肺炎球菌莢膜型別判定におけるスライド凝集法とMultiplex PCR法の臨床検査的意義

大野 智子; 山岸 由佳; 山田 敦子; 坂梨 大輔; 宮﨑 成美; 小板 功; 三鴨 廣繁

doi:10.14932/jamt.17-113

Abstract

肺炎球菌の莢膜型を判定する検査法として簡便なスライド凝集法とワクチン型別判定まで可能なMultiplex PCR法がある。今回2008年12月から2016年9月の間に愛知医科大学病院の侵襲性肺炎球菌感染症（invasive pneumococcal disease; IPD）患者から分離された肺炎球菌59株を対象にスライド凝集法とMultiplex PCR法を用いた検討を行った。スライド凝集法を用いて莢膜型を決定した後，Multiplex PCR法を用いて型別することにより，Multiplex PCR法の労力の削減および手技の簡易化が可能であった。抗原因子6dが含有されていないスライド凝集法で非凝集であった場合にMultiplex PCR法で6A/6B/6C/6D型にバンドが認められた場合は，6C型と推定することが可能であった。Multiplex PCR法で分類不能な非ワクチン型である6C型をスライド凝集法とMultiplex PCR法を併用することで推定することが可能であり，今後のワクチン効果の評価や莢膜型の疫学集積に有用である可能性が示唆された。

I　はじめに

肺炎球菌は通性嫌気性グラム陽性双球菌で，急性中耳炎，肺炎，急性気管支炎，敗血症，髄膜炎など様々な侵襲性感染症を引き起こす。肺炎球菌の病原因子には，付着因子であるPneumococcal surface protein A（PspA）¹⁾，Pneumococcal surface protein C（PspC），莢膜，免疫刺激物質などがあるが，その中で最も重要な病原因子が莢膜である^2)～4)。

肺炎球菌は，細胞壁の外側に多糖体からなる莢膜を持ち，この莢膜多糖体の抗原性により現在93種の血清型が確認されている³⁾。日本では2013年11月に乳児を対象に13価肺炎球菌結合型ワクチン（pneumococcal conjugate vaccine; PCV13）が，2014年10月には高齢者を対象に23価肺炎球菌莢膜ポリサッカライドワクチン（pneumococcal polysaccharide vaccine; PPSV23）が定期接種化されているが，血清型を分類することはワクチン効果判定，血清型別の変遷，流行株の調査など肺炎球菌の疫学調査に重要である⁵⁾。

肺炎球菌の血清型別には，従来抗血清を用いた莢膜膨化反応法が用いられてきたが⁶⁾，操作が煩雑で時間を要すること，判定には熟練を要する⁵⁾こと，型別用血清が国内製品ではなく入手に時間がかかる点が問題であり，2000年に国内で市販されたスライド凝集反応法が簡便であり多用されている。また，近年multiplex PCR法を用いた肺炎球菌血清型別は，莢膜膨化法の型別と一致し血清型別のスクリーニング法として有用な方法との報告がなされている⁷⁾。そこで今回当院の侵襲性肺炎球菌感染症（invasive pneumococcal disease; IPD）患者から分離された肺炎球菌を対象とし，スライド凝集法とmultiplex PCR 法による血清型別の比較検討を行ったので報告する。

II　対象および方法

1．対象菌株

2008年12月から2016年9月までの間に愛知医科大学病院のIPD患者から分離された肺炎球菌59株を対象とした。−80℃凍結保存菌株をヒツジ血液寒天培地に塗布後，炭酸ガス培養で一晩培養し，オプトヒンテストおよび胆汁溶解試験で肺炎球菌と再同定した。Multiplex PCR法では，莢膜多糖体産生遺伝子としてcpsA（160 bp）を陽性コントロールとして加えバンドを確認したものを対象とした。59株の由来検体は，血液54株，髄液2株，胸水2株，関節液1株である。

