LC-MS分析によるの解析では、検出される断片の網羅率が十分に高くないため、幸運にも検出された部分についてはされていることがわかるが、検出されない断片はの有無もわからない。また、修飾を含めてデータベース検索することで、同定の精度が低下し、誤同定を産む場合も多く、得られる断片のパターンが変わることも多くどうように同定の精度を下げる。また、を受けるということは多様性が生じるため、それぞれの成分の定量も大変重要であるが、の有無によるイオン化効率の変動が大きく、定量が難しい。このような状況の中で、MSと同程度の感度を持ち、MSのデータの補完をする方法が望まれてきた。我々はMSのデータの補完する解析のためのアミノ酸分析法を開発した。これを用いて、修飾アミノ酸の検出を行いタンパク質中にあるの同定、また修飾の定量をして修飾を受けている分子の割合を決定できないか、を検討している。 タンパク質は溶液を乾燥またはSDS電気泳動後PVDF膜に転写した後、気相法110度20時間、定沸点塩酸で加水分解した。アミノ酸分析法は高感度なAQC化法（Cohen Sら1993）で誘導体化しHP1100を用いた逆相HPLCで蛍光検出した。を検出した。 現在までにタンパク質の糖鎖、リン酸化、メチル化について検討し、それぞれ修飾アミノ酸、アミノ糖を検出できた。メチル化については溶液の試料からは、メチルリジン（ジメチル、トリメチル）を高い回収率で検出でき、定量が可能であった。どの修飾も電気泳動後PVDF膜に転写して測定すると回収率の低下が見られたが、検出は可能であった。 　極微量のタンパク質のアミノ酸組成分析は、の解析において、MSを補完する分析法として大変有用であると考えられた。

抄録全体を表示

タンパク質化学合成法の発展により、多様なを持つタンパク質の作製が可能なってきた。本稿では、タンパク質化学合成法について解説するとともに、化学合成タンパク質を用いた研究について紹介する。特に、エピジェネティクス研究で中心的役割を果たすヒストンタンパク質の研究、また本特集のテーマであるユビキチン鎖やユビキチン化タンパク質を化学的に合成し、応用した研究例について紹介する。

抄録全体を表示

タンパク質は，

（PTM）を受けて，その性質を多様に変化させる．そのため，タ ンパク質の機能を理解する上で，質量分析装置を用いた網羅的な解析によって取得できるPTM情報が重要になる．しかし，このような解析によって取得できるタンパク質のPTM情報の大部分は有効活用することができない．そこで，私たちは，PTM情報を統合し，管理するためのシステムを構築し，さらには，タンパク質のPTM情報を集めた独自データベース，ModProt（Post-Translational Modification Map of Proteome）を作成した．今後，ModProtは，PTM研究を推進するための重要なツールとして，また，PTMを標的とした個別化医療実現に向けた強力なツールとして，様々な研究に応用されることが期待される．

抄録全体を表示

細胞内・生体内におけるタンパク質機能はリン酸化、アセチル化、メチル化、グリコシル化などのによって高次に制御されている。特にこれらのは、細胞内部におけるシグナル伝達・遺伝子発現制御ネットワーク、細胞間情報伝達などにおいて非常に重要や役割を担っており、また、の異常は、癌をはじめとした様々な病気に直接・間接的に影響を及ぼすことが知られている。近年のプロテオミクス技術の進歩、特にタンデム質量分析技術の進歩に伴って、細胞・組織中で発現しているタンパク質を同定するだけではなく、同時になどに関する情報を得ることが可能になってきた。　質量分析計を用いて、の同定を行う場合、基本的に次の二つのステップが必要である。(i)を受けたタンパク質またばペプチドをソフトにイオン化し質量を決定する、(ii)を受けたタンパク質またはペプチドイオンを気相中で断片化し、構造情報を読み取る。は熱的、化学的に不安定であることも多く、それを壊さないように、ソフトにイオン化して、精密な質量電荷比を測定することが必要である。また、を受けたタンパク質・ペプチドなどの複合体の構造解析を行うためには、様々な特性の異なる断片化法を組み合わせることも効果的である。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計(FTICR-MS)はルーティン的な使用時でも、定常的に一万以上の質量分解能と数ppmでの高精度質量分析を実現できる、優れた質量分析計であり、プロテオミクス分野での利用が広がっている。FTICR-MSはイオントラップ型の質量分析装置であり、超伝導マグネットが作る磁場中においたICRセル内部にイオンをトラップし、その質量電荷比を、非接触的な手法で測定することができる。また、FTICR-MSでは、ICRセル内にトラップしたイオンを、衝突誘起解離(CID)、赤外線多光子吸収解離(IRMPD)、電子捕獲解離(ECD)などの様々な手法で断片化することができるため、糖鎖付加を受けたペプチドやリン酸化を受けたペプチドなど、複雑な複合分子の構造解析に適している。　講演では、特に糖鎖付加を受けたペプチドの構造解析を例に取り、FTICR-MSを用いたタンパク質の同定技術についての現状を述べ、今後の生命科学においてどのような位置づけが期待されるのかを議論したい。

