2023 年 72 巻 2 号 p. 223-229
今回我々は，C. DIFF QUIK CHEKコンプリート（アボットダイアグノスティクスメディカル，A法）とクイックチェイサーCD GDH/TOX（ミズホメディー，M法）を用い，検出性能評価比較を行った。基礎的検討として，Clostridioides difficileコロニーを用いた希釈菌液によるglutamate dehydrogenase（GDH）検出感度の比較検討を実施した。臨床検体における検討として，C. difficile感染症疑いで提出された125検体を両試薬で同時測定を行った。併せて培養法によるC. difficile発育の有無，toxigenic culture法（TC法）によるtoxin産生性の有無を確認した。基礎的検討の結果，GDH検出感度はA法の方が10倍程度良好な結果となった。培養法（陽性24件）を対照としたGDHの感度・特異度は，A法：79.2%/100%，M法：87.5%/100%であり，2件の結果乖離があった。TC法（陽性18件）を対照としたtoxinの感度・特異度は，両法ともに35.3%/100%であり，いずれも低感度であった。臨床検体でGDH結果が乖離した2件は，検体のサンプリング操作法の違いが結果に影響を与えた可能性が高く，糞便の複数個所をサンプリングするよう注意して検査することが重要である。A法，M法は，ほぼ同等の性能であり，先行データの乏しいM法においても，CDI診断における第1スクリーニング試薬として有用であると結論付けた。
We evaluated the usefulness of two rapid immunoassays, C. DIFF QUIK CHEK Complete (Abbott Diagnostics Medical, QUIK CHEK) and Quick Chaser CD GDH/TOX (Mizuho Medy, Quick Chaser), for the detection of Clostridioides difficile toxins and glutamate dehydrogenase (GDH) in stool specimens. In comparison with the toxigenic culture, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) of toxin detection were 35.3, 100, 100, and 90.7 for QUIK CHEK and Quick Chaser, respectively. On the other hand, in comparison with the toxigenic culture, the sensitivity, specificity, PPV, and NPV of GDH detection were 79.2, 100, 100, and 95.3 for QUIK CHEK and 87.5, 100, 100, and 97.1 for Quick Chaser, respectively. The sensitivity of Quick Chaser was about 8.3% higher than that of QUIK CHEK. However, the results of the detection limit test for GDH using C. difficile clinical isolates were superior in QUIK CHEK. In QUIK CHEK, specimens are aspirated using a dropper. In contrast, Quick Chaser uses a cotton swab to wipe the specimen. Therefore, Quick Chaser is less susceptible to bias in fecal specimens, which may be the reason for the difference in GDH detection sensitivity in clinical specimens. It is important to sample and test multiple areas of feces. We conclude that QUIK CHEK and Quick Chaser are almost equivalent in performance, and Quick Chaser, for which there are few data from previous studies, is also useful as the first screening immunoassay in the diagnosis of C. difficile infection.
