLの機能を検討している。
通常栽培条件下のCLS/clsにおいて発生の初期過程で1/4の胚が萎縮するのが観察され、回収した種子を播種してもcls/clsなる植物体が得られず、また外来のCLS cDNAを導入した株ではcls/clsなる植物体が得られた。このため、CLSの破壊は胚性致死になるとこれまで報告してきた。しかしながら、YFPによってミトコンドリアを可視化したところ、CLS/clsの果実中でミトコンドリアの形態異常をもつ胚を発見し、これをcls/clsと推測して胚の発生過程を観察した。そして、その結果を踏まえて栽培条件等に改良を加えたところ、cls/clsなる植物体を得ることに成功した。cls/clsは子葉の維管束パターンが不完全であり、根をはじめとして生長が著しく遅い。また、乾燥に弱く、早い段階で頂芽優勢が崩れるなど、様々な異常を呈した。そこで、CLSの発現を推測するため、プロモーターGUS解析を行ったところ、発生後期の胚及び若い葉を中心としたシュートの維管束、気孔の孔辺細胞、主根のコルメラ細胞などが強く染色された。

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植物の胚で細胞の運命が決定されていく過程の分子機構はほとんど分かっていない。本研究では初期胚で細胞の運命や遺伝子の転写パターンを決める位置情報の伝達経路を解明するために、シロイヌナズナのATML1遺伝子の発現調節領域の解析を行った。ATML1は一細胞期の胚で既に発現が見られ、その後発現は最外層の原表皮細胞に限定されていく。高感度の核局在GFPレポーターを用いたプロモーター欠失実験の結果、ATML1プロモーターは幾つかの発現調節領域からなり、各領域は特定の位置の細胞における転写に関わることが分かった。101 bpの領域はATML1の胚における発現パターンに充分な全ての情報を含んでおり、その領域に存在する二つのホメオドメイン転写因子結合部位は胚の頂端側半分や胚柄における発現に必要であるが、表皮特異的な発現には必須でないことが分かった。面白いことにATML1は胚のapical-basal軸上の位置に応じて違った発現調節を受けており、さらに、apical-basal軸の形成に関わる植物ホルモンであるオーキシンとは無関係に表皮特異的な発現が決まることが分かった。現在、本研究で得られた配列を利用して、位置に応じた遺伝子発現を制御する転写因子の単離を進めている。

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減数分裂後の花粉成熟過程で小胞子は、受粉・発芽・受精に備えた体制を構築する。減数分裂後の四分子期一過的、タペート層特異的に発現し、PHDフィンガーモチーフを含むタンパク質をコードするシロイヌナズナMS1遺伝子は、初期の成熟過程に関与することが示唆されている。そこで我々は、花粉成熟機構を理解するために、MS1遺伝子の機能解析を細胞生物学的・分子生物学的、両側面から行った。完全不稔を示すms1突然変異体と部分的な不稔を示すMS1-SRDX形質転換体の表現型解析から、MS1は花粉とタペート層の発生に重要であることが示された。（SRDXは転写抑制ドメイン。）また、MS1-SRDX形質転換体がms1様表現型を示したこと、MS1は核移行シグナルおよび機能的PHDモチーフを持つことから、MS1は転写因子として機能していることが強く示唆された。一方、マイクロアレイの公開データとグルココルチコイド誘導系を用いて、MS1遺伝子が制御する下流遺伝子群の探索を行った。その結果、スポロポレニン合成に関与すると思われる遺伝子群や、タンパク質のオルガネラ輸送に関与すると思われる遺伝子群、転写因子群などがMS1に近い下流遺伝子であることが明らかとなった。これらの推定遺伝子機能は、ms1突然変異体とMS1-SRDX形質転換体の表現型を説明できる。また、MS1制御系の高等植物における普遍性も議論する。

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シロイヌナズナのTEBICHI (TEB) 遺伝子は、動物でDNA損傷の修復もしくは損傷に対する応答反応に関わると考えられているMUS308/POLQタンパク質のホモログをコードし、teb変異株はメリステムの構造や器官の形態に異常を来す。teb変異株ではDNA二本鎖切断に応答する遺伝子の発現が上昇し、また、細胞周期のG2/M期に発現するcyclinB1::GUSを発現する細胞がメリステムにおいて増加することが明らかになっている。この、tebにおけるcyclinB1::GUSの上昇を、DNA複製チェックポイント機構にかかわるATRの変異が抑制したことから、tebではDNA複製が異常であり、ATR依存的DNA複製チェックポイントが活性化していることが示された。しかしながら面白いことに、atr変異はteb変異株の形態の表現型を亢進した。また、teb atr二重変異株では針状の葉の形成が観察された。葉切片や表皮細胞の観察、さらに背軸側で発現するFILAMENTOUS FLOWER遺伝子の発現解析より、tebもしくはteb atrでは葉の背軸側化が起きていることが示された。これらの結果より、DNA複製中のTEBの機能が、背軸側の分化を抑える、もしくは向軸側の分化を促進する機構に関わると考えられた。葉の向背軸形成に関わる遺伝子との遺伝学的な解析により、TEBの機能と向背軸の関係について解析を進めており、その結果を併せて報告したい。

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葉は、茎頂メリステムから3つの軸（向背軸・基部先端部軸・左右軸）に沿って発生分化する扁平で左右相称的な器官である。葉の形態形成の分子機構を明らかにするために、我々は葉の左右相称性に関与する遺伝子としてシロイヌナズナのASYMMETRIC LEAVES1 (AS1)及び、ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2)を解析してきた。as1変異体、as2変異体はともに左右相称性にゆがみを生じる他、葉の扁平性、葉脈パターンも野生型と異なっている。また、特にas1変異体では基部先端部軸方向の成長が抑制されている。一方、これらの変異体の葉では、茎頂周辺で発現しメリステムの形成、維持に関わると考えられているclass 1 KNOX遺伝子群の転写産物が異所的に蓄積しており、AS1, AS2遺伝子がclass 1 KNOX 遺伝子群の発現抑制に関与すると考えられる。そこで、今回我々は、AS1, AS2によるclass 1 KNOX遺伝子の抑制と葉の正常な形態形成との関係を明らかにするためにas1変異またはas2変異とともにclass 1 KNOX遺伝子の変異を保持する多重変異体を作製しその表現型を解析した。その結果について報告する。

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To study the shoot formation in orchid, we analyzed the function of Arabidopsis Class I KNOX genes KNAT1 and a leaf gene ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) under the control of Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA promoter in Natural Indonesian orchid, Phalaenopsis amabilis. In this study, those two genes were transformed using Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. We got 11 lines of KNAT1 transgenic protocorm (developing orchid embryo) that formed multishoots (4-31 shoots developed from one embryo) and 79 lines of AS2 transgenic orchid plants. Detection of transgenic lines were performed by Kanamycin selective medium and PCR. The shoot formation in 4 lines of KNAT1 transgenic plants showed multishoots and alteration of leaf shapes. P35S::AS2 transgenic plants showed smaller leaf blade with abnormal vascular pattern, and dwarf shoots. Histological analysis of protocorm in KNAT1 transgenic plants showed that shoot initially come from some area in the periphery.

