迅速かつ高効率な光安全性評価系の戦略的開発

Summary

Chemical phototoxicity is elicited after exposure of skin to photosensitive chemicals, followed by exposure to sunlight. The intensity of ultraviolet light has increased due to ozone layer destruction; therefore, interest in avoidance of the phototoxicity risk of chemicals has increased in drug discovery and product development. Based on the mechanism of chemical phototoxicity, a photosafety screening strategy focusing on the photoreactivity of chemicals and skin exposure to chemicals was proposed. In an initially-developed photosafety screening system, a reactive oxygen species (ROS) assay and an in vivo cassette-dosing pharmacokinetic study were employed to evaluate the photoreactivity of chemicals and skin exposure to chemicals, respectively, and previous investigations yielded reliable photosafety predictions. On the other hand, the tools in the photosafety screening system have some issues, such as low applicability to poorly water-soluble chemicals in the ROS assay and unsatisfactory animal welfare in in vivo cassette-dosing pharmacokinetic studies. The present study aimed to overcome these issues. A micellar ROS (mROS) assay was newly developed to evaluate photoreactivity of poorly water-soluble chemicals, resulting in an increase in the number of evaluable chemicals by ROS assay systems. An in vitro permeation test was applied to the proposed photosafety screening strategy as an alternative to the in vivo pharmacokinetic study for evaluating chemical exposure of the skin. Combined use of the ROS assay system and in vitro permeation test provided reliable photosafety evaluations. These findings would contribute to drug discovery and product development with high photosafety and improved animal welfare.

1. はじめに

薬剤性光線過敏症（光毒性）は，化学物質への曝露後，皮膚や眼などの露光部位に存在する化学物質が太陽光照射により励起することで発生する有害反応である（Fig. 1）．^1–4）特に光毒性発症の機序上流では，太陽光曝露で励起した化学物質が活性酸素種（reactive oxygen species: ROS）などの反応性分子種を産生し，これらが生体内分子との反応を介して様々な光毒性反応が惹起される．既存の医薬品に加え，日常でも使用・摂取し得る化粧品及び食品成分でも同様に光毒性が起こることは数多く報告されている．^2）化学物質による光毒性の症状は外貌を含む露光部位で発現するため，医薬品の服用患者や化粧品・機能性食品などの使用者に認知され易く，原因薬剤の減量・中止，原因となった化粧品や機能性食品の使用制限や中止並びに湿疹症状などに対する新たな治療が必要となる．また，太陽光曝露を避けるための長袖などの衣服の着用や日焼け止め料の使用などが必要となり，服薬コンプライアンスや生活の質に強く影響する．近年はオゾン層破壊を主因とする地表面への紫外線到達量増加といった地球環境の変化もあり，化学物質による光毒性リスクに対する人々の関心は非常に高くなった．創薬や香粧品開発の現場においても，化学物質による光毒性は有害反応として認識され，UV吸収測定^5）や，Organisation for Economic Cooperation and Development（OECD）にて2004年にテストガイドライン化された細胞を用いたin vitro光毒性試験（3T3 neutral red uptake phototoxicity test）^6,7）並びにin vivo光毒性試験などを用いて化学物質の光安全性評価が実施されてきた．2014年には創薬にてInternational Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use（ICH）よりICH guideline S10 “Photosafety evaluation of pharmaceuticals”^8）が施行，香粧品開発ではPersonal Care Product Council（PCPC）にてPCPC guidanceの光安全性評価に関する内容^9）が改訂され，開発する医薬品や化粧品の光安全性評価の重要性がより高まった．さらに光安全性試験法について，2019年にROS assay，^10,11） 2021年に再構築ヒト表皮を用いたin vitro光毒性試験^12）がOECDのテストガイドラインとして採択されるなど，光安全性評価に関する研究はレギュラトリーサイエンスの分野でも関心が高い．

Fig. 1. Mechanism of Chemical Phototoxicity

筆者が静岡県立大学薬学部薬剤学分野在籍時に行った基礎的な研究の成果から化学物質の「光化学的反応性（photoreactivity）」並びに「皮膚曝露（skin exposure）」が化学物質による光毒性発現の重要なリスクファクターであることを見い出した．^13）この2つのリスクファクターは2014年施行のICH guideline S10 “Photosafety evaluation of pharmaceuticals”^8）においても薬剤性光線過敏症を引き起こす化学物質の特徴として明記され，レギュラトリーサイエンス分野への貢献ができた．さらに筆者の研究チームは，化学物質の「光化学的反応性（photoreactivity）」並びに「皮膚曝露（skin exposure）」に関するデータを組み合わせて化学物質の光毒性リスクを予測する光安全性評価系を新たに開発した（Fig. 2）．化学物質による光毒性の発症機序に基づく光安全性評価系を様々な経口投与化合物や皮膚適用化合物に適用することで，信頼性の高い化学物質の光安全性評価が可能であることを報告している．^14–18）