2．ムコイド型と非ムコイド型の判定

羊血液寒天培地M58（栄研化学株式会社，東京）を使用し，35℃5%炭酸ガス培養条件下で18時間培養したコロニーにおいて，中心窩を伴う円形のコロニーを形成する株を非ムコイド型とし，中心窩を認めず粘性の2 mm以上のコロニーを形成する株をムコイド型と定義した。

3．スライド凝集法による莢膜型別

（1）肺炎球菌莢膜型別免疫血清｢生研｣（デンカ生研株式会社，東京）を添付文書に従い実施した。5分画のスライドグラスに各混合血清と生理食塩水1滴を滴加し，ヒツジ血液寒天培地に発育した肺炎球菌を白金耳で掻き取り回転装置にて1分間混和し凝集の有無を判定した。

（2）混合血清で凝集ありと判定された場合，その混合血清を構成する単味血清と生理食塩水1滴を滴加し，ヒツジ血液寒天培地に発育した肺炎球菌を白金耳で掻き取り，回転装置にて1分間混和し凝集の有無を判定し，凝集した単味血清型をスライド凝集法の血清型別結果として判定した。判定法は添付文書の指示に従った。スライド凝集法と含有されている抗原因子をTable 1に示す。

Table 1 Objective strains by slide agglutination test and multiplex PCR method

Slide Agglutination		Multiplex PCR
Serotype	Contained antigen factor	Multiplex PCR
1		1
2		2
3		3
4		4
5		5
6	6b	6A/6B・6C/6D
	6c
7	7b	7F/7A・7C/7B
	7c
	7e
	7f
8		8
9	9b	9V/9A・9N/9L
	9g
	9d
	9e
	9f
10	10b	10A・10F/10C
	10d
	10f
	10c
11	11b	11A/11D
	11c
	11f
	11g
12	12b	12F/12A
	12c
	12e
		13
14		14
15	15c	15A/15F・15B/15C
	15b
	15e
	15f
	15g
16		16F
17		17F
18	18c	18C/18F/18B/18A
	18d
	18e
	18f
19	7h	19F・19A
	19c
	19b
	19d
	19e
	19f
20		20
21		21
22	22b	22F/22A
	22c
23	23c	23F・23A
	23b
	23d
24	24d	24F/24A/24B
	24e
	24b
	24c
25	25b	25F/25A
	25c
27
28	28b
	28c
29
31		31
32	32a
	32b
33	6a	33C・33F/33A
	20b
	33b
	33e
	33f
34		34
35	20b	35F・35A/35C・35B
	29b
	35a
	35b
	42a
36
		37
38		38
39		39
40		40
41
		42

		44

46		46
47		47F
39 types		47 types

4． Multiplex PCR法による莢膜型別

1）肺炎球菌のDNA抽出

ヒツジ血液寒天培地で一晩培養した肺炎球菌をTES Bufferに溶解し煮沸法にてDNAを抽出した。

2） PCR反応

Platinum Multiplex PCR Master Mix（ABI）を用いて9つのMultiplex PCR反応（反応1：血清型6A/B/C/D，3，19A，22F/A，16F，反応2：血清型8，33F/33A/37，15A/F，7F/A，23A，反応3：血清型19F，12F/12A/44/46，11A/D，38/25F/25A，35B，反応4：血清型24F/24A/24B，7C/7B/40，4，18C/18F/18B/18A，9V/9A，反応5：血清型14，1，23F，15B/15C，10A，反応6：血清型39，10F/10C/33C，5，35F/47F，17F，反応7：血清型23B，35A/35C/42，34，9N/9L，31，反応8：血清型21，2，20，13，反応9：6A/6B/6C/6D，6C/6D）を実施した。PCRの条件は95℃で15分加熱した後，94℃30秒，54℃90秒，72℃60秒のサイクルを35回繰り返し，72℃で10分間加熱した後4℃とした。また全ての反応系に‍は莢膜多糖体産生遺伝子としてcpsA（160 bp）を陽性コントロールとして加えた。各PCRの組成はTable 2に示す。各反応液と血清型特異primerの配列は米国CDCのUSA set⁸⁾を参照した。

Table 2 Multiplex PCR conditions for determining Streptococcus pneumoniae serotypes