Clostridioides difficile感染症（CDI）は，抗菌薬使用などによって消化管の常在菌叢が乱された場合に発症することの多い消化管感染症である。CDIは，4時間以内に3回以上の水様便，便検査でC. difficile Toxin（以下，CD Toxin）の検出またはToxin産生性のC. difficileの分離，もしくは病理組織または大腸内視鏡所見検査にて偽膜性腸炎を認めた際に診断される1)。すなわちCD Toxinの検出はCDIの診断上，非常に重要なマーカーと言える。CD Toxinの検査法には，細胞培養法を用いた糞便中の毒素検出，培養によって得られた分離菌よりCD Toxin産生性を確認するtoxicigenic culture，enzyme immunoassay（EIA法）を原理とする迅速診断キット，遺伝子検査法（nucleic acid amplification test; NAAT）など様々ある1)。
Clostridioides（Clostridium）difficile診療ガイドライン2)では，アウトブレイク時など迅速な対応が必要な場合を除き，迅速診断キットを用いてC. difficile抗原であるグルタミン酸脱水素酵素（glutamate dehydrogenase；以下，GDH抗原）とCD Toxin検査を行い，その結果に基づいてNAATを組み合わせるアルゴリズムを推奨している。これらの背景により，本邦において迅速診断キットは，重要な位置付けにある。
国内で販売されているCD Toxin，GDH抗原の同時検出が可能な体外診断用キットは，C. DIFF QUIK CHEKコンプリート（アボットダイアグノスティクスメディカル，以下，QUIK CHEK）とGEテストイムノクロマト－CD GDH/TOX「ニッスイ」（日水製薬，以下，GEテスト）の2種類に加え，2020年4月にクイックチェイサーCD GDH/TOX（ミズホメディー，以下，クイックチェイサー）が上市され，全部で3種類となった。QUIK CHEKの性能評価については，国内外で多く報告されている3)～13)。GEテストについては，我々が2018年にQUIK CHEKとGEテストの性能を比較検討した報告（第1報）10)のほか，国内で2件の報告がある11),13)。
クイックチェイサーと他の迅速診断キットとの性能比較に関しては，現時点でNAAT（16S rRNA遺伝子，ToxinB遺伝子）と比較した吉田の報告13)が1件あるのみであり，分離培養法やToxigenic cultureと比較した検討結果はなく，臨床的な差異については十分に明らかではない。
今回我々は，QUIK CHEKとクイックチェイサーにおける検出性能について，臨床分離株を用いた基礎的検討のほか，臨床検体を用いて分離培養法やtoxigenic cultureを対照とした比較検討を行ったので報告する。
当院で分離されたC. difficile臨床分離株2株を用いた。臨床分離株の菌種同定にはmatrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometryを原理とするMicroflex LT/SHの微生物迅速同定システムMALDI Biotyper（Burker JAPAN）を使用した。なおシステムソフトウェアはflex Control 3.4.135.0/MBT Compass 4.1.100.10，データーベースはBDAL8468を用い，Score 2.00以上が得られた株を用いた。
2） 方法CCMA培地EX（日水製薬）にて48時間培養した分離株を，滅菌生理食塩水にてMcFarland 2.0に調整し10倍，100倍，1,000倍に段階的に希釈した菌液を検体とした。QUIK CHEK，クイックチェイサーはそれぞれ添付文書に従って実施し，両者の結果を比較した。なお，測定は希釈誤差や接種誤差を否定するため二重測定を行った。
2． 臨床糞便検体を用いた検出性能の比較検討 1） 検討対象2020年7月から2021年4月までの期間にCDI疑いでC. difficile検査依頼のあった糞便検体125件を対象とした。2週間以内にGDH陽性検歴のある患者ならびにCDI治療中の患者は検査対象外とした。QUIK CHEK，クイックチェイサーによる検査は，原則検体提出当日に実施した。当日の検査が不可能であった場合には，冷蔵（4℃）保存し，2日以内に検査を実施した。検討に用いた糞便検体は，Bristol Stool Form Scale14)の客観的指標を用いた性状評価を行い，Bristol Score 5以上の検体のみを検査対象とした。なお本検討は，小牧市民病院臨床研究倫理審査委員会の承認を得て行った（承認番号：221019）。
2） 糞便中のGDH抗原およびCD Toxinの検出糞便中のCD ToxinおよびGDH抗原を，QUIK CHEK，クイックチェイサーを用いて，それぞれ添付文書に記載された方法に従い実施した。
3） 糞便中のC. difficile培養方法培養は以下に示す2法で実施し，いずれかの方法にてC. difficileが発育した場合を培養陽性と判定した。
①糞便検体を，直接CCMA培地EXに1白金耳画線塗抹し，35℃で48～72時間嫌気培養を実施した。
②糞便検体を，等量のエタノールと混和し，30分静置後CCMA培地EXに1白金耳画線塗抹し，35℃で48～72時間嫌気培養を実施した。
嫌気培養は嫌気ジャーとアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）を用いて行った。
4） C. difficile同定方法CCMA培地EXに発育した，特徴的な臭気を発する辺縁不整，R型のコロニーについて，MALDI Biotyperを用いて同定し，Score 2.00以上をC. difficileと確定した。
