オーセレックスブラシ^RTを用いた液状化検体細胞診による口腔内擦過細胞診の検討―当施設における標準化に向けた取り組みと経験―

Abstract

目的：口腔内擦過細胞診の細胞採取と検体処理の標準化および標本の品質向上をこころみた。オーセレックスブラシ^RTを用いて病巣部を擦過し，CytoRich^TM REDを用いた非婦人科用LBC標本作製法であるBDサイトリッチ^TM（CytoRich: CR^TM）法（日本BD）にてその有用性を検討した。方法：2014年3月～2016年3月までの口腔内擦過細胞診を対象とした。オーセレックスブラシ^RTを用いて患部で5回転させて検体を採取し，先端を専用のBDシュアパス^TMバイアルに回収した。標本作製は非婦人科用のCR^TM法で行い，全例とも2枚の標本を作製し，パパニコロウ（Papanicolaou）染色とPAS反応を行った。判定は細胞診ガイドライン5消化器2015年度版に準拠し6段階で評価した。PAS反応では真菌の有無を評価した。成績：CR法の検体適正率は99.5%（192/193検体）であった。検体適正192検体の内訳は，NILM：146検体（75.6%），OLSIL：22検体（11.4%），OHSIL：5検体（2.6%），SCC：10検体（5.2%），IFN：9検体（4.7%）であった。検体不適正は0.5%（1/193検体）で，その要因は細胞数過少であった。PAS反応は21.8%（42/193）で陽性を示す真菌を確認した。結論：オーセレックスブラシ^RTとCR^TM法の併用により，採取細胞量と回収率が向上し，口腔内擦過細胞診の普及と細胞診判定の向上に寄与すると考えられた。

Translated Abstract

Objective: The objective of this study is to standardize cell sampling and specimen processing and to improve the quality of cytologic preparations for oral brushing cytodiagnosis. Cellular specimens collected from an oral lesion by brushing with the Orcellex Brush^RT were processed using the BD CytoRich^TM (CR^TM) system (Becton, Dickinson and Company) with CytoRich^TM RED, a liquid-based cytology system for nongynecological use, to validate the applicability of the combined use of these systems. Methods: Oral brushing cytologic diagnoses made from March 2014 to March 2016 were reviewed. A specimen from each lesion was collected with five rotations of the shaft of the Orcellex Brush^RT, and the tip of the device was placed in a dedicated BD SurePath^TM collection vial. The cell specimen collected from each patient was processed using the CR^TM system for nongynecological use to obtain duplicate preparations, followed by Papanicolaou staining and PAS staining. The prepared slides were examined and scored on a six-grade scale in accordance with the Guidelines for Cytopathological Diagnosis 5 of the Japanese Society of Clinical Cytology (Digestive Organs 2015 edition). Presence/absence of fungal involvement was assessed on the basis of the PAS reaction of the specimens. Results: The specimen adequacy rate in the analysis using the CR^TM system was 99.5% (192/193 specimens). Of the 192 specimens assessed as being adequate, the cytodiagnoses were NILM in 146 specimens (75.6%), OLSIL in 22 specimens (11.4%), OHSIL in 5 specimens (2.6%), SCC in 10 specimens (5.2%), and IFN in 9 specimens (4.7%). One specimen (1/193, 0.5%) was judged as being inadequate, which was considered to be attributable to an excessively low cell yield. As for the PAS reaction, fungal involvement was evident in 21.8% of the specimens (42/193). Conclusion: The combined use of the Orcellex Brush^RT and CR^TM systems increased the quantity of cells collected and the cell yield, which may be expected to contribute to the spread of oral brushing cytology and improved cytodiagnostic assessment.

