エレクトロポレーションの最適条件によるBucillus subtilisの形質転換とRuminococcus albusセルラーゼ遺伝子の発現

宮城 智子; 金市 浩二; 福村 正之; 苅田 修一; 粟冠 和郎; 嶋田 協; 大宮 邦雄

doi:10.2508/chikusan.65.407

宮城智子, 金市浩二, 福村正之, 苅田修一, 粟冠和郎, 嶋田協, 大宮邦雄

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ジャーナルフリー

1994 年 65 巻 5 号 p. 407-415

DOI https://doi.org/10.2508/chikusan.65.407

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発行日: 1994/05/25 受付日: 1993/08/31 J-STAGE公開日: 2008/03/10 受理日: - 早期公開日: - 改訂日: -
訂正情報
訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: 引用文献情報訂正内容: Wrong : 1) BELLIVEAU, B. H. and J. T. TREVORS, Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1649-1652. 1989.
2) CRUZ-RODZ, A. L. and M. S. GILMORE, High efficiency introduction of plasmid DNA intoglycine treated Enterococcus faecalis by electroporation. Mol. Gen. Genet., 224: 152-154. 1990.
3) DEGUCHI, H.,Y. WATANABA. T. SASAKI, T. MATSUDA, S. SHIMIZU and K. OHMIYA, Purifi. cation and properties of the endo-1, 4-β-glucanase from Ruminococcus albus and its gene product in Escherichia coli. J. Ferment. Bioeng., 71: 221-225. 1991.
4) DUNNY, G. M., L. M. LEE and D. J. LeBLANC, Improved electroporation and cloning vectorsystem for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1194-1201. 1991.
5) HALO, H. and I. F. NES, High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3119-3123. 1989.
6) KUSAOKE, H., Y. HAYASHI, Y. KADOWAKI and H. KIMOTO, Optimum conditions for electric pulsemediated gene transfer to Bacillus subtilis cells. Agric. Biol. Chem., 53: 2441-2446. 1989.
7) LAEMMLI, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970.
8) LUCHANSKY, J. B., P. M. MURIANA and T. R. KLAENHAMMER, Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium. Mol. MicrobioL,2: 637-646. 1988.
9) MERCENIER, A. and B. M. CHASSY, Strategies for the development of bacterial transformation systems. Biochimie, 70: 503-517. 1988.
10) Mtsnwn, N. and K. NAKAMURA, Expression and stability of a β-glucosidase gene of Ruminococcus albus in Zymomonas mobilis. Agric. Biol. Chem., 53: 723-727. 1989.
11) OHMIYA, K. and S. KARITA, Genetic engineering of the plant fiber-degrading rumen bacteria. Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63: 520-536. 1992.
12) OHMIYA, K., K. NAGASHSMA, T. KAJINO, E. GOTO, A. TSUKADA and S. SHIMIZU, Cloning of the cellulase gene from Ruminococcus albus and its expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 54: 1511-1515. 1988.
13) Snnnsrzoocx, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATSS, Molecular cloning;alaboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.
14) TAKAGI, H., S. KAGIYAMA, K. KADOWAKI, N. TSUKAGOSHI and S. UDAKA, Genetic transformation of Bacillus brevis with plasmid DNA by electroporation. Agric. Biol. Chem., 53: 3099-3100. 1989.
15) TAMIYA, E., Y. NAKAJIMA, H. KAMIOKA, M. SUZUKI and I. KARUBE, DNA cleavage based on high voltage electric pulse. FEBS Lett., 234: 357-361. 1988.
16) TEATHER, R. M. and K. OHMIYA, Molecular genetics of rumen cellulase system. Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants: Proceedings of the seventh international symposium on ruminant physiology.(TSUDA, T. Y. SASAKI and R. KAWASAKI eds.) 701-718. Academic Press, Inc. San Diego. 1991.
17) TEATHER, R. M. and P. J. WOOD, Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environ. Microbiol., 43: 777-780. 1982.
18) TUWBIN, H., T. STAEHELIN and J. GORDON, Electrophretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 4350-4354. 1979.
19) UEDA, S., S. MATSUMOTO, S. SHIMIZU and T. YAMANE, Transformation of a methylotrophic bacterium, Methylobecterium extorquens, with a broad-host-range plasmid by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 57: 924-926. 1991.
20) van der LELIE, D., J. M. B. M. van der VOSSEN and G. VENEMA, Effect of plasmid incompatibility on DNA transfer to Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 54: 865-871. 1988.