Multiplex reaction 1	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
6A/6B/6C/6D-f	0.3	250
6A/6B/6C/6D-r	0.3
3-f	0.3	371
3-r	0.3
19A-f	0.3	566
19A-r	0.3
22F/22A-f	0.5	643
22F/22A-r	0.5
16F-f	0.4	717
16F-r	0.4
DW	3.7
total	25

Multiplex reaction 2	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
8-f	0.2	201
8-r	0.2
33F/33A/37-f	0.3	338
33F/33A/37-r	0.3
15A/15F-f	0.3	434
15A/15F-r	0.3
7F/7A-f	0.4	599
7F/7A-r	0.4
23A-f	0.5	722
23A-r	0.5
DW	3.9
total	25

Multiplex reaction 3	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
19F-f	0.5	304
19F-r	0.5
12F/12A/44/46-f	0.5	376
12F/12A/44/46-r	0.5
11A/11D-f	0.3	463
11A/11D-r	0.3
38/25F/25A-f	0.3	574
38/25F/25A-r	0.3
35B-f	0.5	677
35B-r	0.5
DW	3.1
total	25

Multiplex reaction 4	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
24F/24A/24B-f	0.2	99
24F/24A/24B-r	0.2
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
7C/7B/40-f	0.3	260
7C/7B/40-r	0.3
4-f	0.3	430
4-r	0.3
18C/18F/18B/18A-f	0.3	573
18C/18F/18B/18A-r	0.3
9V/9A-f	0.5	816
9V/9A-r	0.5
DW	4.1
total	25

Multiplex reaction 5	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
14-f	0.3	189
14-r	0.3
1-f	0.3	280
1-r	0.3
23F-f	0.5	384
23F-r	0.5
15B/15C-f	0.3	496
15B/15C-r	0.3
10A-f	0.5	628
10A-r	0.5
DW	3.5
total	25

Multiplex reaction 6	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
39-F	0.2	98
39-R	0.2
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
10F/10C/33C-f	0.3	248
10F/10C/33C-r	0.3
5-f	0.3	362
5-r	0.3
35F/47F-f	0.3	517
35F/47F-r	0.3
17F-f	0.5	693
17F-r	0.5
DW	4.1
total	25

Multiplex reaction 7	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
23B-f	0.2	199
23B-r	0.2
35A/35C/42-f	0.3	280
35A/35C/42-r	0.3
34-f	0.3	408
34-r	0.3
9N/9L-f	0.5	516
9N/9L-r	0.5
31-f	0.5	701
31-r	0.5
DW	3.7
total	25

Multiplex reaction 8	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
21-f	0.2	192
21-r	0.2
2-f	0.3	290
2-r	0.3
20-f	0.3	514
20-r	0.3
13-f	0.4	655
13-r	0.4
DW	4.9
total	25

Multiplex reaction 6C	Volume (μL)	PCR product size (bp)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (ABI)	12.5
DNA	5
cpsA-f	0.1	160
cpsA-r	0.1
6A/6B/6C/6D-f	0.3	250
6A/6B/6C/6D-r	0.3
6C/6D-f	0.5	727
6C/6D-r	0.5
DW	5.7
total	25

3）電気泳動

PCR産物5 μLにloading bufferを添加し，0.5 × TBE bufferで作成した2% Nusieve 3:1 Agarose gel（タカラバイオ株式会社，滋賀）で100 V，30分電気泳動を実施した。泳動後0.5 μg/mLのEtBr溶液で30分染色し，その後ゲル撮影装置でDNAバンドの有無を確認し，陽性になった増幅産物のサイズに応じて血清型を判定し，Multiplex PCR法による血清型別の結果を確定した。スライド凝集法の血清型に相当するMultiplex PCR法で同定可能な血清型の一覧をTable 1に示す。