I　 はじめに

口腔内擦過細胞診は，病巣部を直接観察しながら細胞採取が可能であり，粘膜病変の質的評価として簡便に実施できる利点がある。しかし，口腔粘膜は角化を示していることに加え漿液性の唾液が含まれるため，細胞が固定液中で剥離し，標本上に塗抹される細胞量が乏しいといった欠点がある^1),2)。そのため，細胞数過少，乾燥，細胞崩壊とったアーチファクトが生じ，判定が困難となることが多いと報告されている^1)～4)。

細胞採取量を増やすことを目的に，子宮頸部擦過細胞診で用いられるサイトブラシや歯間ブラシなど様々な採取器具による検討が報告されている⁴⁾。近年，口腔内細胞採取専用のオーセレックスブラシ^RT（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：日本BD）の有用性が報告されている³⁾。オーセレックスブラシ^RT先端は，ポリエチレン製で全周が細かいブラシ状になっており，粘膜を擦過しやすい形状となっている。しかし，採取器具の改良により検体が十分に採取可能であっても，直接塗抹法では細胞数過少や様々なアーチファクトを排除することは難しく¹⁾，口腔領域における液状化検体細胞診（liquid based cytology; LBC）による標本作製の有用性が報告されている^1)～7)。

LBCは子宮頸部細胞診で用いられるフィルター転写法が原理のシンプレップ^®法（ホロジックジャパン株式会社）と，密度勾配処理後の遠心沈降法を原理とするBDシュアパス^TM法（日本BD）に大別され，それぞれ標本作製法が異なる。それに対して，CytoRich^TM REDを用いた非婦人科用LBC標本作製法であるBDサイトリッチ^TM（CytoRich^TM: CR^TM）法（日本BD）は，密度勾配法を用いない用手法による非婦人科用LBC標本作製法である。穿刺や擦過で採取した検体を保存液中に回収することにより，細胞の損失が改善でき，様々な領域でその有用性が報告されている^8)～13)。オーセレックスブラシ^RTとCR^TM法を用い口腔内擦過細胞診における検体不適正率および診断成績を検討した報告は，PubMed，国内論文を検索しうる限りではみられない。

今回，われわれは採取器具にオーセレックスブラシ^RTを用い，CR^TM法による口腔内擦過細胞診における検体不適正の減少と標本作製の標準化を試みた。

II　 方法

1． 対象

2014年3月～2016年3月の24ヵ月間に東京慈恵会医科大学附属病院耳鼻咽喉科および歯科にて採取した口腔内擦過細胞診193検体を対象とした。193検体の平均年齢は60歳（20～93歳）で，男性122人，女性71人であった。検体採取は臨床医がオーセレックスブラシ^RT（Figure 1）を患部に押し当て5回転させて採取した。検体採取後，ブラシ先端を外し専用のBDシュアパス^TMバイアル（日本BD）に回収し病理検査室に搬送した。本研究は慈恵医大倫理委員会の承認を得た［31-264（9763）］。

Figure 1 Orcellex-brush^RT

A: The Orcellex-brush^RT is 185 mm long. B: The tip of the brush made of polyethylene and is flexible and easy to scratch the mucosal membrane.

2． 標本作製法

採取した細胞の回収率を高めるため，最初にボルテックスミキサーでボトルを攪拌しブラシに付着している細胞成分を剥離させた。次に検体全量をスピッツに移し3,000回転／2分間遠心した。その後上清をデカントし，スポイトを用い沈渣物を均一に混和後，あらかじめ300～500 μLの精製水が入った別のスピッツに1滴加え水溶液とした。この水溶液を専用のBD^TMシュアパスプレコートスライド（日本BD）にセットした内径13 mmのBD^TMセットリングチャンバー（日本BD）内に滴下し10分間静置し塗抹した。CR^TM標本は全例とも各2枚作製しパパニコロウ（Papanicolaou）染色とPAS反応を行った。Papanicolaou染色はティッシュー・テックプリズマ（サクラ精機株式会社）を使用し，PAS反応は通常の染色手順で用手法にて実施した。

3． 細胞診評価法

細胞診の評価は，細胞診ガイドライン5消化器2015年版の判定区分に準拠し¹⁴⁾，正常および反応性あるいは上皮内病変や悪性腫瘍性変化がない（negative for intraepithelial lesion or malignancy; NILM），低異型度上皮内腫瘍性病変（low-grade squamous intraepithelial lesion; LSIL），高異型度上皮内腫瘍性病変（high-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL），扁平上皮癌（squamous cell carcinoma; SCC），鑑別困難（indefinite of neoplasia; IFN），検体不適正の6段階で評価を行った。LSILとHSILは，婦人科と概念を若干異にすることから口腔（oral; O）を附することが推奨されており¹⁴⁾，OLSILとOHSILとした。PAS反応で赤色調の仮性菌糸や酵母様真菌の有無も評価した。

