Increased metallothionein (MT)-IIA transcription is found in some cells with acquired resistance to cisplatin (CDDP). It is also known that mammalian MT is induced by copper. MT induction by TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate) and TNFα (tumor necrosis factor α has been demonstrated. In previous study, we found Cu(II) ion dependency on binding of the nuclear protein of HeLa cells stimulated with TPA or TNFα to the metal responsive elements (MREs) sequences in the MT-IIA promoter gene, which was investigated by the gel shift assay using the plasmid pKB8 constructed the human MT-IIA promoter gene in pUC19. Therefore, it was suggested that the nuclear protein bound specificically to the MT-IIA promoter region in the presence of Cu(II) ion contributes to CDDP resistance by regulation of MT-IIA gene expression. In this study Cu(II) ion dependency on binding of the nuclear protein from the CDDP-resistant cells to the DNA fragments containing MREs in the MT-IIA promoter gene was examined in connection with observation of the MT-IIA gene expression (mRNAs) in CDDP-resistant cells.

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真核生物に見られるDNAメチル化修飾は、epigeneticな現象を司る機構の中でも最も重要なもののひとつである。発生・分化のみならず、多くの生命現象と深く関わっており、その破綻は、癌などの疾患、老化などと密接な関係を有する。この修飾を網羅的に観察する技術の開発は、基礎科学のみならず、疾病研究においても必須である。これまでメチル化と近傍遺伝子の発現との関係が解析され、一般的には、プロモーター領域に存在するCpGのシトシンがメチル化を受けると、その遺伝子領域のクロマチン凝縮が進み、その結果、転写因子のアクセスが阻害されることから、転写は抑制されると言われている。このようなメチル化修飾の観察は、転写物そのものの観察と比べ、(1)低発現遺伝子の転写観察が容易（mRNAをの材料に用いる場合、低発現転写物の検出が困難になるが、ゲノムメチル化ではこの効果が低い）、(2) poly(A)を持たない転写物を含む未知転写単位の同定が可能、(3)クロマチンにおける記憶機構の理解　（転写のON/OFFに至る前のイベントであり、トランスクリプトーム形成を司る高次の制御の指標である）、のような利点を有する。我々は、メチル化感受性制限酵素とHiCEP法で培った選択PCRの技術を用いるとにより高感度で高網羅性（一度に約30,000箇所の非メチル化部位観察が可能）の解析手法を提案した。今回、本法により真にメチル化を網羅的に観察可能か、また近傍遺伝子の発現変動とメチル化状態の間に有意な関係は存在するか等について詳細な解析を行った。また、数百細胞での解析も可能にした。これらの結果を報告し、当該技術の能力を従来技術との違いを議論する。一方で、本技術は、転写物を解析対象とするHiCEP法と比べ、ピーク数が少なく、擬陽性シグナルもほとんど無い。またalternative transcriptsなどの複雑さが無いため、ゲノム情報からのピーク予測が現実的である。その実証の報告も行いたい。

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Genetic information is stored in all cells as genomic DNA. Differences among cells of a single organism reflect differences in gene expression. Gene expression is controlled mainly at transcriptional step. Once RNA transcripts are synthesized, they are spliced to become mature mRNA, which are transported from the nucleus to the cytoplasm and used as templates for protein synthesis. Each step is regulated so as to accommodate to the needs of each cell. Gene expression can be greatly altered by environmental stimuli, which are transferred by istracellular signal transduction systems. Gene expression is also regulated during various disease processes. Neoplastic transformation is believed to originate via mutation and anomalous gene expression. Protooncogenes, which are responsible for transformation and progression of neoplasms, are involved in the signal transudation system to the level of gene expression. Brain tumor research, therefore, is closely linked to the study of altered gene expression. The process of cell death in brain tumors is, at least in part, regulated via changes in gene expression. The process of such active suicidal cell death is known as apoptosis. In acute neurosurgical disorders such as head trauma and cerebrovascular diseases, the central nervous system (CNS) is damaged so quickly that there seems to be no possibility of involvement of gene expression. However, a secondary process, which could exacerbate a patient's condition, takes place following the initial injury. In this secondary process, cells in the CNS seem to alter their gene expression in order to survive. One such cellular reaction is the stress response. Expression of genes encoding various growth factors is also important for the survival of CNS cells under disease.

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静置培養時と振盪培養時の Rothia mucilaginosa の

の比較

古森賢・山根一芳・王宝禮（大阪歯大・細菌）

口腔感染症から分離される細菌には，シュクロース非依存性に菌体外マトリックスを産生する株が存在する．これらの細菌の産生する菌体外マトリックスは貪食抵抗因子として働くだけでなく，菌体を周囲の環境から保護し，疾患の慢性化，難治化に重要な役割を果たすことが分かっている．我々はこれまでに数回の根管治療にもかかわらず，持続的に単一の細菌種が分離される難治性根尖性歯周炎の病巣からRothia mucilaginosa DY­18 株（DY­18 株）を分離し，この菌株が菌体外マトリックスを産生することで治療に抵抗して病巣で長期に生存することを明らかにしてきた．また，我々はDY­18 株の産生する菌体外マトリックスが，中性糖として主にガラクトース，マンノース，ラムノース，グルコースを含み，アミノ糖として少量のグルコサミンとガラクトサミンを含む菌体外多糖（exopolysaccharide, EPS）であり，このEPS がDY­18 株のバイオフィルムの構成因子になっていることを報告した．