4）スライド凝集法とMultiplex PCR法の組み合わせによる莢膜型別

スライド凝集法では血清型39種類（抗原因子として63種類含有），Multiplex PCR法で47種類に分類が可能である（Table 1）。本研究では先にスライド凝集法を実施し同定された血清型に基づき，その血清型に相当するPCR反応系を実施し，DNAバンドが得られた型を最終血清型とした。具体的には①スライド凝集法を実施，②スライド凝集法で示された型について，PCR法でその型が含まれる反応系を実施，③その結果，DNAバンドが得られた場合には，その結果を最終決定，④DNAバンドが得られなかった場合には，最終的に9つのMultiplex PCR反応を実施することにより血清型を確定した。

Multiplex PCR法の反応1で血清型6A/6B/6C/6Dの位置にバンドが出現した場合には，更に血清型6A/6B，6C/6Dが含まれるMultiplex PCR法の反応9を実施し6A/6B，6C/6Dの血清型を確定した。

III　結果

スライド凝集法では，供試菌株59株は16種類の血清型に型別され，主な血清型は19型18.6%（11株），型別不能18.6%（11株），6型10.2%（6株），23型10.2%（6株）の順であった（Table 3）。Multiplex PCR法では，19種類の血清型に分類され，主な血清型は6C/6D型9株，3型8株，19A型7株，6A/6B型5株の順であった（Table 3）。

Table 3 Serotypes determined by slide agglutination test and multiplex PCR method

Strain Number	Age	Sex	Specimes	Colony morphology	Results of serotype		Finally determined serotype	Match or mismatch by slide agglutination and miltiplex PCR
Strain Number	Age	Sex	Specimes	Colony morphology	Slide Agglutination	Multiplex PCR	Finally determined serotype	Match or mismatch by slide agglutination and miltiplex PCR
2197	88	F	Blood	Mucoid	3	3	3	Match
14-8382	38	F	Blood	Mucoid	3	3	3	Match
15-1344	76	M	Blood	Mucoid	3	3	3	Match
15-1426	72	F	Blood	Mucoid	3	3	3	Match
242	66	M	Preulal effusion	Mucoid	3	3	3	Match
14-1538	79	M	Blood	Mucoid	3	3	3	Match
15-0920	80	M	Blood	Mucoid	NT	3	3	Mismatch
5675	98	M	Blood	Mucoid	NT	3	3	Mismatch
590	11M	F	Blood	Non-mucoid	4	4	4	Match
43	1	M	Blood	Non-mucoid	4	4	4	Match
199	1	M	Blood	Non-mucoid	6	6A/6B	6A/6B	Match
1699	3	M	Blood	Mucoid	6	6A/6B	6A/6B	Match
425	35	M	Blood	Non-mucoid	6	6A/6B	6A/6B	Match
677	1	F	Blood	Mucoid	6	6A/6B	6A/6B	Match
1923	9M	F	Blood	Non-mucoid	6	6A/6B	6A/6B	Match
15-8210	69	F	Blood	Mucoid	6C	6C/6D	6C/6D	Match
4175	60	F	Blood	Mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
9928	61	M	Blood	Non-mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
4170	60	F	Blood	Non-mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
10900	71	F	Cerebral fluid	Non-mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
10893	71	F	Blood	Mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
8708	3	F	Blood	Mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
15-0387	89	F	Blood	Non-mucoid (micro colony)	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
15-0727	72	M	Blood	Mucoid	NT	6C/6D	6C/6D	Mismatch
14-6218	30	F	Blood	Mucoid	7	7F/7A	7F/7A	Match
14-7685	5	F	Blood	Mucoid	7	7F/7A	7F/7A	Match
1881	9M	F	Blood	Mucoid	10	10A	10A	Match
15-1199	66	F	Blood	Non-mucoid	11	11A/11D	11A/11D	Match
1143	60	M	Blood	Mucoid	12	12F	12F	Match
657	57	F	Blood	Non-mucoid	14	14	14	Match
3010	11M	M	Blood	Mucoid	14	14	14	Match
348	1	F	Blood	Non-mucoid	14	14	14	Match
5809	64	M	Blood	Mucoid	15	15B/15C	15B/15C	Match
15-8567	41	M	Blood	Non-mucoid	15	15A/15F	15A/15F	Match
854	89	M	Blood	Mucoid	19	19F	19F	Match
880	89	M	Cerebral fluid	Non-mucoid	19	19F	19F	Match
5526	84	F	Blood	Mucoid	19	19F	19F	Match
7869	47	M	Preulal effusion	Mucoid	19	19F	19F	Match
3844	66	M	Blood	Mucoid	19	19A	19A	Match
9844	72	M	Blood	Non-mucoid	19	19A	19A	Match
15-8257	69	F	Blood	Mucoid	19	19A	19A	Match
15-9001	4	F	Blood	Mucoid	19	19A	19A	Match
16-2265	74	M	Blood	Mucoid	19	19A	19A	Match
15-8257	68	F	Blood	Non-mucoid	19	19A	19A	Match
5877	64	F	Synovial fluid	Mucoid	19	19A	19A	Match
485	78	F	Blood	Mucoid	22	22F/22A	22F/22A	Match
15-8314	80	F	Blood	Non-mucoid	22	22F/22A	22F/22A	Match
489	3	M	Blood	Mucoid	23	23F	23F	Match
5854	1	M	Blood	Non-mucoid	23	23F	23F	Match
2908	1	F	Blood	Non-mucoid	23	23A	23A	Match
13-4506	63	F	Blood	Non-mucoid	23	23A	23A	Match
13-0777	70	M	Blood	Non-mucoid	23	23A	23A	Match
16-6447	85	F	Blood	Non-mucoid (micro colony)	23	23A	23A	Match
14-1211	69	M	Blood	Non-mucoid	24	24F/24A/24B	24F/24A/24B	Match
13-3802	2	M	Blood	Non-mucoid (micro colony)	24	24F/24A/24B	24F/24A/24B	Match
14-1010	2	M	Blood	Non-mucoid	24	24F/24A/24B	24F/24A/24B	Match
1094	72	M	Blood	Mucoid	35	35B	35B	Match
14-8296	62	M	Blood	Mucoid	35	35B	35B	Match
15-0411	71	M	Blood	Non-mucoid	NT	—	NT	Match