生検組織診断は，口腔癌取扱い規約第1版をもとに診断した¹⁵⁾。

III　 結果

193検体のCR^TM法の内訳は，NILM：146検体（75.6%），OLSIL：22検体（11.4%），OHSIL：5検体（2.6%），IFN：9検体（4.7%），SCC：10検体（5.2%），検体不適正：1検体（0.5%）であった（Table 1）。生検は16%（31/193検体）に施行され，その結果をTable 2に示した。生検でSCCと診断された9例（舌：5例，歯肉部：3例，口蓋：1例）中4例のCR^TM法はSCCの評価であった。他の5例はNILMが2例（舌と歯肉部），OLSILが1例（舌），OHSILが1例（歯肉部），IFNが1例（舌）であった。再検討後もそれぞれの判定は同様であった。CR^TM法でOLSIL及びOHSILと判定し生検でSCCであった2例の組織像をFigure 2に示した。双方とも深部まで採取された組織片で，角化を示し，浸潤部では小型の深層型腫瘍細胞の増生がみられた。CR^TM法でOLSILであった症例では（Figure 2A, B），細胞異型の強い腫瘍細胞の浸潤性増殖がみられるが（Figure 2A），腫瘍表層部では細胞異型の乏しい角化細胞であった（Figure 2B）。一方，OHSILと判定した症例も同様であり（Figure 2C），表層の細胞異型が乏しい角化細胞の一部に，小型の腫瘍細胞の増殖がみられた（Figure 2D）。口腔上皮内腫瘍（oral intraepithelial neoplasia; OIN）であった8例中1例はNILMであったが，再鏡検においても明らかな異型細胞は観察されなかった。

Table 1  Distributions of cytology categories of oral cavity confirmed by liquid based cytology

	Cytological classification						Total
	NILM	OLSIL	OHSIL	IFN	SCC	Inadequate
Tongue	80	14	3	6	4	1	108
Gingival	31	5	2	1	3	0	42
Buccal mucosa	19	2	0	1	0	0	22
Palate	6	0	0	1	1	0	8
Floor of mouth	8	1	0	0	2	0	11
Lower lip	2	0	0	0	0	0	2
Total	146	22	5	9	10	1	193

Correlation: IFN, indefinite of neoplasia; NILM, negative for intraepithelial lesion or malignancy; OHSIL, oral high-grade squamous intraepithelial lesion; OLSIL, oral low-grade squamous intraepithelial lesion; SCC, squamous cell carcinoma.

Table 2  Comparison of the diagnostic accuracy obtained using BD CytoRich^TM for specimen preparation by reference to the results of oral biopsy

Cytological classification	Histologic diagnosis					Total
	Benign	Atypical squamous epithelium	Squamous papilloma	Oral intraepithelial neoplasia	SCC
NILM	4	1	3	1	2	11
OLSIL	2	2	0	4	1	9
OHSIL	0	1	0	1	1	3
IFN	0	0	0	1	1	2
SCC	1	0	0	1	4	6
Inadequate	0	0	0	0	0	0
Total	7	4	3	8	9	31

Correlation: IFN, indefinite of neoplasia; NILM, negative for intraepithelial lesion or malignancy; OHSIL, oral high-grade squamous intraepithelial lesion; OLSIL, oral low-grade squamous intraepithelial lesion; SCC, squamous cell carcinoma.

Figure 2 Biopsy revealed squamous cell carcinoma of the oral cavity

A: Malignant cells polymorphism deep in the infiltrating area (Hematoxylin-Eosin; HE stain, ×4). B: In the tumor mucosa, it is a keratotic cells with poor atypia (HE stain, ×40). CytoRich (CR)^TM specimen with OLSIL. C: The deep part, cell atypia is shown (HE stain, ×4). D: In the tumor mucosa, keratotic cells with few cell atypia are seen, and parabasal type of small tumor cells are mixed (HE stain, ×40). CR^TM specimen with OHSIL.