Right : 1) BELLIVEAU, B. H. and J. T. TREVORS, Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1649-1652. 1989.
2) CRUZ-RODZ, A. L. and M. S. GILMORE, High efficiency introduction of plasmid DNA intoglycine treated Enterococcus faecalis by electroporation. Mol. Gen. Genet., 224: 152-154. 1990.
3) DEGUCHI, H.,Y. WATANABA. T. SASAKI, T. MATSUDA, S. SHIMIZU and K. OHMIYA, Purifi. cation and properties of the endo-1, 4-β-glucanase from Ruminococcus albus and its gene product in Escherichia coli. J. Ferment. Bioeng., 71: 221-225. 1991.
4) DUNNY, G. M., L. M. LEE and D. J. LeBLANC, Improved electroporation and cloning vectorsystem for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1194-1201. 1991.
5) HALO, H. and I. F. NES, High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3119-3123. 1989.
6) KUSAOKE, H., Y. HAYASHI, Y. KADOWAKI and H. KIMOTO, Optimum conditions for electric pulsemediated gene transfer to Bacillus subtilis cells. Agric. Biol. Chem., 53: 2441-2446. 1989.
7) LAEMMLI, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970.
8) LUCHANSKY, J. B., P. M. MURIANA and T. R. KLAENHAMMER, Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium. Mol. MicrobioL,2: 637-646. 1988.
9) MERCENIER, A. and B. M. CHASSY, Strategies for the development of bacterial transformation systems. Biochimie, 70: 503-517. 1988.
10) Mtsnwn, N. and K. NAKAMURA, Expression and stability of a β-glucosidase gene of Ruminococcus albus in Zymomonas mobilis. Agric. Biol. Chem., 53: 723-727. 1989.
11) OHMIYA, K. and S. KARITA, Genetic engineering of the plant fiber-degrading rumen bacteria. Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63: 520-536. 1992.
12) OHMIYA, K., K. NAGASHSMA, T. KAJINO, E. GOTO, A. TSUKADA and S. SHIMIZU, Cloning of the cellulase gene from Ruminococcus albus and its expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 54: 1511-1515. 1988.
13) Snnnsrzoocx, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATSS, Molecular cloning;alaboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.
14) TAKAGI, H., S. KAGIYAMA, K. KADOWAKI, N. TSUKAGOSHI and S. UDAKA, Genetic transformation of Bacillus brevis with plasmid DNA by electroporation. Agric. Biol. Chem., 53: 3099-3100. 1989.
15) TAMIYA, E., Y. NAKAJIMA, H. KAMIOKA, M. SUZUKI and I. KARUBE, DNA cleavage based on high voltage electric pulse. FEBS Lett., 234: 357-361. 1988.
16) TEATHER, R. M. and K. OHMIYA, Molecular genetics of rumen cellulase system. Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants: Proceedings of the seventh international symposium on ruminant physiology.(TSUDA, T. Y. SASAKI and R. KAWASAKI eds.) 701-718. Academic Press, Inc. San Diego. 1991.
17) TEATHER, R. M. and P. J. WOOD, Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environ. Microbiol., 43: 777-780. 1982.
18) TUWBIN, H., T. STAEHELIN and J. GORDON, Electrophretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 4350-4354. 1979.
19) UEDA, S., S. MATSUMOTO, S. SHIMIZU and T. YAMANE, Transformation of a methylotrophic bacterium, Methylobecterium extorquens, with a broad-host-range plasmid by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 57: 924-926. 1991.
20) van der LELIE, D., J. M. B. M. van der VOSSEN and G. VENEMA, Effect of plasmid incompatibility on DNA transfer to Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 54: 865-871. 1988.