Fig. 2. Proposed Photosafety Assessment System

本光安全性評価系にて，光化学的反応性評価は擬似太陽光照射下で化学物質が産生したROSをモニタリングするROS assay，皮膚曝露評価においてはin vivo cassette-dosing薬物動態試験を用いてきた．一方，化学物質の光安全性評価系の構築に関する研究を進める中で，それぞれの評価手法においていくつかの課題が明らかとなった．本稿では構築した光安全性評価系で用いる各評価方法の課題克服を目的とした研究の成果について概説する．

2. 難水溶性化合物の光安全性評価を可能とするmicellar ROS（mROS）assayの開発

ROS assayは2006年に尾上誠良教授（静岡県立大学薬学部）が企業在籍時に考案した光毒性予測のための新たなツールであり，^10,19）擬似太陽光照射下にて化学物質から産生される一重項酸素（singlet oxygen: ¹O₂）及びスーパーオキシド（superoxide: O₂⁻）の2種のROSをモニタリングすることにより，化学物質の光毒性リスクを評価する．2009年にはROS assayの国際ガイドライン採用を目的とした国際協調活動をJapanese Center for the Validation of Alternative Methods（JaCVAM）支援下で開始した．JaCVAM支援下の活動の中で，静岡県立大学薬学部薬剤学分野をlead labとしたROS assayの施設間バリデーション試験を食品薬品安全センター秦野研究所や製薬協加盟企業と実施した．^20,21）当時大学院生だった筆者も本バリデーション試験にてlead labのメンバーの一人として参画し，good laboratory practice（GLP）下での実験や新規試験法を国際標準へと進めていく過程を学ぶといった貴重な経験ができた．ROS assayの施設間バリデーション試験において偽陰性判定が認められず，その後ROS assayは2014年にICH guideline S10 “Photosafety evaluation of pharmaceuticals”にて推奨試験法として採用された．^8）続いて2019年にはOECDにてOECD guideline “Test Guideline No. 495: Reactive Oxygen Species （ROS） Assay for Photoreactivity”が成立し，^11）創薬のみならず広範な産業分野の化学物質の光安全性評価の推奨試験法となった．一方で，ROS assayの課題として，i）2種のROS（¹O₂及びO₂⁻）の産生の評価が必要なこと，ii）化学物質への擬似太陽光照射時間が1時間と試験実施時間が長いこと，並びにiii）reaction mixtureの溶媒は水であるため，難水溶性化合物への適用が困難なことが挙げられる．近年開発される医薬品候補化合物や皮膚に直接適用する化粧品関連素材は難水溶性化合物であることが多いため，特にiii）に挙げた難水溶性化合物への適用性の解決は急務であった．