スライド凝集法とMultiplex PCR法の一致率は83.1%（49/59）であった（Table 3）。不一致であった血清型は6型 57.1%（8/14）が最多で，次いで3型25%（2/8）の順であった。（Table 3）。スライド凝集法で型別不能株と判定した11株の内訳はMultiplex PCR法で3型18.1%（2/11），6C/6D型が72.7%（8/11）であった。また，Multiplex PCR法でバンドが認められない株が1株あった。

ムコイド型は55.9%（33株）認め，3型8株，19型8株，6型7株の順に多かった（Table 3）。Multiplex PCR法とスライド凝集法の一致率は3型75%，19型100%，6型42.9%であった。3型で不一致株は，スライド凝集法では凝集を認めない型別不能株2株であった。非ムコイド型26株で有意な型と一致率は，6型42.9%（3/7），23型100%（5/5），19型100%（3/3），24型100%（3/3）であった（Table 3）。

6型についてMultiplex PCR法で6A/6B型と分類された株のMultiplex PCR法とスライド凝集法の一致率は100%（5/5）であったが，6C/6D型は，一致率11.1%（1/9）で，不一致の8株は型別不能株であった（Table 4）。

Table 4 Comparison for serotypes determination between slide agglutination test and multiplex PCR method

Serotypes determined by Multiplex PCR	n	Slide Agglutination			Match rate (%)
Serotypes determined by Multiplex PCR	n	same serotype	Impossibility of typing	Other serotype	Match rate (%)
3	8	6	2		75
4	2	2			100
6A/6B	5	5			100
6C/6D	9	1	8		11.1
7F/7A	2	2			100
10A	1	1			100
11A/11D	1	1			100
12F	1	1			100
14	3	3			100
15F/15A	1	1			100
15B/15C	1	1			100
19F	4	4			100
19A	7	7			100
22F/22A	2	2			100
23F	2	2			100
23A	4	4			100
4F/24A/24B	3	3			100
35B	2	2			100
Impossibility of typing	1	1			100
Total	59	49	10	0

