最少精子数を用いた微小環境マウス体外受精法の確立

抄録

【目的】微小滴内で体外受精を行うことで，最少精子数でも効果的に受精卵を獲得する手法を考案した。一般的なマウス体外受精には数万～数十万の精子数が必要となることから，精子形成異常のマウス系統や凍結された精子など，十分な精子数を確保できない場合に有効であると考えられる。【材料と方法】動物：C57BL/6JおよびC57BL/6N系統の，それぞれ12週齢以上の成熟雄および5または10週齢の雌を用いた。過排卵処置：雌マウスにPMSG(7.5IU/匹)を腹腔内投与し，48時間後にhCG(7.5IU/匹)を投与，約17時間後に採卵して体外受精に用いた。精子凍結：18％ラフィノース＋3%スキムミルク水溶液に精巣上体尾部精子を拡散後，ストローへ封入して液体窒素の気相で凍結した。融解は37℃温浴で行い，15分後に回収した。体外受精：採取した卵子はHTFまたは1.5 mM還元型グルタチオン（GSH）添加HTFで約1時間培養後，各1 μℓの微小滴にキャピラリーを用いて卵子1，3，5，10個を移した。精子前培養はHTFおよび0.4 mM methyl-β-cyclodextrin を添加したPVA-HTFで30分～1時間行い，各微小滴にキャピラリー（内径100 μm）を用いて前進運動性を示す5，10，20，50精子をカウントしながら導入した。4～6時間後にグルコース添加CZBに卵子を移し，培養試験に供した。 【結果】受精用培養液へのGSH添加が受精率を改善し，卵子1または3個に対して5精子を導入した場合でも受精した。新鮮精子では卵子数1～5個の場合，20精子以上導入することで両系統とも60％以上，凍結精子でもC57BL/6JとC57BL/6N系統でそれぞれ60％および78％までの受精率が得られた。更に通常の方法で約30％と低率を示した凍結精子からも，微小環境で同等の受精率を得ることができた。本実験から，微小環境で体外受精を行うことで，通常の体外受精に必要な1/1000以下の精子量で受精卵の獲得が可能となった。