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ミロシン細胞は異型細胞の一種であり，アブラナ科の植物のみに見られる．ミロシン細胞はその液胞にβ-グルコシダーゼの一種であるミロシナーゼを含有する．虫などの食害によって組織が損傷を受けると，ミロシナーゼが基質であるグルコシノレートを分解し，忌避物質であるイソチオシアネートを産生して生体防御に働く．ミロシン細胞分化の過程を知るために，CRES-T(Chimeric REpressor Silencing Technology)法によって作製された転写因子の変異体ライブラリーを用いて，ミロシン細胞の分布や数に異常を持つシロイヌナズナ変異体を選抜した．変異体ライブラリーの植物体のロゼット葉をイムノブロットに供して，野生型と比較してミロシナーゼの蓄積量に変化のある変異体をスクリーニングした．最終的に，機能未知の2種の転写因子を同定した．これら2種の転写因子は相同性が高く，器官別の発現パターンも類似していた．両転写因子の発現はミロシン細胞数が増加するatvam3変異体で低下していた．ミロシン細胞の分化におけるこれらの転写因子の機能を議論したい．

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TCP転写因子は葉の形状を制御することが知られているが、その機能については明らかになっていない。そこで、キメラリプレッサーを植物内で発現させることによりその標的遺伝子の発現を抑制するCRES-Tシステムを用い、TCPの機能解析を行った。その結果、TCPキメラリプレッサーを発現させた植物体では、子葉や葉、がくや花弁などの花器官の形態に異常を示し、子葉において異所的なシュートを形成することを明らかにした。CUP SHAPED COTYLEDONs (CUCs)は器官境界部で特異的に発現し、分裂組織形成に必要な制御因子であるが、TCPキメラリプレッサー発現体では、CUCが本来発現を示さない子葉やロゼット葉を含む各器官において異所発現することが判った。さらにTCP3キメラリプレッサー発現体では、CUC転写産物を切断するmiR164の蓄積量の減少が認められた。一方、TCP3を過剰発現させた植物では、CUCの発現が抑制され、CUC遺伝子の欠損株と似た形態を示した。また、TCP3遺伝子の発現は子葉において認められたが、CUC遺伝子の発現部位である子葉の境界部には認められなかった。これらの結果からTCP3キメラリプレッサー発現体における形態異常の原因はCUCの異所発現であり、子葉で発現するTCP3がCUCの発現を負に調節することにより、地上部器官の形態や分裂組織の形成を制御すると考えられる。

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シロイヌナズナのSPL10はSBP-boxファミリーに属する植物特異的転写因子である。このファミリーは、SBPドメインをDNA結合領域として持ち、AP1プロモーターへの結合が示されていることから、花で機能することが示唆されている。しかし、それらの生物学的な役割は、まだ不明な点が多い。我々はSPL10の機能を調べるため、形質転換体を用いた解析を行った。SPL10に転写抑制ドメインを付加したキメラリプレッサー(SPL10-SRDX)を植物体内で過剰発現させると、頂芽優勢の欠失、矮小化、花序形態の異常、花器官およびさやの縮小化が見られた。さやはful変異体と同様な表現型を示した。FULはAP1の相同遺伝子であり、一部重複した機能を持つ。35S:SPL10-SRDX植物体ではFULの発現が低下していたが、AP1の発現は野生型と差がなかった。次に、SPL10過剰発現体を作出したが、形態に変化は見られなかった。しかし、SPL10はmicroRNAの標的となる配列を持つことから、その配列に変異を導入したSPL10を過剰発現させた植物体を作出したところ、ロゼット葉の茎生葉化が見られ、さらに、FULの発現が上昇していることが明らかになった。また、トランジェントアッセイの結果から、SPL10はFULプロモーターに結合することが示唆された。以上の結果から、SPL10はFULの発現を直接制御し、microRNAにより機能部位を制限されていることが示唆される。

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WUSCHELは、茎頂分裂組織において細胞の未分化性の維持に関与するのみではなく、発芽時における生長相の転換や、植物ホルモンのシグナル伝達系にも関与する多面的な遺伝子である。また、WUSCHELは、サイトカイニンシグナル伝達系の遺伝子ARRに対しては、リプレッサーとして作用し、花の形態形成の遺伝子AGAMOUSに対しては、アクティベーターとして働くことが報告されており、その遺伝子構造と機能メカニズムは非常に興味深い。
35S-GAL4BD-TATA-LUCを用いたトランジェントアッセイの結果、WUSCHELは、このレポーター遺伝子に対してはリプレッサーとして働き、そのリプレッション活性はC末端に位置する二つのドメインに由来することがわかった。最もC端に位置するドメインは、既にリプレッションドメインとして報告のあるEAR motifであり、もう一つのドメインはWUSCHELとその近縁の遺伝子に保存されている領域であった。二つのドメインをそれぞれ破壊し、恒常的に高発現させた植物体の形態観察、および、RT-PCRの結果から、各々のドメインは、それぞれ異なる機能を持ち、発芽時の生長相の転換とサイトカイニンシグナル伝達系については主としてEAR motif以外の領域が機能していることが示唆された。

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花粉の形成には花粉の中で働く遺伝子だけでなく、タペート細胞をはじめとする葯壁の細胞で発現する遺伝子の働きも重要である。SHEPHERD (SHD) は小胞体に局在するHsp90型の分子シャペロンをコードする遺伝子で、その突然変異体shdは雄性不稔性を示し、花粉の表層を構成するエキシン層の構造に異常が見られる。野生型とshdとのヘテロ個体に生じた花粉ではその全てで正常なエキシンを形成することから、エキシンの形成には胞子体側のタペート細胞におけるSHDの発現が必要と思われた。そこでSHDのcDNAをタペート細胞特異的なSP11プロモーターとFBP1プロモーターにそれぞれにつないでshdに導入したところ、FBP1pでのみエキシンの構造が回復した。従ってエキシンの形成にはFBP1pのみで発現が見られる花粉四分子期のタペート細胞におけるSHDの発現が必要であり、SHDはタペート細胞からの一次エキシン構成成分の分泌に関与していると推測される。
shdでは花粉管の伸長にも異常が見られる。SHDのcDNAを花粉特異的なLAT52プロモーターにつないでshdに導入したところ、花粉管伸長と稔性の回復が見られた。従ってSHDはその機能から成熟花粉における花粉管構成成分の分泌に関与していると推定される。しかし形質転換体のエキシンは異常なままで、逆に前述のFBP1p:SHDでは花粉の稔性は回復していなかった。これは稔性の回復にエキシンの構造はそれほど重要でないことを示唆している。