ROS assayの施設間バリデーション試験にて，擬似太陽光照射下での被験物質（200 µM）からのROS産生の結果と，被験物質の光毒性に関する臨床所見やほかの光安全性試験の結果などを比較することで，化学物質の光安全性評価に用いる際のROS assayのcriteriaを設定した．^20,21） ROS assayによる光安全性評価では，擬似太陽光照射下で被験物質200 µMからのROS産生がcriteriaを超えなければ，被験物質の光毒性の懸念はないと判断できる．Table 1に示すようにROS assayのreaction mixtureの主な溶媒は20 mM sodium phosphate buffer（NaPB; pH 7.4）であり，dimethyl sulfoxide（DMSO）に溶解した被験物質を20 mM NaPB（pH 7.4）中に添加する．しかしながら，被験物質の溶解度の問題でreaction mixture調製中に被験物質が析出することがある．被験物質濃度200 µMでのreaction mixtureの調製が困難な場合には，被験物質濃度を200 µM未満にしたreaction mixtureを再度調製してROS assayを実施する．被験物質濃度が200 µM未満であっても，擬似太陽光を照射した被験物質からのROS産生がcriteriaを超えると被験物質の光毒性リスクが高いと判断できる．一方で，被験物質濃度に依存して被験物質からのROSの産生が強くなるため，^10） 200 µM未満の被験物質のROS産生がcriteriaを超えない場合は，被験物質の光毒性リスクの適切な評価はできない．そこで，ROS assayで評価が困難な難水溶性化合物の光安全性評価を可能にする新たなROS assay systemとして，界面活性剤をreaction mixtureに添加したmROS assayの開発を試みた．複数の界面活性剤を用いて実施したROS assayの研究を基に，^22）界面活性剤のTween 20を含むreaction mixtureを調製し（Table 1），ROS assayのfollow-up試験としてのmROS assayの有用性について，主に医薬品を含む被験物質83種を用いて検証した．はじめにROS assayを実施し，ROS assayにて溶解性の問題で評価不可であった被験物質について，mROS assayにて評価を行い（Fig. 3），ROS assay単独とROS/mROS assay併用時の評価可能化合物数と予測精度について比較した（Table 2）．その結果，ROS assayの単独で評価できた化合物数は58種（69.9%）であったが，ROS assayで評価不可であった被験物質のfollow-up試験をmROS assayにて行うことで，併せて82種（98.8%）の被験物質についてROS産生の評価を実施できた．ROS/mROS assayの予測精度は陰性検出率100%，陽性検出率及び特異性もROS assay単独評価と同等の値を示し，難水溶性化合物の光安全性評価においてROS assayのfollow-up試験としてのmROS assayの使用が貢献できることを示した．^23）さらに，難水溶性化合物の多い化粧品関連素材を含む被験物質にROS/mROS assaysを適用した研究を実施した．^24）この研究で用いた33種の化粧品関連素材について，ROS assay単独では19種（57.6%）が評価可能であった一方で，ROS/mROS assaysでは33種すべての被験物質の評価結果を得ることできた（Table 2）．また，ROS/mROS assaysの予測精度も非常に高く，ROS assayにて評価困難な難水溶性化合物に対してmROS assayによる補完的な光安全性評価の有用性を示すことができた．これらの研究成果により，ROS assay systemでより多くの被験物質の光安全性評価ができるようになった．幸いにも，OECD guideline “Test Guideline No. 495: Reactive Oxygen Species （ROS） Assay for Photoreactivity”にて，難水溶性化合物の光安全性評価に対応し得るROS assay systemの一つとしてmROS assayが引用され，^11） ROS assayのOECDテストガイドライン化という国際協調活動に大きく貢献できた．

Table 1. Composition of Reaction Mixtures in ROS and mROS Assays

	Singlet oxygen (1O2)		Superoxide (O2−)
ROS assay	20 mM NaPB (pH 7.4)	480 µL	20 mM NaPB (pH 7.4)	855 µL
	0.2 mM imidazole in 20 mM NaPB (pH 7.4)	250 µL	0.4 mM NBT in 20 mM NaPB (pH 7.4)	125 µL
	0.2 mM RNO in 20 mM NaPB	250 µL
	Chemical in DMSO	20 µL	Chemical in DMSO	20 µL
	Total	1000 µL	Total	1000 µL
mROS assay	Singlet oxygen (1O2)		Superoxide (O2−)
	20 mM NaPB (pH 7.4)	475 µL	20 mM NaPB (pH 7.4)	850 µL
	0.2 mM imidazole in 20 mM NaPB (pH 7.4)	250 µL	0.4 mM NBT in 20 mM NaPB (pH 7.4)	125 µL
	0.2 mM RNO in 20 mM NaPB	250 µL
	Tween 20	5 µL	Tween 20	5 µL
	Chemical in DMSO	20 µL	Chemical in DMSO	20 µL
	Total	1000 µL	Total	1000 µL

Abbreviations: NaPB, sodium phosphate buffer; RNO, p-nitrosodimethylaniline; NBT, nitroblue tetrazolium; DMSO, dimethyl sulfoxide.

Fig. 3. Flowchart Showing the Combined Use of ROS and mROS Assays for the Photosafety Assessment Approach

Upon solubility check, test chemicals are divided into following the 3 groups: ‘Soluble’ indicates that a chemical at 200 µM is soluble in both assay mixtures for ROS generation; ‘Partly soluble’ indicates that (i) a chemical at 200 µM is insoluble in either reaction mixture, or (ii) a diluted chemical below 200 µM is soluble in at least one of the reaction mixtures; and ‘insoluble’ indicates that a chemical is insoluble in both reaction mixtures. To decide on the phototoxicity risk of test chemicals in both assays, the criteria are referred to in the OECD guideline: “Test Guideline No. 495: Reactive Oxygen Species (ROS) Assay for Photoreactivity.”¹¹⁾ Subthreshold, ¹O₂ [ΔA_440 nm×10³]<25 and O₂⁻ [ΔA_560 nm×10³]<20; over-threshold, ¹O₂ [ΔA_440 nm×10³]≧25 and O₂⁻ [ΔA_560 nm×10³]≧20. Abbreviations: ΔA_440 nm, increase of absorbance at 440 nm; ΔA_560 nm, decrease of absorbance at 560 nm.