5） 培養陽性分離株のCD Toxin検出（Toxigenic culture）48～72時間嫌気培養したCCMA培地EX上に発育した分離株を，谷野らの報告15)に従いQUIK CHEKのキット添付の希釈液にてMcFarland 4.0以上に調整し，その菌液を検体としてQUIK CHEKを用いて分離株のCD Toxin産生性を確認した。なお今回の検討では，Toxigenic cultureはQUIK CHEKのみで行い，クイックチェイサーでは実施していない。
結果をTable 1に示す。測定に用いた臨床分離株2株で同一の結果となった。二重測定した結果も一致した。100倍希釈検体でQUIK CHEKではGDH陽性と判定可能であったのに対し，クイックチェイサーでは陰性であることより，QUIK CHEKとクイックチェイサーのGDH抗原最小検出感度は，10倍程度の差があり，QUIK CHEKが良好であった。
| Sample | Dilution ratio | GDH results | |
|---|---|---|---|
| QUIK CHEK | Quick Chaser | ||
| Clinical Isolate 1 | 1/1 | + | + |
| 1/10 | + | + | |
| 1/100 | + | − | |
| 1/1,000 | − | − | |
| Clinical Isolate 2 | 1/1 | + | + |
| 1/10 | + | + | |
| 1/100 | + | − | |
| 1/1,000 | − | − | |
GDH, glutamate dehydrogenase; QUIK CHEK, C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE; Quick Chaser, Quick chaser CD GDH/TOX; +, positive; −, negative.
Table 2に分離培養法を対照とした場合のQUIK CHEK，クイックチェイサーのGDH抗原結果の比較成績を示す。分離培養法にてC. difficileが検出された検体24検体のうち，QUIK CHEKは19検体，クイックチェイサーは21検体がGDH抗原陽性と判定された。また分離培養法にてC. difficile陰性であった101検体では，QUIK CHEK，クイックチェイサーともにすべての検体がGDH抗原陰性と判定された。分離培養法を対象とした場合の糞便中のGDH抗原検出のsensitivity，specificity，positive predictive value（PPV），negative predictive value（NPV）は，QUIK CHEKが79.2%，100%，100%，95.3%，クイックチェイサーが87.5%，100%，100%，97.1%であった。
| GDH results | Culture | Sensitivity (%) | Specificity (%) | Positive predictive value (%) | Negative predictive value (%) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Positive | Negative | ||||||
| QUICK CHEK | Positive | 19 | 0 | 79.2 | 100 | 100 | 95.3 |
| Negative | 5 | 101 | |||||
| Quick Chaser | Positive | 21 | 0 | 87.5 | 100 | 100 | 97.1 |
| Negative | 3 | 101 | |||||
GDH, glutamate dehydrogenase; QUIK CHEK, C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE; Quick Chaser, Quick chaser CD GDH/TOX.
Table 3に分離培養法に対するQUIK CHEKとクイックチェイサーのGDH抗原結果の不一致例の詳細を示した。QUIK CHEK，クイックチェイサーともにGDH抗原陰性であったが，分離培養でC. difficileが検出された検体はSample No. 18，80，111の3件あった。QUIK CHEKのGDH抗原の初検値は陰性であったが，クイックチェイサーのGDH抗原が陽性であり，分離培養でC. difficileが検出された検体はSample No. 76，90の2件あった。この2件については，結果の乖離を受け，QUIK CHEKの再検査を実施したところ，再検値はGDH抗原陽性と判定された。
| Sample No. | GDH results | Culture | Toxin results | Toxigenic culture | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| QUIK CHEK | Quick Chaser | QUIK CHEK | Quick Chaser | |||
| 18 | − | − | + | − | − | + |
| 80 | − | − | + | − | − | + |
| 111 | − | − | + | − | − | − |
| 76 | − ※ | + | + | − | − | + |
| 90 | − ※ | + | + | − | − | − |
GDH, glutamate dehydrogenase; QUIK CHEK, C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE; Quick Chaser, Quick chaser CD GDH/TOX; +, positive; −, negative.
※The results of the retest were positive.