検体適正であった99.5%（192/193検体）は，採取した細胞が13 mm円内に集約され肉眼的に塗抹範囲が観察でき（Figure 3A），扁平上皮細胞が均一に塗抹されていた（Figure 3B）。標本背景には粘液や夾雑物は存在せずきれいであった。検体不適正は0.5%（1/193検体）であり，対物レンズ10倍の視野において扁平上皮細胞数が3–5個と少数であった（Figure 4）。固定不良による乾燥や細胞崩壊のアーチファクトによる検体不適正は無かった。

Figure 3 CytoRich^TM preparation

A: The CR^TM slide presents a well-preserved population of stained cells present within a 13 mm diameter circle (lupe image. Papanicolaou stain). B: Satisfactory due to from many normal squamous cells in CR^TM preparation (Papanicolaou stain 10×).

Figure 4 Inadequate with CR^TM preparation

Unsatisfactory due to poor squamous cells in a clean background (Papanicolaou stain, 4×).

OLSILでは核腫大とクロマチン増加，2核化の細胞所見が詳細に観察された（Figure 5）。SCCは細胞のN/Cが高く，核腫大とクロマチン増加を示す類円形の小型腫瘍細胞（Figure 6A）や，角化異常細胞が観察された（Figure 6B）。PAS反応ではNILMと評価した28.8%（42/146検体）で陽性の仮性菌糸が検出でき（Figure 7），全体では21.8%（42/193）で陽性であった。

Figure 5 Oral low-grade squamous intraepithelial lesion with CR^TM preparation

Higher magnification, superficial squamous epithelial cells showing nuclear enlargement (Papanicolaou stain, 60×).

Figure 6 Squamous cell carcinoma

A: Higher magnification of the CR^TM preparation oral smears showed basal sized abnormal cells with high nuclear/cytoplasmic ratio and increased chromatin.

B: Higher magnification, CR^TM preparation adequate clusters of spindle type cells with hypercellular and keratinized cytoplasm

(A, B: Papanicolaou stain, 60×)

Figure 7 Oral candidiasis

Detect PAS-positive fungus by clearly observe (PAS reaction, 60×).

IV　 考察

口腔粘膜病変は目視で確認でき⁶⁾，簡便に擦過細胞診が可能であるといった利点がある。しかし，直接塗抹法では固定時の細胞剥離や乾燥などのアーチファクトが生じ検体不適正頻度が高く，腫瘍性病変の判定が困難なことがあり^{1),2),4),6),7)}，細胞診の信頼度が高いとは言いがたい。

われわれは，直接塗抹法による口腔内擦過細胞診で生じるアーチファクトを回避し，検体採取から標本作製を標準化するため，オーセレックスブラシ^RTを用いたCR^TM法について検討を行い良好な成績が得られた。細胞診ガイドライン5 消化器 2015年度版では，口腔細胞診の検体不適正が10%を超える際は，検査の見直しが必要と記載されているが¹⁴⁾，本研究における検体不適正率は0.5%（1/193検体）と良好な結果であり，CR^TM法は口腔細胞診の普及の一助になると考えられた。Kajan³⁾らはオーセレックスブラシ^RTと婦人科用のBDシュアパス^TM法で健常者50人を対象に口腔内各4カ所より検体を採取した結果，検体不適正率は1%（2/200検体）とわれわれと同等の結果を報告している。

口腔内病変のうち出血を伴う潰瘍性病変や腫瘤形成性病変など，臨床的に悪性病変を疑う場合には生検が適応となる。しかし，白斑や紅斑などの粘膜病変においては，肉眼的観察で腫瘍性病変や良悪性の判断は難しく，侵襲性が低い擦過細胞診が最初に施行されることが多いと思われる。採取細胞量が乏しい口腔内擦過細胞診では，検体採取量と回収量を最大限に上げ，判定に必要な細胞を破棄することなく標本上に保持させることが重要である。

口腔内細胞採取器具であるオーセレックスブラシ‍^RTはこれまで報告されている歯間ブラシなどと形状が異なるうえ²⁾，角化した口腔粘膜から細胞を削り落とすため硬度と強度があり，十分な細胞を採取することが可能であった。日常使用するスライドガラスは，日本工業規格により76 × 26 mm大と決められているが，CR^TM標本は採取細胞が集約して形成された13 mmのサークルであり，鏡検範囲は全例定まっておりストレスなく鏡検することが可能であった。細胞が均一に塗抹されることからスクリーニングエラーの回避等，医療安全の取り組みとしても重要であると考えられる。