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: PDFファイル訂正内容: -

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: 引用文献情報訂正内容: Wrong : 1) BELLIVEAU, B. H. and J. T. TREVORS, Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1649-1652. 1989.
2) CRUZ-RODZ, A. L. and M. S. GILMORE, High efficiency introduction of plasmid DNA intoglycine treated Enterococcus faecalis by electroporation. Mol. Gen. Genet., 224: 152-154. 1990.
3) DEGUCHI, H.,Y. WATANABA. T. SASAKI, T. MATSUDA, S. SHIMIZU and K. OHMIYA, Purifi. cation and properties of the endo-1, 4-β-glucanase from Ruminococcus albus and its gene product in Escherichia coli. J. Ferment. Bioeng., 71: 221-225. 1991.
4) DUNNY, G. M., L. M. LEE and D. J. LeBLANC, Improved electroporation and cloning vectorsystem for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1194-1201. 1991.
5) HALO, H. and I. F. NES, High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3119-3123. 1989.
6) KUSAOKE, H., Y. HAYASHI, Y. KADOWAKI and H. KIMOTO, Optimum conditions for electric pulsemediated gene transfer to Bacillus subtilis cells. Agric. Biol. Chem., 53: 2441-2446. 1989.
7) LAEMMLI, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970.
8) LUCHANSKY, J. B., P. M. MURIANA and T. R. KLAENHAMMER, Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium. Mol. MicrobioL,2: 637-646. 1988.
9) MERCENIER, A. and B. M. CHASSY, Strategies for the development of bacterial transformation systems. Biochimie, 70: 503-517. 1988.
10) Mtsnwn, N. and K. NAKAMURA, Expression and stability of a β-glucosidase gene of Ruminococcus albus in Zymomonas mobilis. Agric. Biol. Chem., 53: 723-727. 1989.
11) OHMIYA, K. and S. KARITA, Genetic engineering of the plant fiber-degrading rumen bacteria. Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63: 520-536. 1992.
12) OHMIYA, K., K. NAGASHSMA, T. KAJINO, E. GOTO, A. TSUKADA and S. SHIMIZU, Cloning of the cellulase gene from Ruminococcus albus and its expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 54: 1511-1515. 1988.
13) Snnnsrzoocx, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATSS, Molecular cloning;alaboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.
14) TAKAGI, H., S. KAGIYAMA, K. KADOWAKI, N. TSUKAGOSHI and S. UDAKA, Genetic transformation of Bacillus brevis with plasmid DNA by electroporation. Agric. Biol. Chem., 53: 3099-3100. 1989.
15) TAMIYA, E., Y. NAKAJIMA, H. KAMIOKA, M. SUZUKI and I. KARUBE, DNA cleavage based on high voltage electric pulse. FEBS Lett., 234: 357-361. 1988.
16) TEATHER, R. M. and K. OHMIYA, Molecular genetics of rumen cellulase system. Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants: Proceedings of the seventh international symposium on ruminant physiology.(TSUDA, T. Y. SASAKI and R. KAWASAKI eds.) 701-718. Academic Press, Inc. San Diego. 1991.
17) TEATHER, R. M. and P. J. WOOD, Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environ. Microbiol., 43: 777-780. 1982.
18) TUWBIN, H., T. STAEHELIN and J. GORDON, Electrophretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 4350-4354. 1979.
19) UEDA, S., S. MATSUMOTO, S. SHIMIZU and T. YAMANE, Transformation of a methylotrophic bacterium, Methylobecterium extorquens, with a broad-host-range plasmid by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 57: 924-926. 1991.
20) van der LELIE, D., J. M. B. M. van der VOSSEN and G. VENEMA, Effect of plasmid incompatibility on DNA transfer to Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 54: 865-871. 1988.

