糸状菌は、数十もの二次代謝物生産に関わる遺伝子クラスターを有している。しかし、これらの多くは通常の培養条件下では休眠しており、それらがコードする二次代謝物は明らかになっていない。当研究室では、「糸状菌の休眠遺伝子からの新規天然物探索」を行うなかで、ゲノム情報を必要としない、天然物探索に広く利用可能な二次代謝活性化法の確立を目指している。第53−55回本討論会において、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤を用いたケミカルエピジェネティクスの手法を報告した。しかし、本法でも休眠遺伝子を十分には活用しきれてはいない。
放線菌などの細菌では、リボソームを標的とする抗生物質（ストレプトマイシンなど）やRNAポリメラーゼ阻害剤（リファンピシンなど）に対する薬剤耐性変異を導入することで休眠型二次代謝物の生産を活性化する方法「リボゾーム工学」1が、越智幸三博士らによって確立され、有用物質の効率的生産や新規物質探索に活用されている。我々は、この概念を真核生物である糸状菌へと応用し、汎用性の高い二次代謝活性化法の確立を目指して研究を行っている。本研究によって、真核生物のリボソーム標的薬剤であるハイグロマイシンB (HygB) の耐性株が、休眠型二次代謝物の取得に有効であることを見出した。
1. HygB耐性株の取得と二次代謝物生産能の評価
図1. 本研究の概略
胞子に変異原である1-メチル-3-ニトロ-1-ニトロソグアニジン(MNNG) を用いてランダムに突然変異を導入して、HygB耐性株の作成を試みた。まず、胞子形成能の高いAspergillus属やEupenicillium属菌のうち、HygB 500 mg/ml以下で感受性を示す菌を検討した。変異原処理の条件と選抜時のHygB濃度を検討することにより、ほとんどの菌で耐性株を取得することができた。さらに、耐性株を取得できた菌では、いずれも二次代謝が活性化した株を効率良く見出すことができた。また、十分に胞子を形成した昆虫寄生糸状菌Sporothrix pallidaでも同様に二次代謝活性型のHygB耐性株が取得でき、適応範囲の広さが示された。しかし、糸状菌の多くは胞子を十分に形成させることが難しい。そこで、菌糸体を用いてHygB耐性株が取得できるか検討した。先の検討事項に加え、MNNGと反応させる菌糸の調製法を検討した結果、数種の菌でHygB耐性株が得られ、それらは二次代謝が活性化していた。変異原処理では一般的に複数の変異が導入されてしまう。なお、昆虫寄生糸状菌Orbiocrella petchiiの菌糸から変異原処理なしでもHygB耐性株が得られ、変異原処理で取得した耐性株と同じように二次代謝が活性化していた。このことは、HygB耐性に関わる変異が二次代謝活性化に寄与している可能性を示唆している。
HygB耐性株で二次代謝が顕著に活性化した例を図2に示す。このように、本法が、二次代謝活性型糸状菌を得るのに効果的な方法であることが示された。
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