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開花は花弁の急速な伸長によって実現されるが、シロイヌナズナではこのとき雄しべの伸長が葯の裂開を伴って同時に起こり、葯が成熟した柱頭に接触して自家受粉が起こる。近年、この雄しべと花弁の同調した伸長および葯の裂開に、ジャスモン酸（JA）の働きが重要であることが明らかになってきた。しかし、JAを介したどのような分子メカニズムが雄しべと花弁の伸長、葯の裂開に関わっているかは依然として未解明な点が多い。
そこで我々は、雄しべと花弁の伸長の同調性が乱れる、つまり野生型と比較して雄しべの伸長時期が早まり、花弁の伸長が抑制されるdefective coordination1(deco1)突然変異体を単離した。走査型電子顕微鏡観察から、これらの器官伸長の異常は細胞伸長の異常によることがわかった。また、deco1の花序におけるJA量は野生型の約30％にまで減少しており、これが花弁の伸長が抑制される原因であると推定された。ポジショナルクローニングをおこなったところ、DECO1は機能未知のシトクロームP450モノオキシゲナーゼをコードしていることが明らかになった。さらにDECO1プロモーターとGUS融合遺伝子を作製し、野生型植物体に導入して解析したところ、開花時における発現は花糸特異的であることがわかった。
以上の結果は、DECO1は花糸においてJAの生合成、もしくは代謝（酸素添加）にかかわっており、この経路が花弁伸長に重要な役割を果たしていることを示唆している。

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我々は、シロイヌナズナにおいて、FT遺伝子過剰発現体の花成早化表現型を昂進する優性変異体crp-1D(cryptic precocious)を単離した。ポジショナルクローニングにより原因遺伝子を同定したところ、この遺伝子は、転写メディエーター複合体のサブユニットMed230に低い相同性をもつ2235アミノ酸のタンパク質をコードしていた。Daphne(2002)らにより、転写メディエーター複合体の別のサブユニットMed150と相同性がある遺伝子が欠損した植物体において形態異常が報告されている。CRP遺伝子は花成を含め、発生過程において様々な遺伝子の発現制御に関わる可能性が考えられる。そこで、CRP遺伝子の発生過程における役割について調べるため、DsトランスポゾンおよびT-DNAの挿入による機能欠損変異体crp-2、crp-3、crp-4を取得し、crp-1Dとともにその表現型の観察を行った。花成時期を測定したところ、crp-1Dは花成早化表現型を示したのに対し、CRP遺伝子機能欠損変異体は花成遅延表現型を示した。このことから、CRP遺伝子は花成の調節において何らかの役割を果していると考えられる。さらに、CRP遺伝子機能欠損変異体は、ロゼット葉や花器官においても形態異常、矮性、不稔など多面的な形態異常を示すことがわかった。現在、CRP遺伝子の発現パターンの解析、機能欠損変異体の表現型の解析を行っている。

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シロイヌナズナのERECTA (ER) 遺伝子は受容体型プロテインキナーゼ様タンパク質をコードし、植物体の地上部の形態形成において重要な役割を担う。実験系統の一つとして利用されているLandsberg erectaがer変異を内包していることはよく知られているが、ERの機能に関する知見は非常に限られているのが現状である。
そこでERの機能に関する新たな知見を得るために、ERの発現調節機構の解析を行った。ERのプロモーター配列にGUS遺伝子を融合したキメラ遺伝子を発現する形質転換植物を変異源処理してGUSレポーターの染色パターンが変化する変異体を選抜したところ、GUS染色が弱くなる変異体が単離された。その中の一系統ではERの転写産物量が顕著に減少しており、この変異系統をreduced expression of erecta1 (rxe1) と命名した。
ERはそのパラログ遺伝子であるERECTA-LIKE1 (ERL1), ERL2と共に表皮細胞の分化に関与することが報告されている。これら3つのERファミリー遺伝子はほぼ同様の部位で発現しているが、rxe1変異体ではERの発現のみが変化しており、ERファミリー遺伝子間のプロモーター配列の違いが反映されている可能性がある。また、rxe1変異体の表現型は植物体の地上部で多面的に観察されるが、その中にはer変異体は示さない表現型が含まれ、ER以外にもRXE1遺伝子によって発現が制御される遺伝子があることが示唆された。rxe1変異体の分子遺伝学的解析の現状と展望に関して報告する。

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実験室野生型系統として用いられているLandsberg erecta株は花序先端に花が密集した散房花序といわれる形態と近似しており、このような散房花序様の表現型を示すのはerecta変異によると考えられる。花序形態形成機構を明らかにするために、散房花序様変異体corymbosa1 (crm1)に着目した。マッピングとアレリズムテストの結果、crm1変異体の原因遺伝子は正常なオーキシンの極性輸送に必要であるBIG遺伝子であることがわかった。pCRM1::GUSとin situハイブリダイゼーションを用いた遺伝子発現解析の結果、CRM1/BIG遺伝子は花序分裂組織と花芽分裂組織で強く発現していた。crm1/big変異体のアリル変異系統である複数のreduced lateral root formation (rlr)変異体の表現型の解析の結果、rlr変異体の表現型は大きく2つに分けられた。さらにシーケンスによる変異部位の特定、およびCRM1/BIG遺伝子の発現解析の結果、rlr変異体は部分的に機能をもつ変異体であり、推定CRM1/BIGタンパク質の大きさに応じて変異体の表現型は交互に変化することがわかった。crm1/rlr変異体では散房花序様の表現型の強さの度合いに対応して、PINFORMED1遺伝子の発現量が増加していたことから、CRM1/BIG遺伝子はオーキシンの輸送を介して花序の発達を制御していることが示唆された。現在、crm1変異体において花序の発達に必要である遺伝子の発現解析を行っている。

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acaulis1 (acl1) 変異体は、22°Cでは葉や茎の形態異常をしめす。強い表現型を持つacl1-1変異体のロゼットは直径1cm前後にしか展開せず、花茎もわずかにロゼットの高さを超す程度にしか伸長しないが、28°Cで育てると野生株と同様の形態にまで回復する。温度とacl1植物形態の関係を詳細に調べるため、22°Cから28°Cまで2°C刻みに生育温度を設定し植物を育てた。弱い表現型を示すacl1-3植物体は24°Cにおいて多少の回復が見られた一方、acl1-1植物体に変化は見られず26°Cにおいて劇的に植物形態が回復した。acaulis 変異体の一つであるacl2-1変異体は28°Cにおいて完全に植物形態が回復しないことからも、回復に必要な温度は各acl変異体異なると思われる。高温下での形態回復という現象に関わる経路が共通であるなら、この事実は興味深い。また、窒素化合物を多く含む培地上ではacl1変異体が大きく成長することも発見し、窒素化合物の量と種類の違いが与える影響についても調べている。培地中のNH₄NO₃濃度に依存してacl1-1植物体は大きくなるが、温度による回復とは異なり葉や茎の完全な形態回復は見られず、硝酸塩のみを与えても効果はない。これらの温度・窒素化合物とacl1植物形態との関係から、現在クローニングを行っているACL1遺伝子の機能についても考察をする予定である。

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ストレプトカルプス属（イワタバコ科）には、茎頂分裂組織（SAM）を持たないのに葉を形成するというユニークな特徴を持つ植物群がある。私たちは、この体制の機構を進化発生学的側面から解明することを試み、より広い立場からの高等植物の葉の形態形成を考えようとしている。
まず、これまで明瞭でなかった細胞分裂活性領域の特定のために、ロゼット種のStreptocarpus rexiiを材料として、組織にBrdUを取り込ませ、その領域を三次元構築であらわし、併せて、Groove merietem (GM)と定義される領域とも対比させて、形態形成の細胞学的基礎を明らかにした。この情報の下に、GMとSAM機能を比較するために、SAM機能に関与するクラス1KNOX遺伝子に属するKNAT1, MYB様転写因子のPHAN遺伝子をこの植物から単離して、その発現の動態をIn situ hybridization (ISH)で調べた。これらの結果から、ストレプトカルプスの示す、ユニークな形態形成が、通常のSAMを有する植物とは異なるが、類似性もあることを示した。これらの結果について、進化発生学的見地から考察を加える。