Table 4にtoxigenic cultureを対照とした場合のQUIK CHEK，クイックチェイサーのCD Toxin結果の比較成績を示す。Toxigenic cultureにて毒素産生株が検出された17検体のうち，QUIK CHEK，クイックチェイサーともに6検体がToxin陽性と判定された。またtoxigenic cultureにてC. difficile発育陰性あるいは毒素非産生株が検出された108検体では，QUIK CHEK，クイックチェイサーともに108検体全てCD Toxin陰性と判定された。Toxigenic cultureを対照とした場合のCD Toxin検出のsensitivity，specificity，PPV，NPVは，2キットともに35.3%，100%，100%，90.7%であった。
| Toxin results | Toxigenic culture (QUICK CHEK) | Sensitivity (%) | Specificity (%) | Positive predictive value (%) | Negative predictive value (%) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Positive | Negative | ||||||
| QUICK CHEK | Positive | 6 | 0 | 35.3 | 100 | 100 | 90.7 |
| Negative | 11 | 108 | |||||
| Quick Chaser | Positive | 6 | 0 | 35.3 | 100 | 100 | 90.7 |
| Negative | 11 | 108 | |||||
GDH, glutamate dehydrogenase; QUIK CHEK, C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE; Quick Chaser, Quick chaser CD GDH/TOX.
今回我々は，糞便中のCD Toxin，GDH抗原の同時検出が可能な試薬であるQUIK CHEKとクイックチェイサーの検出性能に関する比較検討を目的に，臨床分離株を用いた基礎的検討と，臨床糞便検体を用いた検討を行った。
臨床分離株を用いたGDH抗原最小検出感度の基礎的検討結果では，QUIK CHEKの方がクイックチェイサーより10倍程度良好な結果が得られた。一方，臨床糞便検体を用いたGDH抗原の検出性能検討結果では，分離培養法を対照とした場合の感度は，QUIK CHEKが79.2%，クイックチェイサーが87.5%と，クイックチェイサーの方が優れた結果となり，基礎的検討と臨床検体を用いた検討結果が乖離した。臨床検体における両試薬のGDH抗原検出感度に差が出た要因としては，Table 3に示した通り，QUIK CHEKで陰性，クイックチェイサーで陽性となった2検体に起因する。QUIK CHEKの検体サンプリング操作は，糞便検体の検体性状により異なるが，固形便の場合は，2 mm径の小片を検体希釈液に加える方法であり，液状または半液状便であった場合は，25 μLの糞便検体をキット添付のプラスチックスポイトを用いて吸い取る方法である。糞便検体を十分に均質化してからサンプリングするよう，添付文書の検体調整の項に記載があるが，水様便でない限り，便検体の均質化は現実的に難しい。一方クイックチェイサーの検体サンプリングは，キット付属の綿棒を用いて行う方法である。糞便検体の複数個所を拭った後に抽出液に投入することが容易であり，糞便検体中の偏りに対して影響を受けにくい手法である。GDH抗原結果が乖離した2検体において，結果の乖離を受け，即時QUIK CHEKの再検査を実施したところ，意図的に複数個所をサンプリングして行った再検査の結果はGDH抗原陽性であった。GDH抗原検出の基礎的検討結果はQUIK CHEKの方が感度良好であるため，純粋に同一濃度の均質サンプルで比較すると，QUIK CHEKの方が勝っていることが示唆されるが，臨床検体のサンプリング法の違いによって臨床検体を用いた検討結果が逆転したと考える。いずれのキットを使用する場合でも，検体のサンプリング操作が結果に影響を与えるため，糞便検体の複数個所を拭い検体希釈液を作成することが，偽陰性を生まないために重要と考える。
先行研究において，培養法と比較した場合のQUIK CHEKのGDH抗原検出感度は80.0%～100%3)～5),7)～11)，GEテストの検出感度は92.7%～94.1%10),11)と報告されている。今回の我々の結果では，QUIK CHEKは79.2%と既報より若干低いが同程度であり，クイックチェイサーも87.5%とこれまでの市販キットと同レベルと考えられた。