抄録全体を表示

プロテアソームは、ユビキチン化されたタンパク質を分解することによって重要な生体機能の制御に係わっている。したがって、プロテアソームやユビキチンならびにそれらと関連するタンパク質の異常はしばしば疾患の原因になることが知られている。演者らは、26Sプロテアソームを構成するサブユニットのはプロテアソームの機能に何らかの役割を担っており、その異常はプロテアソームの機能障害を引き起こし、疾患の原因となると推定している。しかし、プロテアソームにはどのようながあるのかまだ完全に明らかにされていない。また、の役割もほとんど解明されていない。そこで、酵母を用いて26Sプロテアソームを精製し、質量分析装置などを利用してを網羅的に解析した。さらに、異常をもつプロテアソームを作製し、の役割を調べた。その結果、26SプロテアソームのすべてのサブユニットのＮ末端修飾の状態が明らかになった。31種類のサブユニットのうち、19種類のサブユニットがN-アセチル化されていた。また、１種類のサブユニットのＮ末端がミリストイル化されていることがわかった。一方、16種類のタンパク質はリン酸化されていると推定された。さらにO結合型アセチルグルコサミンで修飾されているサブユニットが少なくとも８種類存在することが示唆された。N-アセチルトランスフェラーゼ欠失変異体を用いた実験から、脱N-アセチル化によって20Sプロテアソームのプロテアーゼ活性が上昇すること、また、ホスファターゼ処理による脱リン酸化によって20Sプロテアソーム（キモトリプシン様活性）の基質に対する親和性が低下することがわかった。これらの結果から、プロテアソームのは機能と密接な係わりがあることが確認できた。そのため、の異常は、生体機能の異常を引き起こす原因になり得ると考えられた。

抄録全体を表示

アミノ酸分析を用いたの解析　の解析は、プロテオーム研究のひとつの大きな課題である。タンパク質を断片化して質量分析する現在の一般的なLC-MS法では残念ながらを見つけることは以下の理由で難しい。1．がプロテアーゼによる消化を妨げて質量分析に適した断片が得られない。２．未修飾断片との入った断片でイオン化効率が違い質量分析法で検出できなくなる。または、全く定量的でなくなり正しい解釈が得られなくなる。３．されることで一般的な測定範囲に収まらず検出できなくなる。たとえば質量分析法では質量範囲外になる、イオン交換や逆相クロマトグラフィーで吸着しなくなる、または溶出しなくなるなど。４．は大変多様であり、多くの分子種に分かれ、一つ当りの量が減り検出できなくなる、またそのうちの多くの種類が分析できなくなる。これらの原因を解消するためには、LC-MS法以外の方法の開発が急務であると考えられる。しかし、質量分析法に並ぶ高感度な分析方法がなく一向に進展していない。　アミノ酸分析法は、蛍光色素をプレカラムでラベルする方法が開発されて以来、アミノ酸100fmol以下でも検出できる高感度な分析法となった。しかし、加水分解を行うことで外界からの汚染に大変弱くその高感度な利点を生かすことが難しい。PVDF膜に転写した試料を用いることで、pmol以下のタンパク質試料のアミノ酸組成が得られている。我々は、この方法をもとに加水分解条件を検討し、種々のを修飾アミノ酸として高感度に検出する方法を検討している。この方法の利点は上記のLC-MS法の欠点の一切を含まないこと。特に定量法であるアミノ酸分析法を利用することで、高度な定量情報を放射性（または安定）同位元素を用いず、原理の明快な直接分析法で得ることができる点である。　現在までに、われわれのチームでは、ブロット膜上のオブアルブミンを塩酸加水分解しでホスホセリンやグルコサミンを検出することで、リン酸化や糖鎖付加などのプロテオーム研究の重要な課題となるの検出に成功している。現在、加水分解条件や、修飾アミノ酸の分離を検討している。

抄録全体を表示

一酸化窒素（NO）は血管平滑筋弛緩以外にも多くの生理活性があり，最近その分子的メカニズムとしてNOによるシステインのチオール基の修飾が注目されている．気管支喘息においてもS-ニトロシル化の関与が報告され，その分子メカニズムとしてアドレナリンβ受容体の脱感作抑制の可能性が示唆された．今回我々はS-ニトロシル化によるアドレナリンβ受容体の制御の機構としてGRK，β-アレスチン，ダイナミンの3つのタンパク質を使って一連の研究を行い，この3つのタンパク質がS-ニトロシル化され，S-ニトロシル化によりタンパク質の機能が制御され，その結果としてS-ニトロシル化がβ受容体の機能を制御していることを示した．この3つのタンパク質のS-ニトロシル化が生理的/病理的意義，特に気管支喘息において発症に関与するかどうかは，動物実験などによりさらに詳しく検討する必要がある．

抄録全体を表示

タンパク質の

（PTM）は，タンパク質の多様性の創出に寄与し，様々な生物学的プロセスの調節において重要な役割を果たしている．そのため，タンパク質の機能を理解するためにはPTM解析が重要になる．本稿では，著者らのタンパク質PTM解析に関する3つのトピックについて紹介した．1. 2-DEや質量分析を用いて酵母プロテアソーム構成サブユニットのN末端修飾を同定すると共に，変異体解析により各サブユニットのN末端修飾がプロテアソームの機能に影響を及ぼすことを示した．2. Phos-tag 2-DEを用いたPTM解析により，hnRNPKは複数のタンパク質フォームとして細胞内で発現し，各フォームは外部刺激に対して異なる反応を示すことがわかった．3. PTMに関する独自MSデータを統合および管理するオリジナルデータベースModProtを構築した．

抄録全体を表示