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前演者は、ストレプトカルプス属の特徴的な形態形成のパターンはPhyllomorphという概念でまとめられているが、その分子的背景をKNOX1、Phantastica遺伝子の発現パターンで追跡した結果を報告について述べます。この解析を更に上位の単位であるイワタバコ科に適用することを行った。イワタバコ科は、地球上に広く分布しており、それらもユニークな形態形成の特徴を持つ。その一つは、旧世界に分布するイワタバコ科では、子葉の大小化が起こり、大子葉を形成するという特徴があるが、これは新世界イワタバコ科では見られない。
形態学的特徴から代表的なグループを選んで、KNOX1等の遺伝子発現を葉、シュートで解析したが、全体としてまとめると、茎頂分裂組織(SAM)で発現し、大子葉、Phyllomorphで発現することから、SAMのシュート形成能が段階的に葉で機能して、独特な葉形態形成をするようになったと結論付けた。なお、大子葉形成については、サイトカイニンがその誘導要因であることを演者等は既に報告しているが、光などの環境要因も重要であることを観察した。しかも、KNOX1の発現がこの大子葉化に大きく関わっている結果を得たので、これらを統括的に捉える仮説的構築も試みる。

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ゴルジ体は, タンパク質選別センターとして重要な役割を担う細胞小器官である. また，極性を持った槽が重なった特徴的な層板構造を形成するが，その発生や構造維持機構については未だ不明な点が多い. 動物細胞のゴルジ体は，核近傍に巨大で複雑な層板構造を形成する．一方出芽酵母では，各々の槽が単独で存在し細胞内に分散している. これらに対し高等植物のゴルジ体は，明瞭な層板構造を持ちながら細胞内に散在している. 我々は，高等植物のゴルジ体をモデルとし，ゴルジ体の層板化の意義と，その発生・維持機構の解明を目的として研究を行っている. まず, ゴルジ体の槽特異的マーカーと蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現する形質転換植物を作製し，生細胞内でのゴルジ体の可視化を行った. 超高感度高速共焦点顕微鏡システムを用いてその観察を行った結果, ゴルジ体が極性を保ちながらも活発に活動している様子を精細に捉えることに成功した. 次に, ゴルジ形態の発生・維持機構に関する手がかりを得るため, ゴルジ体の形態が異常となる変異体の探索を行った. その結果, いくつかの変異体候補の単離に成功した. さらに, ゴルジ体の機能が植物の高次機能にいかに寄与するのかを明らかにするため, ゴルジ体に局在するタンパク質の変異体の解析を行った. その結果, ゴルジ体に局在するSNARE (AtSYP32)の変異体において雌性配偶体の異常が観察されたので報告する.

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トランスゴルジネットワーク（TGN）は, 小胞体からゴルジ体へと輸送されたタンパク質が, 液胞, 細胞膜等の目的地別に選別・輸送される際の分岐点となる重要なオルガネラである. しかし、高等植物においてはTGNの定義は曖昧であり, 動物・酵母においてTGNに局在するSNARE分子のオーソログ, AtTlg2a/Syp41が局在するオルガネラを便宜的にTGNと呼んでいるものの, その構造・機能は全く明らかにされていない. そこで我々は, 高等植物のTGNの構造・機能・動態を明らかにするため, AtTlg2a/Syp41をTGNマーカーとして, GFP-AtTlg2a/Syp41融合タンパク質を発現する形質転換体を作成した. GFP蛍光を観察した結果, TGNはドット状のオルガネラであることが分かった. また, ゴルジ体のシスマーカーとしてAtSed5/Syp31, トランスマーカーとしてST(sialyl transferase)を共発現させたところ, TGNはゴルジ体のトランス側に存在するものの, 一部はゴルジ体とは独立して存在した. 更に, FM4-64による染色を行ったところ, TGNはFM4-64で染色された. 以上の結果から, 高等植物のTGNは, 主にゴルジ体のトランス側に存在するが, 一部はゴルジ体とは独立したオルガネラであり, 生合成経路だけではなくエンドサイトーシス経路でも機能しているオルガネラであることが示唆された.

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我々は、膜輸送系の中心に位置しているゴルジ複合体の複雑で動的な構造や機能の詳細を明らかにすることを目的に研究を進めている。これまでの研究から分泌性糖タンパク質α-アミラーゼI-1を過剰発現させたイネ非分泌細胞においてα-アミラーゼI-1がゴルジ複合体を経由してプラスチドに輸送されることが見いだされ、ゴルジ複合体の新たな輸送選別機能が示唆された。本報告においては、α-アミラーゼ糖タンパク質過剰発現細胞におけるゴルジ体膜の構造変化について述べる。ショ糖添加培地で培養したイネα-アミラーゼ過剰発現細胞を電子顕微鏡で観察したところ、ゴルジ複合体の数が野生型細胞に比べ増加する傾向が見られた。続いて、N-acetylglucosaminyltransferase I (GNTI)を指標にα-アミラーゼ過剰発現細胞におけるゴルジ体の膜密度について解析した。ショ糖密度勾配遠心フローティング法を用いてα-アミラーゼ過剰発現細胞および野生型細胞のGNTI結合ゴルジ体膜を分離し解析したところ、α-アミラ－ゼ過剰発現細胞においてGNTI結合ゴルジ体膜が高密度側に大きくシフトすることが見いだされた。この結果は、ゴルジ機能の変化に応答してゴルジ体膜の構成成分が再構築されることを強く示唆している。

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道管・仮道管を構成する道管要素は，分化の最終段階で起こる液胞崩壊型のプログラム細胞死を経て中空の死細胞へと分化する．しかしながら，道管要素細胞が自らの液胞をどのようにして崩壊させるかという仕組みについては不明である．私たちは既に，シロイヌナズナ培養細胞 in vitro 分化誘導系において，液胞膜の崩壊及びプログラム細胞死が起きていること，形質転換培養細胞からも道管要素分化を誘導できることを確認している．そこで，分化過程における液胞の動態を明らかにするため， GFP-AtRab75 で液胞膜を可視化したシロイヌナズナ形質転換培養細胞を用いて分化過程における液胞膜の動態を観察したところ，分化が進行するにつれ，液胞の融合が促進され，二次壁の形成が起きている細胞でも活発に液胞膜が運動している様子が観察された．さらに分化が進行すると，液胞膜の動きがいったん停滞し，その後激しく収縮しながら液胞膜が消失していく様子を捉えることに成功した．さらに，このような液胞膜の動態変化を制御する分子機構の解明に向けて，液胞膜の動態を制御すると予想される Rab GTPase に着目して解析を行った結果，液胞膜に局在する3種類のRab GTPase が維管束で機能している可能性があることを見出した．本大会では，現在進めている Rab GTPase の T-DNA 挿入変異体の解析結果を合わせて報告する．