今回の検討結果では，GDH抗原陰性であるが培養陽性検体が3件あり，どちらの迅速診断キットにおいても，GDH抗原をC. difficile検出の第1スクリーニングとした場合，一部の培養陽性症例では偽陰性と判定されていることが明らかになった。日本臨床微生物学会腸管感染症検査ガイドライン第2版16)でも示されている通り，たとえGDH抗原が陰性であっても，臨床症状よりCDIを強く疑う場合には，迅速診断キットの偽陰性の可能性も視野に入れ，培養検査を併用する，あるいはNAATを実施するなど，より高感度な手法を用いることも検討すべきである。
GDH抗原の特異度は，先行研究においてQUIK CHEK 92.4%～100%3)～5),7)～11)，GEテストは95.2%～95.4%10),11)と報告されている。今回我々の結果では，QUIK CHEK，クイックチェイサーともに100%であった。既報ではQUIK CHEKでも偽陽性になった報告があることより8),10),11)，今回用いた臨床検体には非特異的反応を起こす検体が入っていなかった可能性は否定できない。しかし先行データの乏しいクイックチェイサーについては，これまでの市販キットと同レベル以上の特異度である可能性が示唆された。
CD Toxin検出について考察する。Toxigenic cultureを対照とした場合のToxin検出感度は2キットともに35.3%，特異度は100%であり，不一致例は認めなかった。先行研究においてtoxigenic cultureを対照とした場合のToxin検出感度はQUIK CHEK 41.9%～78.6%3)～11)，GEテスト48.7%～48.8%10),11)と報告されており，QUIK CHEKのToxin検出感度は報告によりばらつきが見られている。迅断キットにおけるToxin検出については，当初は高い感度が報告されていたが3)～5),9)，近年の報告では，毒素陽性症例のうち半数以下しか検出できていないことを指摘する報告が多い6),7),10),11)。今回の我々の結果では，35.3%と既報よりさらに低い結果となった。クイックチェイサーのToxin検出感度も，他の迅速キットと同様，まだまだ十分とはいえない。また軽症のCDI症例においては，迅速キットで毒素陰性となりやすいことも報告されており17),18)，いずれの迅速キットを使用する場合においても迅速キットのToxin検出のみに頼ったCDI診断は，病原性を過小評価する可能性が高いと考えられた。
CD Toxin特異度に関して，既報ではQUIK CHEK 94.1%～100%3)～11)，GEテストは全て100%10),11)といずれも高い値が報告されている。今回の我々の結果でも，2キットともに100%と良好な結果であった。しかし経腸管洗浄剤がQUIK CHEKのToxin検出に偽陽性反応を示すことを指摘した報告がある19)。また，小澤20)はインフルエンザウイルスの迅速診断の検討で，抗原抗体反応に基づくキットでは，本来の検査対象の抗原とは異なっていても構造が似ている物質の場合反応してしまうケースがあり，特に，ポリクローナル抗体を使用したキットでは交差反応を起こす確率が高くなること，抗体が由来動物の個体差に影響されることもあるとしている。これらの背景から，抗原抗体反応を原理とする迅速キットを使用する場合は，いずれのキットにおいても偽陽性については念頭に置くべきと考える。
本検討は，toxigenic cultureをQUIK CHEKでのみで実施しているため，クイックチェイサーにおけるtoxigenic cultureの性能は評価できていない。今後さらなる検討が必要と考える。
QUIK CHEK，クイックチェイサーはCD Toxin検出，GDH抗原検出においてほぼ同等の性能である。
先行データの乏しいクイックチェイサーにおいても，CDI診断における第1スクリーニング試薬として既存の迅速キットと同様に有用であると結論付けた。
検体のサンプリング操作が結果に影響を与えるため，十分に注意することが，GDH抗原の偽陰性を防ぐ上で重要である。また両試薬ともToxin検出感度は低いため，いずれの迅速診断キットを使用する場合においてもToxin検出の際には，診療ガイドライン2)や腸管感染症検査ガイドライン第2版16)に従いtoxigenic cultureやNAATを併せて診断していくことが必須と考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