Table 2. Applicability and Prediction Capacity

	83 Chemicals		33 Cosmetics
	ROS assay	ROS/mROS assays	ROS assay	ROS/mROS assays
Evaluable chemicals	69.9%	98.8%	57.6%	100.0%
Positive predictivity	94.1%	95.6%	90.0%	95.2%
Negative predictivity	100.0%	100.0%	100.0%	100.0%
Specificity	70.0%	82.4%	90.0%	92.3%

3. 動物実験代替法としての新規光安全性評価系の構築

基礎研究や創薬・製品開発において，動物愛護の観点から1959年にRussellとBurchによって提唱された動物実験の3Rs（refinement, reduction, replacement）^25）への貢献が強く求められている．特に香粧品業界では2013年に欧州にて動物実験を用いて開発された化粧品の販売が禁止となった．この社会的要請に応えるべく，動物福祉に貢献できる動物実験代替法が活発に研究・開発されている．光毒性リスク評価においても，3T3 neutral red uptake phototoxicity test，^6）再構築ヒト表皮を用いたin vitro光毒性試験^12）並びにROS assay^10）などが動物実験代替法として広く活用されている．また，化学物質のアレルギー性評価の動物実験代替法として用いられるhuman cell line activation test（h-CLAT）を応用したphoto-h-CLATが光アレルギー性評価に有用な動物実験代替法として検討されている．^26,27）筆者の研究チームの研究で提案している光安全性評価系においてもreductionの観点から，皮膚曝露評価にて使用動物数の低減が可能なin vivo cassette-dosing薬物動態試験を用いてきた．^14–18）このin vivo cassette-dosing薬物動態試験は複数の化学物質を実験動物1匹に投与することで，化学物質の体内動態をそれぞれ評価できる手法である．しかしながら，皮膚曝露評価では経時的な動物皮膚の採取が避けられないため，実験動物数削減に貢献できているとは言い難かった．特に香粧品による光毒性は製品開発において障害となるため，筆者の研究チームが提案している光安全性評価系で用いる皮膚曝露評価においても動物実験代替法の適用は急務であった．

そこで更なる動物福祉への貢献を目的とし，in vitro皮膚透過性試験に着目した．^28,29）摘出皮膚を用いたin vitro皮膚透過性試験にて定常状態での皮膚内濃度の予測ができるため，^29）本手法を光安全性評価系における化学物質の皮膚曝露評価方法として導入可能か検討を実施した．被験物質として，光毒性を有するacridine（ACD），furosemide（FSM），hexachlorophene（HCP），8-methoxypsoralen（MOP），norfloxacin（NFX），promethazine（PMZ）を用い，ROS assay及びin vitro皮膚透過性試験を実施し，各被験物質の光毒性リスク評価を行った．Table 3に示した各評価結果を統合的に解析したところ，被験物質の光毒性リスクをACD>HCP>PMZ>MOP>FSM≒NFXと予測し，被験物質のin vivo皮膚光毒性と良好に対応することを核にした（Table 4）．すなわち，ROS assayとin vitro皮膚透過性試験を組み合わせ，各試験結果の統合的解析にて化学物質の光安全性評価が可能であった．^30）また，異なる組み合わせの被験物質群においても良好な光安全性評価ができたことを筆者の研究チームは報告しており，^31） ROS assayとin vitro皮膚透過性試験の組み合わせによる新たな光安全性評価系は使用する実験動物数を削減するとともに信頼性の高い化学物質の光毒性リスク評価が可能であると考える．

Table 3. Decision Matrix

Black cells indicate high levels of each crucial factor: ROS data over the defined criteria in the ROS assay (¹O₂ [ΔA_440 nm×10³]: 25; and O₂⁻ [ΔA_560 nm×10³]: 20); and relatively high C_ss values in the in vitro permeation tests. Abbreviations: ΔA_440 nm, increase of absorbance at 440 nm; ΔA_560 nm, decrease of absorbance at 560 nm; C_ss, steady-state concentration in removed rat skin or artificial membrane.