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シロイヌナズナの種子のオイルボディは発芽時の栄養源である貯蔵脂質を蓄えている．オイルボディの膜にはオレオシンという構造タンパク質が存在し，オイルボディの形成や機能に重要な役割を果たしていると考えられている．オレオシンの機能を解析するため，4種類の種子型オレオシン（AtOleS1～4）のT-DNA挿入変異体を確立した(1)．電子顕微鏡観察の結果，それぞれのオレオシン欠損変異体ではオイルボディが野生型よりも巨大化していることが判明した．種子中のオレオシンの含量はAtOleS3とAtOleS4が高いが，これらの欠損変異体のオイルボディの巨大化は特に顕著であった． いずれの変異体も，種子の外見は野生型と変わらず，正常に発芽・成長した．しかし，それぞれの変異体の乾燥種子は凍結処理により発芽が顕著に遅延することがわかった．凍結処理後の種子のオイルボディはさらに巨大化していた．それぞれのオレオシンの二重欠損変異体を作製したところ，種子中の含量の多いオレオシン（OleS3とOleS4）の二重欠損変異体は，通常の生育条件でも，発芽率が低下することがわかった．以上の結果から，オレオシン欠損によるオイルボディの巨大化が，正常な発芽を阻害していることが示唆された．(1) 島田ら，第47回植物生理学会年会要旨，p. 174.

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細胞表層おいて、小胞体はチューブ状構造を成し、互いに融合して網目状ネットワークを張り巡らしている。細胞内におけるこれらのチューブの伸長等は、アクチン系細胞骨格に対する阻害剤によって抑制される。我々はGFPでラベルされた小胞体（GFP-ER）を発現しているタバコ培養細胞BY-2から、ショ糖密度勾配超遠心法などによって調製したGFP-ER画分にGTPを加えると、GFP-ER小胞からチューブが形成される現象を見出した。チューブ形成は、GDPあるいはATPを加えても起こらないが、ミオシン活性阻害剤やアクチン繊維あるいは微小管脱重合剤存在下でも誘発される。しかしSH基試薬であるN-エチルマレイミドやビオチン-マレイミドによって阻害される。このような現象は、既にアフリカツメガエル卵から調製した小胞体でも報告されている。しかし、BY-2細胞GFP-ERのin vitroにおけるチューブ形成とは、いくつかの点で相違が見られる。これらの点に関しても、考察する予定である。

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真核細胞は小胞体、ゴルジ体、液胞などの内膜系を発達させているが、それらが正常に機能するためには細胞骨格による構造や局在の制御が欠かせない。植物細胞においては、液胞が細胞体積の大部分を占めるほどまでに成長し、植物細胞および植物個体の形態形成において重要な役割を果たしている。本研究では、相同組み換えを利用してヒメツリガネゴケの液胞膜と細胞骨格を恒常的に可視化し、高等植物では困難であった細胞の分化・成長に伴う液胞の構造や運動の解析を実現した。まず、GFP-AtVam3pによって可視化された液胞膜を観察した結果、細胞表層におけるチューブ状液胞の柔軟な構造変化や、細胞先端に向かう液胞の急速な伸長といった、液胞の活発な運動が明らかになった。このような液胞の構造変化は、微小管脱重合剤によって強く抑制された。そこで、mRFP-tubulin融合遺伝子をさらに導入することによって、液胞膜と微小管を同時に可視化し、両者の挙動を追跡した。その結果、微小管が液胞膜に高い頻度で隣接して局在していることが判明した。さらに、細胞表層のチューブ状液胞や細胞先端の液胞が、伸長している微小管の先端に引っ張られるように変形する様子が観察された。これらの結果から、液胞の構造や分布は、微小管が液胞膜と繋がりを保ちながら伸長することで制御されている可能性が示された。

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植物細胞内のペルオキシソームは発芽段階から黄化に至るまで多彩な機能を司っている。緑葉組織においては緑葉ペルオキシソームが光呼吸の代謝や傷害で誘導されるジャスモン酸の合成などに関与している。光呼吸に関してペルオキシソームは葉緑体、ミトコンドリアと、またジャスモン酸の合成系に於いては葉緑体と代謝系を共有している。現在までに根の組織におけるペルオキシソームの形態や運動については細胞骨格との関わりを示唆した報告がある（Mano et al, 2002）。しかし葉肉細胞内で観察した報告はほとんど知られていない。今回我々はペルオキシソームや細胞骨格等が蛍光タンパク質で可視化されたシロイヌナズナの形質転換体を用いることにより、葉肉細胞におけるペルオキシソームの局在機構に関する観察を行った。ペルオキシソームの局在機構を制御する条件等を詳細に調べると共に局在に異常のある変異株をEMS処理した突然変異体ラインから数種類選抜した。野生株と変異株を用いた生理学的解析から葉肉細胞内のペルオキシソームは非常に動的であり、かつ独自の局在機構を持つことが示唆された。

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植物の成育過程におけるペルオキシソーム機能転換とそれに伴う内部タンパク質組成の変化は植物ペルオキシソームに独特な特徴である。植物のペルオキシソームはその機能からグリオキシソーム、緑葉ペルオキシソーム、非特殊化ペルオキシソームの3種類に分類されてきた。最近では新たに子葉や根でもペルオキシソームは特異的機能を果たしていることが示唆された。ペルオキシソーム形成因子（ペルオキシン：PEX）は酵母を中心とした遺伝学的解析から同定され、ペルオキシソームマトリックスタンパク質の輸送、ペルオキシソームの増殖、分裂、膜形成といったペルオキシソーム形成機能に関わることが示唆されている。本研究では、シロイヌナズナゲノム上で予測されるPEX遺伝子をRNAi法によって発現抑制し、これらの遺伝子がペルオキシソーム形成に直接関与していることを明らかにした。また、ペルオキシソームマトリックスタンパク質輸送に関与する因子に焦点を当て解析を行った結果、PEX10発現抑制株では葉の部分的黄化や近接器官の融合がみられ、野生型の植物だけでなく、他のPEX発現抑制株と比較しても表現型が著しく異なっていた。PEX10発現抑制株でみられる表現型はクチクラワックスの欠損変異体に特徴的に見られる。現在、この表現型の原因を解析しており、その結果から予測されるペルオキシソーム機能について検討する。

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気孔の閉鎖運動には細胞質内の遊離Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]_cyt）の変動が重要な役割を果たしている。 [Ca²⁺]_cytは、細胞外からの流入の他に、液胞や小胞体といった細胞内Ca²⁺ストアからの放出により制御されることが分かっているが、植物細胞に特有の葉緑体の役割は殆ど分かっていない。今回我々は、新規のCa²⁺結合タンパク質CAS（calcium sensing receptor）が葉緑体チラコイド膜に局在し、[Ca²⁺]_cytの制御に関わることを報告する。当初、CASは細胞膜上のCa²⁺センサーとして報告された。しかし我々は、CAS-GFP融合タンパク質発現系を使った局在解析により、CAS-GFPタンパク質が葉緑体チラコイド膜に局在することを明らかにした。さらに、細胞分画実験から、CASが葉緑体の膜画分に存在し、細胞膜にはみられないことが分かった。cas変異体では、細胞外Ca²⁺が誘導する気孔閉鎖機能が失われ、一方で、CAS過剰発現体では細胞外Ca²⁺が低い条件でも気孔の閉鎖運動が促進された。また、エクオリンを使った[Ca²⁺]_cyt測定系を利用し、CASの[Ca²⁺]_cyt制御への関連性を調べた。その結果、細胞外Ca²⁺が誘導する[Ca²⁺]_cytの一過的上昇が、cas変異体ではWTよりも抑制されることが分かった。これらの結果は、葉緑体タンパク質であるCASが気孔の閉鎖運動を制御している新しい可能性を示唆している。