IV　考察

IPDは死亡率が高く，特に市中感染において極めて重要な細菌の1つである。日本では侵襲性肺炎球菌感染症の予防として，高齢者および60歳以上の基礎疾患を有する場合は23価肺炎球菌莢膜ポリサッカライドワクチン（PPSV23）を，小児に対しては13価肺炎球菌結合型ワクチン（PCV13）が承認され接種可能となっている⁴⁾。肺炎球菌の血清型を調査することで，ワクチン含有血清型，IPDの原因血清型を把握可能となり，ワクチン効果判定，血清型別の変遷，流行株の調査などに有益である⁹⁾。莢膜型別分類法のゴールドスタンダード法である莢膜膨化試験では93種に型別可能である²⁾。また近年莢膜膨化法と血清型別結果が矛盾なく，血清型別のスクリーニング法として有用であるMultiplex PCR法では47種に型別分類することが可能である⁸⁾。また生菌を用い簡便に検査できるスライド凝集法では39種に型別分類することが可能である（Table 1）。簡便に実施可能であるスライド凝集法は一部で反応に乏しく明瞭に凝集しないものが存在した。肺炎球菌の3型は露滴状のムコイド型になることが知られており^2),10)，市中肺炎の重症化予測因子の一つと考えられている¹¹⁾。経験上ムコイド型の肺炎球菌の莢膜型別の際，型別不能株になる場合があり，また莢膜形成が少ないと凝集が弱くなると推測される（デンカ生研社内情報）のため，莢膜形成状態を動物の体液などが含まれている液体培地などで前培養した後，血清型別を実施するなどの工夫を行うことで回復することがあるという。肺炎球菌の病原因子である莢膜多糖体は，菌体表面のペプチドグリカン層と共有結合しているが，3型の肺炎球菌では莢膜多糖体が細胞壁に結合せず遊離しているとされている¹²⁾。莢膜多糖体が細胞壁から遊離しても，菌体の表面にはなお，莢膜多糖体が存在するため，スライド凝集法で凝集すると考えられるが，血清上で菌が溶解しづらいため反応が弱く判定できなかった可能性がある。

3型以外の非ムコイド型肺炎球菌は，培地上でムコイド状を形成するのは，遊離状態の莢膜多糖体の割合が増加していることによると報告されている¹³⁾。3型以外の露滴状のムコイドコロニー形成の発現形式は，今回の研究において3型の露滴状のムコイドコロニー形成の大きさと比べ小さいように思われた。

ムコイド型の肺炎球菌では細胞壁成分に対する抗体や補体C3bが直接菌体に結合できない¹¹⁾ため，ワクチン株であるにもかかわらず3型はワクチン効果が低いのも理由の一つと考えられる。ムコイド型肺炎球菌肺炎では，莢膜産生量が多い傾向があり¹⁴⁾肺炎の死亡率も高く重症化しやすいとの報告¹⁴⁾がある。3型を型別することは，重症度の判定およびワクチン株であることから重要であると思われる。3型およびムコイドを形成する肺炎球菌の一部において，Multiplex PCR法を実施することで血清型を判別できたため，コロニー性状から3型では特に型別を推測することが可能であると思われること，検出頻度の高い型別からMultiplex PCR法を実施することは手技の簡素化に有用であった。