生検でSCCと診断された9例のうちCR^TM法でSCCと判定した4例は，小円形の腫瘍細胞や角化異常細胞が多数採取されていた。一方，NILMと判定した2例は再鏡検でも異型細胞の出現はなく，病変範囲が不明瞭であった歯肉部1例と舌の微小病変1例であり，本手法を用いてもSCC由来の細胞を採取することが困難であったと考えられた。OLSIL，OHSILとした症例の再鏡検後も同様の判定となった。これらの症例は組織学的に表層分化を示しており，採取された細胞は細胞異型の乏しい角化細胞であったためSCCの判定に至らなかったと考えられた。CR^TM法でOHSILでは生検組織診において表層の角化細胞と深層型の小型腫瘍細胞が混在しており，細胞診ではそれらが出現していたためOHSILの判定となったものと推察される。吉田ら⁶⁾は臨床的にSCCが疑われても，細胞診では33%が疑陽性以下の評価であったと報告し，特に歯肉部や頬粘膜においては十分な細胞が採取できず，細胞診では悪性の評価が難しいことがあり，過度な細胞診を避け早期の生検が有用であると述べている。久山ら⁷⁾は直接塗抹法とBDシュアパス^TM法のスプリット・サンプル法で，SCCの的中率に有意差はないと報告しており，SCC由来の細胞が十分に採取された場合，CR^TM法でも評価は可能であると考えられる。

口腔内擦過細胞診におけるPapanicolaou染色では，菌糸の染色性が乏しく真菌の有無を評価することが難しいとされている¹⁶⁾。久山ら¹⁶⁾は培養検査で口腔カンジダ症と判定され，口腔内擦過細胞診でカンジダを検出できなかった11例のPapanicolaou染色を脱色しPAS反応を行ったところ63.6%（7/11例）で真菌を確認することができ，その有用性を報告している。本研究においては全例でCR^TM標本を2枚作製し1枚でPAS反応を施行し，NILMと判定した28.8%（42/146検体）で仮性菌糸が鮮明に観察され真菌の確認が可能であった。口腔カンジダ症による扁平上皮細胞の過剰評価を回避するためにもPAS反応を併用することは有用であると考えられた。

深津ら¹⁾は，サイトブラシを用いた直接塗抹法とLBCのスプリット・サンプル法の検討で，直接塗抹法では採取細胞の80–90%が破棄されていると報告している。また，SCCで18.3%，天疱瘡で11.0%の細胞しか鏡検の対象とされていないとし，直接塗抹法の欠点を明らかにしている。さらに佐藤ら⁴⁾はブラシで採取した場合の直接塗抹法において標本に塗抹される細胞は，採取した検体の20–30%であると報告し，採取細胞の多くが判定の対象とならずに採取器具と共に破棄されていることを指摘している。

本研究はスプリット・サンプル法を行わずに検体を直接保存液に回収し，193検体とも各2枚のCR^TM標本を作製したが192検体は検体適正であった。このことは，第1にオーセレックスブラシ^RTにより細胞採取量が増加し，ブラシ先端をはずし直接保存液に回収したこと，第2に遠心により採取細胞を集めたこと，第3に細胞が荷電によりスライドガラスへ強固に吸着するため剥離することなく保持されたこと，によると考えられる。検体採取～標本作製を簡便化でき，鏡検範囲は13 mm内となるため口腔細胞診の普及と標準化のための手技として有用性が高いと考えられる。

オーセレックスブラシ^RTとCR^TM法を併用することの利点を検証できたが，採取器具，専用保存液，標本作製時に必要な備品等のランニングコストが生じるといった費用面での欠点が挙げられる。しかし，検体採取の場にオーセレックスブラシ^RTとBDシュアパス^TMバイアルのみあれば，時間や場所を問わず簡便に擦過細胞診が実施可能である。さらに，残余検体での免疫染色や遺伝子検索にも応用が期待でき¹⁷⁾，導入のメリットは大きいと思われる。本手法を用いることにより口腔内擦過細胞診が簡便化し標準化され，口腔癌の早期発見・早期治療に貢献できると考える。

V　 結論

オーセレックスブラシ^RTを用い細胞採取量を向上させ，CR^TM法で標準化された塗抹標本を作製することで，検体不適正が減少し口腔内擦過細胞診の普及と細胞診判定の向上に有用であると考えられた。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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