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The Obg and Era-like small GTP binding proteins have been found in various prokaryotic and eukaryotic organisms. In bacteria, it has been shown that they participate in a wide range of cellular processes, including signal transduction, cell proliferation, intracellular trafficking and ribosome biogenesis. However, little is known about the biological role of these GTP binding proteins in eukaryotic cells. Intensive search on gene and protein databases revealed that Arabidopsis has ten Obg-Hflx and eight TrmE-Era Superfamily proteins. The sub-cellular localizations of each protein were determined by transient GFP expression assays using protoplasts or culture cells of Arabidopsis. We found that each proteins target to different organelles including chloroplast (eight), mitochondria (three), nucleus (two) and cytoplasm (two). There was two proteins dual-targeting to chloroplast and mitochondria, also one protein dual-targeting to cytoplasm and nucleus. Sub-cellular localization and T-DNA insertional mutant line analysis provide interesting insights for the evolution of these families.

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シロイヌナズナなどの無胚乳種子では子葉は種子の中で栄養貯蔵組織として機能し、発芽後に光合成組織となる。子葉と本葉はその形成過程が異なるだけでなく葉緑体の形成過程も異なっていると思われる。シロイヌナズナ変異体abc2 は子葉のみが白化し、本葉は正常に緑化する。この変異体の子葉の色素体は、光照射下で生育させた植物体では膜構造が未発達で野生型とは顕著に異なる葉緑体が形成されるが、暗所で生育させた植物体では野生型同様に正常なエチオプラストを形成する。ABC2 遺伝子は子葉において光によって発現が誘導されており、ABC2タンパク質は葉緑体の膜上に局在していた。ABC2タンパク質は187アミノ酸からなるタンパク質であり、C末端側109アミノ酸は他の高等植物においても高度に保存されていた。この領域は大腸菌のシャペロンタンパク質DnaJの活性部部位のZnフィンガーモチーフを含んでいた。ABC2タンパク質はインシュリンを基質としたジスルフィド結合の酸化還元活性と、還元状態としたRNaseを基質としたRNase Refolding活性を有していた。これらのことより、ABC2タンパク質は子葉の葉緑体形成に必須な分子シャペロン (Protein-disulfide isomerase)である事が示された。

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PSKは，植物細胞培養液中に見出された5アミノ酸分泌型ペプチドであり，in vitroでは細胞増殖促進や仮道管分化促進，不定胚形成促進などの生理活性を示す．種々の生理学的解析から，PSKはmitogenや分化因子として特異的に機能するというよりはむしろ，個々の細胞における基本的な生理的ポテンシャルを高め，多面的な生理効果を示している可能性が高い．PSK前駆体遺伝子は，シロイヌナズナに5種類存在しており，植物体全体でかなりのレベルで発現していることから，植物個体の成長過程にも何らかの役割を担っていると考えられる．我々は，これまでにニンジン培養細胞をモデルとした解析により，細胞膜に局在するLRR-RKであるPSKR1がPSK受容体であることを明らかにしてきた．また，そのシロイヌナズナにおけるオルソログAtPSKR1の破壊株では，基本的な生活環は全うされるが，成熟組織におけるカルス形成能の低下や，個々の細胞の老化の促進が観察されることを見出した．シロイヌナズナには，AtPSKR1のホモログがさらに2種類存在するが，それらも重複してPSK情報伝達に関与している可能性が考えられる．今回我々はこれらホモログについて，AtPSKR1との相補性，発現パターン，PSK結合活性，遺伝子多重破壊株の形質などについて解析したので報告する．

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PSKは植物培養液中に見出された細胞増殖を促進する5アミノ酸の分泌型ペプチドであり，細胞膜上に存在する受容体キナーゼであるPSKR1に非常に高い親和性を示して結合する．PSKR1は細胞外領域に21個のロイシンリッチリピート（LRR）とその繰り返し配列に当てはまらない孤立した領域であるアイランドドメインを有しているが，リガンド結合部位の直接的な同定は行われていない．我々は今回，光反応性PSK誘導体を用いたフォトアフィニティーラベルによりPSKR1のリガンド結合部位の生化学的解析を行った．光反応性PSK誘導体を用いたリガンド結合領域のマッピングと併せて，ラベル効率を向上させるために独自に確立した手法であるOn-column photoaffinity labelingを用いたラベル反応を行い，酵素消化したペプチド断片より免疫沈降によってラベル導入受容体断片を精製し，MALDI-TOF MSによる解析を行った．その結果，PSKR1の細胞外領域中のアイランドドメインに由来する15アミノ酸残基のペプチドをラベル導入部位として同定した．同定したアミノ酸領域を欠損させたPSKR1はPSKの結合能を完全に失ったため，PSKR1のリガンド結合部位はアイランドドメインの前半15アミノ酸残基であると結論づけた．

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植物ペプチドホルモンはペプチド性の細胞間情報伝達物質であり、CLV3に代表されるように植物の成長や分化において重要な役割を果たしている。しかしながら、イネ、シロイヌナズナのゲノム上には植物ペプチドホルモンに特徴的な分泌型ペプチドをコードする、比較的短い、機能未知の遺伝子が数多く見られるので、まだ機能同定されていない機能性ペプチドが多数存在すると考えられている。本研究では、そのような新規の植物ペプチドホルモンをバイオインフォマティクス的手法によって同定することを目的とし、既存の植物アノテーションデータを探索した。植物ペプチドホルモンは配列長が短く、かつ、保存領域がごく限られた領域という特徴を持つものが多いため、BLASTサーチでは検索が困難である。そこで、我々はモチーフサーチを利用した検索を実行した。まず、イネ、シロイヌナズナ、シゾンの全タンパク質アノテーション配列（83508配列）から、Pfam サーチにより、既知の保存ドメインとのヒットが無く、かつ、配列長が200以下で、かつ、分泌型ペプチドを持つ3866配列を選抜した。次に、このデータセットから期待値最大化法により保存モチーフを抽出し、保存モチーフの出現バターンで候補を絞り込み、最終的に22のペプチドホルモン遺伝子候補ファミリー（197配列）を同定した。現在、これらの遺伝子ファミリー内で共通な保存配列をペプチド合成し、植物体への添加実験を行っている。

