ウシiPS細胞の未分化状態維持に適した培養条件に関する検討

抄録

【背景・目的】マウス体細胞に山中4因子（Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc）を遺伝子導入することにより，マウスiPS細胞が樹立された。しかし，精子・卵子ヘの分化能を有するウシiPS細胞は報告されていない。本研究室では，ウシ6転写因子（OCT4，SOX2，KLF4，NANOG，c-MYC，LIN28）を初代ウシ線維芽細胞に遺伝子導入することにより，iPS細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を示す，不死化されたウシiPS細胞を作出した。しかし，マウスiPS細胞の培養条件（＋KSR＋LIF＋2i）はウシiPS細胞の未分化状態維持に不適切であることが判明した。そこで本研究では，ウシES細胞の樹立・維持に用いられた培養条件（＋BSA＋FGF2＋IWR1（Wntシグナル阻害剤），BogliottiらPNAS 2018）の適用を試みた。【方法】ウシiPS細胞の未分化状態を維持するために＋BSA＋FGF2＋IWR1培養を行った。また，＋FCS−FGF2−IWR1培養に変更することにより，遺伝子発現がどの様に変化するか検証した。未分化マーカー（OCT4，NANOG），外胚葉マーカー（FGF5，NESTIN，TUBB3），中胚葉マーカー（T，BMP4），内胚葉マーカー（GATA6，AFP）の発現をリアルタイムPCRにより定量した。【結果】＋FCS−FGF2−IWR1培養により未分化マーカー（OCT4，NANOG）の発現が大きく増加したことから，未分化状態維持に＋FCS，−FGF2，−IWR1のいずれかが適していることが示唆された。また，NANOGプロモーターのDNAメチル化解析により＋BSA，＋FGF2，または＋IWR1のいずれかがDNAメチル化レベルの低下に寄与することが示唆された。一方，三胚葉分化関連マーカー遺伝子群の発現解析より，＋BSA＋FGF2＋IWR1培養でも未分化状態維持が不安定であることに起因して，自発的な分化が生じていると考えられた。