Table 4. Prediction Performance

Predicted phototoxicity risk

ROS data+Css in removed rat skin

ACD>HCP>PMZ>MOP>FSM≒NFX

ROS data+Css in artificial membrane

ACD>HCP>PMZ>FSM>MOP>NFX

Observed in vivo skin phototoxicity

ACD≒HCP>PMZ>MOP>FSM>NFX

動物実験代替法による光安全性評価系の構築のさらなる検討として，ヒト皮膚を模倣した人工膜によるin vitro透過性試験を採用することで，実験動物に依存しない化学物質の光安全性評価系が構築できるか，前述の6種の光毒性化合物を用いて検証した．各評価結果はTable 3に示しており，統合的に解析することで予測した化学物質の光毒性リスクはACD>HCP>PMZ>FSM>MOP>NFXであった（Table 4）．この光毒性リスク予測はin vivo皮膚光毒性試験の結果とよい対応を示し（Table 4），ROS assayと人工膜を用いるin vitro透過性試験を組み合わせた光安全性評価系は，実験動物を使用することなく，化学物質の光安全性評価に貢献できることを示唆した．

以上より，in vivo cassette-dosing薬物動態試験による皮膚曝露評価の代替法として，摘出皮膚あるいは人工膜を用いるin vitro透過性試験を導入することで，実験動物数を大幅に削減した光安全性評価系あるいは動物実験に依存しない光安全性評価系の構築が可能となり，提案する光安全性評価系は動物福祉に関する社会的要請に応えるとともに，より光安全性の高い創薬・製品開発に貢献できるであろう．

4. おわりに

本総説では，筆者の研究チームが構築した光反応性と皮膚曝露に基づく化学物質の光安全性評価系の持つ課題克服を目的とした研究について紹介した．化学物質による光毒性はかならずしも死に至る有害事象ではないが，医薬品・製品の使用者自身が容易に認識できる有害事象である．紫外線量の増加という地球環境の変化もあり，化学物質による光毒性への関心は非常に高く，創薬や製品開発における光安全性評価は非常に重要であると考える．また，化学物質の光毒性発現機序を基盤とした光安全性評価の研究を推進する中で，臨床にて薬剤性光線過敏症が高頻度に起こる医薬化合物について，光毒性リスク低減を志向したde-risking drug delivery system（DDS）研究へと応用・発展させ，より光安全性の高い投与形態の提案という成果に結実した．^32–34）動物福祉を考慮した光安全性評価系の構築に関する研究を推進し，より光安全性の高い創薬並びに香粧品などの製品開発，そして人々の健康に貢献するべく，今後も研究活動を進めていく所存である．

謝辞

本研究は静岡県立大学薬学部薬剤学分野にて実施し，終始懇切な御指導・御鞭撻を賜りました静岡県立大学薬学部薬剤学分野 教授 尾上誠良先生に心より感謝申し上げます．多くの有益な御助言・御指導を賜りました静岡県立大学附属薬食研究推進センター 特任教授 山田静雄先生，静岡県立大学薬学部薬剤学分野 准教授 佐藤秀行先生に厚く御礼申し上げます．さらに，多くの共同研究者の皆様，薬剤学分野の卒業・修了生の多大な御助力，そして様々な助成金の御支援により得られた研究成果であり，深く感謝いたします．