スライド凝集法の6型の抗原因子は6b（6A型），6c（6B型）の含有であり，6C型を構成する抗原因子6dは含有されていない。そのためスライド凝集法では6C型は非凝集となると考えられた。一方，6D型を構成する抗原因子は6c/6dであり，スライド凝集法の抗原因子に6cが含まれていることから6D型はスライド凝集法で凝集する。このことから，スライド凝集法の型別不能株中には6C型が含まれてしまうため，Multiplex PCR法にて6型と推定され，スライド凝集法にて判定型別不能株であった5株は6C 型であると考えられた。更にスライド凝集法で6型に凝集し，Multiplex PCR法で6C/6D型と推定された株はスライド凝集法の抗原因子に6c（6D型）が含有されていることから6D型と推定可能であり，Multiplex PCR法にて6C/6D型と判定されスライド凝集法で6型に凝集した1株は6D型と考えられた。以上よりMultiplex PCR法の反応系1で6A/6B/6C/6D型と判定された株に対し，Multiplex PCR法の6A/6B/・6C/6D型を確定する反応系9を実施せず，スライド凝集法の結果で型別不能株となるものは6C型と推定することが可能であった。さらに，Multiplex PCR法の反応系9で6C/6D型と判定された場合は，スライド凝集法とMultiplex PCR法の反応系1を組み合わせることで，Multiplex PCR法の反応系1で分類できない6C/6D型を識別することが可能であった。6C型は非ワクチン株であることから，ワクチン接種効果を判定する上で分類できることは極めて有用なことだと考えられる。Multiplex PCR法とスライド凝集法に反応しない株は，型別不能株と考えられる。Multiplex PCR法においてプライマーの対象に含まれていない型別で，スライド凝集法において抗原因子の対象に含まれていない型別だと考えられる。スライド凝集法を判定する際は，凝集が明瞭なものを判定することが必要であった。しかしスライド凝集法で判断に難渋した場合，あるいは細かな型別を把握するためには，Multiplex PCR法を利用することは簡便で正確な結果を得られるため有用である。スライド凝集法実施後Multiplex PCR法の標的反応系を実施することは，手技の簡易化につながるため，それぞれの施設の内情，あるいは流行している型別のMultiplex PCR法から実施することができると考えられた。

謝辞

型別不能株について精査していただきましたデンカ生研株式会社に感謝いたします。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

1) Briles DE et al.: “Pneumococcal diversity: Considerations for new vaccine strategies with emphasis on pneumococcal surface protein A(PspA),” Clin Microbiol Rev, 1998; 11: 645–657.
2) 千葉菜穂子：「グラム陽性球菌，肺炎球菌Streptococcus pneumoniae」，臨床検査増刊号，2014; 158: 1257–1259.
3) 生方公子：厚生労働科学研究費補助金（新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究事業）．重症型の連鎖球菌・肺炎球菌感染症に対するサーベイランスの構築と病院解析，その診断・治療に関する研究，2011.
4) 西順一郎：「侵襲性肺炎球菌感染症とワクチンによる予防」，モダンメディア，2013; 59: 273–283.
5) 細谷美佳子，他：「新潟県内の侵襲性肺炎球菌感染症患者から分離された肺炎球菌の血清型について」，平成26年度　新潟県保健環境科学研究所年報，2015; 30: 62–66.
6) 中山浩次：「レンサ球菌」，戸田新細菌学改訂32版，480–492，吉田眞一，柳雄介（編），南山堂，東京，2002.
7) 永井佑樹：「三重県におけるMultiplex PCRを用いた肺炎球菌野血清型別法」，三重保環研年報，2014; 59: 42–48.
8) Centers for Disease Control and Prevention: PCR Deduction of Pneumococcal Serotypes. https://www.cdc.gov/streplab/pcr.html (Accessed April 3, 2017)
9) Okade H et al.: “Impact of the pneumococcal conjugate vaccine on serotype distribution and susceptibility trends of pediatric non-invasive Streptococcus pneumoniae isolates in Tokai, Japan over a 5-year period,” J Infect Chemother, 2014; 20: 423–428.
10) Wood WB Jr et al.: “The inhibition of surface phagocytosis by the capsular slime layer of pneumococcus type III,” J Exp Med, 1949; 90: 85–96.
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12) Sørensen UB et al.: “Covanlent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods,” Microb Pathog, 1990; 8: 325–334.
13) Byrne JP et al.: “Identfication of Streptococcus pneumonia Cps2C residues that affect capsular polysaccharide polymerization, cell wall ligation, and Cps2D phosphorylation,” J Bacterial, 2011; 193: 2341–2346.
14) Weinberger DM et al.: “Association of serotype with risk of death due to pneumococcal pneumonia: A meta-analysis,” Clin Infect Dis, 2010; 51: 692–699.

責任著者(Corresponding author)

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