Right : 1) BELLIVEAU, B. H. and J. T. TREVORS, Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1649-1652. 1989.
2) CRUZ-RODZ, A. L. and M. S. GILMORE, High efficiency introduction of plasmid DNA intoglycine treated Enterococcus faecalis by electroporation. Mol. Gen. Genet., 224: 152-154. 1990.
3) DEGUCHI, H.,Y. WATANABA. T. SASAKI, T. MATSUDA, S. SHIMIZU and K. OHMIYA, Purifi. cation and properties of the endo-1, 4-β-glucanase from Ruminococcus albus and its gene product in Escherichia coli. J. Ferment. Bioeng., 71: 221-225. 1991.
4) DUNNY, G. M., L. M. LEE and D. J. LeBLANC, Improved electroporation and cloning vectorsystem for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1194-1201. 1991.
5) HALO, H. and I. F. NES, High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3119-3123. 1989.
6) KUSAOKE, H., Y. HAYASHI, Y. KADOWAKI and H. KIMOTO, Optimum conditions for electric pulsemediated gene transfer to Bacillus subtilis cells. Agric. Biol. Chem., 53: 2441-2446. 1989.
7) LAEMMLI, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970.
8) LUCHANSKY, J. B., P. M. MURIANA and T. R. KLAENHAMMER, Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium. Mol. MicrobioL,2: 637-646. 1988.
9) MERCENIER, A. and B. M. CHASSY, Strategies for the development of bacterial transformation systems. Biochimie, 70: 503-517. 1988.
10) Mtsnwn, N. and K. NAKAMURA, Expression and stability of a β-glucosidase gene of Ruminococcus albus in Zymomonas mobilis. Agric. Biol. Chem., 53: 723-727. 1989.
11) OHMIYA, K. and S. KARITA, Genetic engineering of the plant fiber-degrading rumen bacteria. Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63: 520-536. 1992.
12) OHMIYA, K., K. NAGASHSMA, T. KAJINO, E. GOTO, A. TSUKADA and S. SHIMIZU, Cloning of the cellulase gene from Ruminococcus albus and its expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 54: 1511-1515. 1988.
13) Snnnsrzoocx, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATSS, Molecular cloning;alaboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.
14) TAKAGI, H., S. KAGIYAMA, K. KADOWAKI, N. TSUKAGOSHI and S. UDAKA, Genetic transformation of Bacillus brevis with plasmid DNA by electroporation. Agric. Biol. Chem., 53: 3099-3100. 1989.
15) TAMIYA, E., Y. NAKAJIMA, H. KAMIOKA, M. SUZUKI and I. KARUBE, DNA cleavage based on high voltage electric pulse. FEBS Lett., 234: 357-361. 1988.
16) TEATHER, R. M. and K. OHMIYA, Molecular genetics of rumen cellulase system. Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants: Proceedings of the seventh international symposium on ruminant physiology.(TSUDA, T. Y. SASAKI and R. KAWASAKI eds.) 701-718. Academic Press, Inc. San Diego. 1991.
17) TEATHER, R. M. and P. J. WOOD, Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environ. Microbiol., 43: 777-780. 1982.
18) TUWBIN, H., T. STAEHELIN and J. GORDON, Electrophretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 4350-4354. 1979.
19) UEDA, S., S. MATSUMOTO, S. SHIMIZU and T. YAMANE, Transformation of a methylotrophic bacterium, Methylobecterium extorquens, with a broad-host-range plasmid by electroporation. Appl. Environ. Microbiol., 57: 924-926. 1991.
20) van der LELIE, D., J. M. B. M. van der VOSSEN and G. VENEMA, Effect of plasmid incompatibility on DNA transfer to Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 54: 865-871. 1988.