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低分子有機化合物を利用して遺伝学的解析を行うケミカルジェネティクスは近年発展してきた新たな手法である。我々は、この手法を用いて種子発芽に関わる新奇化学合成化合物を同定した。10，000の人工化合物からなるライブラリーをスクリーニングし、発芽後3日の間に子葉の緑化と伸張を阻害する化合物（以下E化合物と呼ぶ）を5個発見した。遺伝学的解析を行った結果、植物ホルモンのアブシジン酸とジベレリンに関わる突然変異株でE化合物に対する応答性に変化が見られ、E化合物がこの二つのホルモンのシグナル伝達に関わっている可能性が示唆された。さらに、この化合物に耐性の突然変異株を新たにスクリーニングし、その中からelongated hypocotyl1（hy1）突然変異株が分離された。hy1突然変異株は光形態形成に欠損を生じた突然変異株として知られる一方で、プラスチドレトログレードシグナルに欠損を生じたgenome uncoupled2としても分離されており、E化合物とABA、GAおよびプラスチドレトログレードシグナルとの関連を議論する。

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温度は種子発芽の季節を決定する主要な環境シグナルである。冬型一年性草本であるシロイヌナズナの種子発芽は吸水時の高温条件で抑制される（高温阻害）。私達は、シロイヌナズナ種子の高温阻害には吸水後の新たなABA合成が必要であることを見出し、ABAの前駆物質であるカロテノイドの酸化開裂を触媒するNCED2 , 5, 9遺伝子の発現が高温条件で高まることを示した。これらのNCED遺伝子の生理的機能を明らかにするため、T-DNA挿入突然変異種子の発芽を調べたところ、野生型（Col）種子の発芽がほぼ完全に抑制される34℃において、NCED9遺伝子に挿入変異を持つ種子（nced9）は高い発芽率を示したが、nced2およびnced5突然変異種子は明確な高温耐性を示さなかった。そこで、これらの二重変異を作成して高温条件での発芽を調べたところ、nced5nced9は両親よりさらに高い発芽率を示したが、nced2nced9はnced9と、nced2nced5は両親と同程度の発芽率を示した。また、nced2nced5nced9三重変異体はnced5nced9二重変異体と同程度の高温耐性を示した。したがって、シロイヌナズナ種子の高温阻害には、NCED9とNCED5遺伝子の高温による転写産物量の調節が重要な役割を持ち、NCED5とNCED9はunequally redundantな関係にあると考えられた。

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シロイヌナズナの種子において、可視的な発芽が認められるまでの時間は吸水温度の低下とともに長くなる。低温による発芽遅延に関わる遺伝因子を見出すことを目的として、10,000のT-DNA挿入系統を選抜し、5℃で野生型よりも速やかに発芽する突然変異を4系統単離した。このうち、最も顕著な表現型を示したLTW18-1の種子は、野生型種子の発芽が完全に抑制される34℃でも50％程度の高い発芽率を示した。また、発芽においてABA低感受性を示すとともに、GA合成阻害剤であるパクロブトラゾールに耐性を示した。さらに、葉の葉縁の切れ込みが野生型よりも深く、草丈がやや小さいなどの形態的な変異も認められた。これらの形態的な特徴とABA低感受性発芽形質はオーキシン耐性変異の一つであるibr5に類似していたため、遺伝的相補性検定を行ったところLTW18-1はibr5の新たな対立遺伝子であることが示された。LTW18-1のIBR5遺伝子領域の塩基配列を決定したところ、第2エクソンに7塩基の欠失を持ち、終止コドンを生じることが明らかになった。これらの結果は、IBR5は低温から高温に至る広い温度条件において、ABAが関与する発芽調節に重要な働きを持つことを示唆している。

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オーキシンは植物の成長過程で多様な生理現象を制御し、植物体内のオーキシン代謝は厳密に調節される。ヒャクニチソウ培養細胞系では、単離した葉肉細胞をオーキシン、サイトカイニンと共に培養すると、細胞分裂と道管細胞（管状要素）の分化が誘導される。この系にオーキシン極性輸送阻害剤（NPA）を投与すると、管状要素の分化と細胞分裂が阻害されることが分かっている。放射性同位元素を用いた解析からNPAはオーキシン代謝経路を活性化し、その結果として、代謝型オーキシンの増加と遊離型オーキシンの減少が起こり、分化と分裂が抑制されることが示唆された。今回、我々は新規のIAA-アミノ酸複合体合成酵素阻害剤（IAA-SA, NAA-SA, PAA-SA, 2,4-D-SA）を用いて、ヒャクニチソウの管状要素分化過程におけるオーキシン代謝を解析した。するとNPA処理でIAA-Asp、IAA-Glu等の結合型IAAが増加し、遊離型IAAが減少することがわかった。次に、極性輸送阻害剤処理した細胞に、NAA-SAを投与してその影響を調べたところ、結合型IAAの著しい減少が観察された。その際、細胞分裂の阻害が打ち消され、分裂率が回復することがわかった。管状要素分化は非常にわずかだけ回復することがあった。これらの結果から、オーキシン代謝と極性輸送阻害剤、さらに細胞分裂・分化におけるオーキシンの役割について考察する。

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ミシマサイコ（Bupleurum falcatum L.）の培養根をインドール酪酸（IBA）を含む液体培地に植えると約2週間後に活発な発根が起きる。このIBAの効果はストレス依存的であった（Plant Biotech. 20: 331-334）。そこで、ストレス感受期（培養開始翌日）の培地中に特徴的なIBA代謝物を検索したところ、新規なIBA誘導体（IBL、4-(3-indolyl)-4-butanolide）を発見した。IBLはIBAの酪酸の4位が水酸化され、引き続き自動的にラクトン環を形成して蓄積したものと推察される。
化学合成したIBLを用いてその生理作用を詳しく解析した。その結果、IBLはIBAとは様式の異なる発根誘導作用を示した。すなわち、IBAはミシマサイコ培養根の皮層細胞を拡大・分裂させ、培養根を膨潤させた後に発根を誘導したが、IBLは細胞分裂だけを誘導し、細胞を拡大させることは全くなかった。また、IBLは典型的なオーキシン作用であるダイコン子葉の偏向生長や根の伸長抑制作用も示さなかった。さらに、IBAに加えてヒスチジンを添加、あるいはIBAの添加時期を遅らせる処理を行うと発根は誘導されず、IBLもほとんど生成しないことも判明した。このように、IBLはきわめて特異性の高い発根作用物質であることが明確に示された。

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IAA-アミノ酸複合体（IAA-aa）はIAA不活性化経路の鍵中間体であり、IAA-aa合成酵素はオーキシン恒常性を制御する重要な酵素である。オーキシン早期誘導遺伝子GH3はIAA-aa合成酵素をコードするが、シロイヌナズナでは複数のGH3が機能重複しているため遺伝学的手法によりIAA-aa合成を完全に遮断することは困難である。アシル活性化酵素ファミリーに属するGH3はIAAのアデニル化を経てIAA-aaを生成することに着目し、反応中間体アナログ阻害剤としてオーキシンのN-sulfamolyadenosine (SA) 誘導体（IAA-SA, NAA-SA，PAA-SA, 2,4-D-SA）を設計・合成した。昨年度学会で、各SA誘導体がGH3によるIAA-aa合成活性をin vitroで阻害することを示した。今回、各SA誘導体のin vivoでの阻害活性を検討したので報告する。シロイヌナズナ葉切片をIAA処理するとGH3発現が増加し、経時的にIAA-Asp, IAA-Glu, IAA-Gln内生量が著しく増加した。一方、SA誘導体を共存させるとこれらIAA-aaの増加は顕著に抑制された。以上より、SA誘導体はGH3によるIAA-aa生成をin vivoで阻害し、IAA不活性化を遮断する有効な化学的ツールとなることが期待される。