利益相反

開示すべき利益相反はない．

Notes

本総説は，2023年度日本薬学会東海支部学術奨励賞の受賞を記念して記述したものである．

REFERENCES

• 1) Epstein J. H., J. Am. Acad. Dermatol., 8, 141–147 (1983).
• 2) Onoue S., Seto Y., Gandy G., Yamada S., Curr. Drug Saf., 4, 123–136 (2009).
• 3) Seto Y., Hosoi K., Takagi H., Nakamura K., Kojima H., Yamada S., Onoue S., Curr. Drug Saf., 7, 140–148 (2012).
• 4) Kim W. B., Shelley A. J., Novice K., Joo J., Lim H. W., Glassman S. J., J. Am. Acad. Dermatol., 79, 1069–1075 (2018).
• 5) Henry B., Foti C., Alsante K., J. Photochem. Photobiol. B, 96, 57–62 (2009).
• 6) Spielmann H., Liebsch M., Doring B., Moldenhauer F., Altern. Anim. Exp., 11, 22–31 (1994).
• 7) The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), “OECD Guideline for Testing of Chemicals, 432, In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test,” 2004.
• 8) International Council on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), “ICH Guideline S10 Guidance on Photosafety Evaluation of Pharmaceuticals,” 2014.
• 9) Personal Care Products Council (PCPC), “PCPC 2014 Safety Evaluation Guidelines; Chapter 7: Evaluation of Photoirritation and Photoallergy potential,” 2014.
• 10) Onoue S., Tsuda Y., Pharm. Res., 23, 156–164 (2006).
• 11) The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), “OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, 495, Reactive Oxygen Species (ROS) Assay,” 2019.
• 12) The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), “OECD Guidelines for the Testing Chemicals, 498, In vitro Phototoxicity—Reconstructed Human Epidermis Phototoxicity Test Method,” 2021.
• 13) Seto Y., Onoue S., Yamada S., Eur. J. Pharm. Sci., 38, 104–111 (2009).
• 14) Seto Y., Inoue R., Ochi M., Gandy G., Yamada S., Onoue S., AAPS J., 13, 482–492 (2011).
• 15) Seto Y., Ohtake H., Kato M., Onoue S., J. Pharmacol. Exp. Ther., 354, 195–202 (2015).
• 16) Onoue S., Kato M., Inoue R., Seto Y., Yamada S., Toxicol. Sci., 137, 469–477 (2014).
• 17) Seto Y., Ohtake H., Sato H., Onoue S., Regul. Toxicol. Pharmacol., 113, 104619 (2020).
• 18) Iyama Y., Sato H., Seto Y., Onoue S., J. Pharm. Sci., 108, 1303–1308 (2019).
• 19) Onoue S., Kawamura K., Igarashi N., Zhou Y., Fujikawa M., Yamada H., Tsuda Y., Seto Y., Yamada S., J. Pharm. Biomed. Anal., 47, 967–972 (2008).
• 20) Onoue S., Hosoi K., Wakuri S., Iwase Y., Yamamoto T., Matsuoka N., Nakamura K., Toda T., Takagi H., Osaki N., Matsumoto Y., Kawakami S., Seto Y., Kato M., Yamada S., Ohno Y., Kojima H., J. Appl. Toxicol., 33, 1241–1250 (2013).
• 21) Onoue S., Hosoi K., Toda T., Takagi H., Osaki N., Matsumoto Y., Kawakami S., Wakuri S., Iwase Y., Yamamoto T., Nakamura K., Ohno Y., Kojima H., Toxicol. In Vitro, 28, 515–523 (2014).
• 22) Onoue S., Yamauchi Y., Kojima T., Igarashi N., Tsuda Y., Pharm. Res., 25, 861–868 (2008).
• 23) Seto Y., Kato M., Yamada S., Onoue S., Toxicol. In Vitro, 27, 1838–1846 (2013).
• 24) Onoue S., Suzuki G., Kato M., Hirota M., Nishida H., Kitagaki M., Kouzuki H., Yamada S., Toxicol. In Vitro, 27, 2316–2324 (2013).
• 25) Russell W. M. S., Burch R. L., “The Principles of Humane Experimental Technique,” Methuen, London, 1959, 238 pp.
• 26) Hino R., Orimo H., Kabashima K., Atarashi K., Nakanishi M., Kuma H., Tokura Y., J. Dermatol. Sci., 52, 140–143 (2008).
• 27) Hoya M., Hirota M., Suzuki M., Hagino S., Itagaki H., Aiba S., Toxicol. In Vitro, 23, 911–918 (2009).
• 28) Wang J. C., Williams R. R., Wang L., Loder J., Pharm. Res., 7, 995–1002 (1990).
• 29) Sugibayashi K., Todo H., Oshizaka T., Owada Y., Pharm. Res., 27, 134–142 (2010).
• 30) Iyama Y., Sato H., Seto Y., Onoue S., Toxicol. Lett., 317, 45–52 (2019).
• 31) Iyama Y., Sato H., Seto Y., Onoue S., Eur. J. Pharm. Sci., 146, 105257 (2020).
• 32) Onoue S., Seto Y., Kato M., Aoki Y., Kojo Y., Yamada S., Pharm. Res., 30, 1586–1596 (2013).
• 33) Seto Y., Suzuki G., Leung S. S., Chan H. K., Onoue S., Pharm. Res., 33, 1447–1455 (2016).
• 34) Seto Y., Suzuki G., Kato M., Sato H., Onoue S., J. Drug Deliv. Sci. Technol., 94, 105487 (2024).