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: PDFファイル訂正内容: -

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: 論文抄録訂正内容: 訂正前 : Ruminococcus albus F-40株から2種類のセルラーゼ遺伝子が大腸菌の系を用いてクローニングされているが,主要なセルラーゼの遺伝子がまだクローニングされていない.そこで,本研究では,R.albusと同じグラム陽性菌であるBaciltus subtilisをホストとし,これにベクターを導入するためにエレクトロポレーションの最適条件を設定した.まず,菌を経時的に採取し,細胞密度が一定になるように緩衝液に懸濁した後に,エレクトロポレーションを行ない形質転換効率および生存率を調べた,この結果,対数後期から定常期にかけて使用した時に高い形質転換効率を得た.次に物理的集件の検討を行なうため,パルス幅と電場強度をそれぞれ変えて形質転換効率を調べたところ,パルス幅を300～500μsec,電場強度を8-12kV/cmに設定した時に高い効率が得られた.プラスミドDNAの濃度と形質転換体数お
よび形質転換効率との関係について調べた結果,形質転換体数はDNA濃度が0.06μg/μlまでは比例的に増加したが,以後漸増するにとどまった.したがって形質転換効率はDNA濃度が0.06μg/μl以上で漸減した.得られた形質転換体より抽出したプラスミドを制限酵素で処理した後,電気泳動で確認したところ,挿入したプラスミドと全く同一であった.既に単離されているR.albus F-40株のセルラーゼ
遺伝子(egI)のを組み込んだベクターを用いて,この条件下でエレクトロポレーションを行なった.効率
よく,安定な形質転換体が得られ,ウェスタンブロッティングによりegI遺伝子も発現していることが
確認できた.また,大腸菌に対しB.subtilisではEgIの分解がみられなかったことから,B.subtilisの
系を用いR.albus cellulase遺伝子をクローニングすることが有効であることが判明した.
訂正後 : Ruminococcus albus F-40株から2種類のセルラーゼ遺伝子が大腸菌の系を用いてクローニングされているが,主要なセルラーゼの遺伝子がまだクローニングされていない.そこで,本研究では,R.albusと同じグラム陽性菌であるBaciltus subtilisをホストとし,これにベクターを導入するためにエレクトロポレーションの最適条件を設定した.まず,菌を経時的に採取し,細胞密度が一定になるように緩衝液に懸濁した後に,エレクトロポレーションを行ない形質転換効率および生存率を調べた,この結果,対数後期から定常期にかけて使用した時に高い形質転換効率を得た.次に物理的集件の検討を行なうため,パルス幅と電場強度をそれぞれ変えて形質転換効率を調べたところ,パルス幅を300～500μsec,電場強度を8-12kV/cmに設定した時に高い効率が得られた.プラスミドDNAの濃度と形質転換体数および形質転換効率との関係について調べた結果,形質転換体数はDNA濃度が0.06μg/μlまでは比例的に増加したが,以後漸増するにとどまった.したがって形質転換効率はDNA濃度が0.06μg/μl以上で漸減した.得られた形質転換体より抽出したプラスミドを制限酵素で処理した後,電気泳動で確認したところ,挿入したプラスミドと全く同一であった.既に単離されているR.albus F-40株のセルラーゼ遺伝子(egI)のを組み込んだベクターを用いて,この条件下でエレクトロポレーションを行なった.効率よく,安定な形質転換体が得られ,ウェスタンブロッティングによりegI遺伝子も発現していることが確認できた.また,大腸菌に対しB.subtilisではEgIの分解がみられなかったことから,B.subtilisの系を用いR.albus cellulase遺伝子をクローニングすることが有効であることが判明した.

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: 所属機関情報訂正内容: Wrong :
1) Applied Microbiology, Faculty of Bioresources
2) Center for Molecular Biology and Genetics

Right :
1) Applied Microbiology, Faculty of Bioresources, Mie University
2) Center for Molecular Biology and Genetics, Mie University

訂正日: 2008/03/10 訂正理由: - 訂正箇所: PDFファイル訂正内容: -

抄録

Ruminococcus albus F-40株から2種類のセルラーゼ遺伝子が大腸菌の系を用いてクローニングされているが,主要なセルラーゼの遺伝子がまだクローニングされていない.そこで,本研究では,R.albusと同じグラム陽性菌であるBaciltus subtilisをホストとし,これにベクターを導入するためにエレクトロポレーションの最適条件を設定した.まず,菌を経時的に採取し,細胞密度が一定になるように緩衝液に懸濁した後に,エレクトロポレーションを行ない形質転換効率および生存率を調べた,この結果,対数後期から定常期にかけて使用した時に高い形質転換効率を得た.次に物理的集件の検討を行なうため,パルス幅と電場強度をそれぞれ変えて形質転換効率を調べたところ,パルス幅を300～500μsec,電場強度を8-12kV/cmに設定した時に高い効率が得られた.プラスミドDNAの濃度と形質転換体数および形質転換効率との関係について調べた結果,形質転換体数はDNA濃度が0.06μg/μlまでは比例的に増加したが,以後漸増するにとどまった.したがって形質転換効率はDNA濃度が0.06μg/μl以上で漸減した.得られた形質転換体より抽出したプラスミドを制限酵素で処理した後,電気泳動で確認したところ,挿入したプラスミドと全く同一であった.既に単離されているR.albus F-40株のセルラーゼ遺伝子(egI)のを組み込んだベクターを用いて,この条件下でエレクトロポレーションを行なった.効率よく,安定な形質転換体が得られ,ウェスタンブロッティングによりegI遺伝子も発現していることが確認できた.また,大腸菌に対しB.subtilisではEgIの分解がみられなかったことから,B.subtilisの系を用いR.albus cellulase遺伝子をクローニングすることが有効であることが判明した.

責任著者(Corresponding author)

訂正情報

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