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植物のIAA生合成経路にはTRP依存型と非依存型が存在し、またシロイヌナズナのTRP依存型経路には少なくともインドールグルコシノレート経路とトリプタミン経路が含まれることが報告されてきた。これら重複したIAA生合成経路がそれぞれ、いつ、どこで、どの程度機能しているのかを解明することは長年の課題である。本研究では、シロイヌナズナのTRP要求性変異体を用いてTRP代謝経路の選択的ラベル化システムを構築し、各経路のIAA生合成に対する寄与を評価した。
これまでに数種のTRP要求性変異体がシロイヌナズナで得られているが、表現型の差からこれらのTRP生合成経路は異なるレベルで遮断されていると推測された。今回、TRPを含む液体培地でこれら変異体の表現型の回復実験を行った結果、trp1-1とtrp3-1変異体でTRP要求性に大きな差があることを確認した。我々はこのTRP要求性の差を利用し、[¹⁵N₂]TRP によってTRP依存型経路の中間体を高効率でラベル化するシステムと、トリプタミン経路の中間体のみ選択的にラベル化するシステムを構築した。LC-MS/MSおよびGC-MSを用いて各経路のモデル中間体とIAAのラベル化率を比較した結果、個体レベルのIAA生合成ではTRP依存型経路が中程度寄与し、TRP非依存型経路からも相当量のIAAが合成されていることが示唆された。また、個体レベルではトリプタミン経路の寄与が低いことが示され、さらに器官・組織レベルでの解析を進めている。

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冠水条件にさらされたイネでは、内生エチレン濃度が急激に増加する。次いで、ABA量が減少し、GA量が穏やかに増加することで節間伸長や葉の伸長が引き起こされることが知られているが、その詳細な分子機構は明らかでない。日本型イネ品種日本晴を用いて冠水時におけるABA量とその代謝産物を分析した結果、ABA量の減少に伴い、ABAの代謝産物であるファゼイン酸（PA）の増加が観察された。この結果から、冠水後におけるABA量の減少はABA 8’位水酸化経路によって引き起こされていることが示唆された。イネのABA 8’位水酸化酵素をコードすると推定される3つのOsABA8ox遺伝子(OsABA8ox1,2,3)の発現を調べた結果、OsABA8ox1 mRNA量が冠水直後に劇的に増加していることが明らかとなった。冠水時に見られるOsABA8ox1 mRNA量の増加がエチレン依存的であるかを確かめるために、好気中でエチレンやACC処理を施した結果、OsABA8ox1 mRNA量が増加し、同時に、ABA量の減少とPA量の増加が観察された。さらに、エチレン受容体阻害剤処理を施したイネでは、冠水時におけるOsABA8ox1 mRNA量の増加が抑えられ、ABA量の減少抑制が観察された。この結果から、冠水時における内生ABA量の減少はエチレン依存的なABA不活性化酵素の発現制御によるものであることが明らかにされた。

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近年のポストゲノム研究からホルモンは個別に作用するのではなく、相互に関連しながら生長や分化を制御していることが明らかになってきた。従って個別のホルモンだけではなく、複数のホルモンを同一試料から同時に分析すること、また特定の器官、組織、細胞から高感度で分析する必要がでてきた。今までは特定のホルモンを選択的な方法で抽出し、分離能の高いGC-MSによる分析が一般的であった。この方法は確立した方法であるが、誘導体化が必要で、多検体・一斉分析には必ずしも適当ではない。理研PSCではGC-MSに加えて、LC-ESI-MS/MS を導入しHigh-throughput 分析と高感度分析の両立を計るシステムを立ち上げている。植物ホルモンを内生量と化学的な性質から酸性ホルモン（アブシジン酸、インドール酢酸、ジャスモン酸、サリチル酸）、塩基性ホルモン（サイトカイニン）、微量多同族体ホルモン（ジベレリン、ブラシノステロイド）、揮発性物質、その他に大きく分類し、微量分析から突然変異体の検索までに対応した多様な分析を目指している。今回はその立ち上げ状況、共同研究の現状について報告する。

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シロイヌナズナBOR1は排出型ホウ酸トランスポーターであり、低ホウ素条件下でのホウ素の地上部への効率的な輸送に必須である。CaMV 35S RNAプロモーター（P35S）制御下でBOR1-GFPを発現する形質転換植物の根端において、BOR1-GFPはホウ素欠乏条件下では細胞膜に強く蓄積し、高濃度のホウ素供給後にエンドサイトーシス経路によって分解された（Takano et al., 2005）。
一方、シロイヌナズナBOR4も排出型ホウ酸トランスポーターであり、ホウ素過剰条件下でホウ素の植物体外への排出に関わっていることが示唆された（三輪京子ら 植物生理学会本大会）。P35S制御下でBOR4-GFPを発現する形質転換植物の根端においては、BOR4-GFPはホウ素条件によらず細胞膜に局在した。
本研究ではさらに、BOR1とBOR4の細胞内輸送の差異を決定するドメインやモチーフの同定を目指し、BOR1とBOR4の間のドメインスワッピングと、BOR1におけるエンドサイトーシスシグナルと推測されるモチーフへの変異導入を行った。これら改変型ホウ酸トランスポーターのホウ素条件に応答した細胞内局在を観察した結果を報告し、ホウ酸トランスポーターの細胞内輸送メカニズムについて議論したい。

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モリブデン(Mo)は植物の窒素同化・硫黄代謝・ABA合成に関与する。前回の年会でシロイヌナズナのMoトランスポーターMOT1について報告した。今回はMOT1相同遺伝子であるMOT2について報告する。
MOT2はMOT1とアミノ酸レベルで51％同一で、82%相同であり、イントロンが無いことも共通している。まず、170 nMのMoを含む寒天培地で14日間栽培した植物の根と葉から抽出したRNAについてRT-PCRを行ったところ、地上部と根の双方でMOT1の約2倍のMOT2 mRNAの蓄積が検出された。mRNAの蓄積量は地上部と根で差がなかった。また、通常の培地(Mo 170 nM)と欠乏条件下(Moを加えない培地)で栽培した野生型株の根でも葉でもMOT2 mRNA蓄積量に差は認められなかった。MOT2にT-DNAが挿入された変異株を1系統入手してホモ系統の生育を調べたところ、通常の培地では野生型株と同程度に生育したが、Mo欠乏条件下において変異株の生育は抑制された。Mo欠乏条件下における生育は培地にアンモニア態の窒素を添加することで部分的に回復した。また、地上部のMo濃度は野生型株よりも低下していた。MOT2を酵母で発現させたところ、菌体内Mo濃度の3倍の上昇が見られた。これらの結果は、MOT2がMoトランスポーターであり、根から地上部へのMo輸送に関与していることを示唆している。

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