本研究ではDY­18 株のバイオフィルム形成について更に詳細に検討し，その遺伝学的な背景を明らかにする ことを目的に，浮遊状態の細胞と，バイオフィルム形成状態の細胞の

をマイクロアレイ分析した．走査型電子顕微鏡観察の結果，DY­18 株の菌体表面には，バイオフィルム形成菌の特徴である菌体間の網目様構造物が存在していた。さらに，培養菌液の粘度からEPS の産生量を経時的に測定すると，種菌接種30 時間後から42 時間後まで粘度が著しく上昇し，EPS の産生量が増加していた．また，種菌接種36 時間後の振盪培養した浮遊状態と，静置培養したバイオフィルム形成状態の培養菌液の粘度を比較したところ，振盪培養では粘度上昇が認められず，静置培養時とはEPS の産生量に大きな差があることが示された．そこで，我々が決定したDY­18 株のgenome の配列とアノテーションを基にマイクロアレイをデザインし，浮遊状態とバイオフィルム形成状態の細胞における遺伝子の発現量を測定した．両培養条件における各遺伝子の発現量を比較した結果，バイオフィルム形成状態でDNA polymerase III subunit beta（NCBI locus tag ;RMDY18_00020），signal transduction histidine kinase（RMDY18_00350），mo­ lecular chaperone DnaK（RMDY18_16800）をコードする遺伝子が有意に発現上昇していることが明らかになった．これらの遺伝子は，DY­18 株のバイオフィルム形成に重要な役割を果たしていると考えられる．

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アレルギー疾患感受性遺伝子の発現レベルは症状の重篤性と相関するため，

の抑制は有効な治療法となりうる．我々は，ヒスタミンH₁受容体（H1R）遺伝子が花粉症の疾患感受性遺伝子であることを証明し，そのがプロテインキナーゼCδ（PKCδ）シグナルを介することを明らかにした．また，和漢薬苦参由来H1R抑制化合物（－）マーキアインの分子薬理学的研究から，花粉症に対する新規創薬ターゲットとしてヒートショックプロテイン90（Hsp90）を同定した．Hsp90阻害薬は鼻過敏症モデルラットにおいて鼻粘膜H1R亢進を抑制し症状を改善した．抗ヒスタミン薬はPKCδシグナルを抑制し症状を改善するが，抗ヒスタミン薬によりH1Rがコントロールレベルにまで減少しても症状は完全には改善せず，花粉症の症状発現にPKCδシグナルに加えて第2の細胞内シグナルの関与が考えられた．スプラタストは抗ヒスタミン薬と同様症状改善効果を示すがPKCδシグナルを抑制せず，その症状改善効果は第2の細胞内シグナルの抑制によると考えられた．スプラタストと抗ヒスタミン薬エピナスチンの併用投与により，それぞれの薬物単独投与に比べ顕著な症状改善効果が認められた．スプラタストは鼻粘膜IL-9を強く抑制したが，エピナスチンはIL-9を抑制せず，スプラタストが第2の細胞内シグナルを介したIL-9を抑制することが示唆された．スプラタストはRBL-2H3細胞においてNFATシグナルを介したIL-9亢進や，NFATシグナルを介することが知られているJurkat細胞におけるIL-2亢進を抑制した．これらのことから，スプラタストがNFATシグナルを抑制することが明らかとなった．以上の結果から，PKCδシグナルとNFATシグナルは花粉症発症に関与する細胞内シグナルであり，両シグナルを抑制することにより顕著に症状を改善できることが明らかとなった．

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チャの新葉では,カテキン合成酵素であるPAL,CHS,DFRのは白色光の光量が多いほど強く,なかでもCHSとDFRのは赤色光と青色光の照射によっても活発になった。ショ糖溶液を与えることにより,光によるPAL,CHS,DFRのは光量に依存せずに相乗的に誘導された。葉の生長が進むと,新葉と同様の傾向で応答が見られたが,光に対する感受性が低下することが示された。

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放射線は医学的に広く利用されているが、肺や皮膚等の種々の組織や臓器に生じる線維化（Radiation-induced fibrosis; RIF）が懸念される。RIFは、放射線による細胞外マトリックス(ECM)の過剰な蓄積の結果と考えられているが、RIFプロセスを促進する細胞内シグナル伝達や

に関わるメカニズムについて充分には解析されていない。また、非コードRNAの一つであるmicroRNA(miRNA)が、翻訳の阻害やmRNAの分解を起こし、転写後の調節に関与することが報告されている。RIFプロセスにおいても転写後の調節因子としてmiRNAが重要な役割を担うことが示唆され、本発表では、RIFプロセスに関連し、ECM主成分であるコラーゲンを対象とした放射線による発現の変化、さらに転写後の調節に関わるmiRNAについて調べた。

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摂食行動は中枢視床下部摂食中枢の神経細胞に存在する10種あまりの摂食関連神経ペプチド遺伝子の発現により精密に調節されている．その主体をなすものは視床下部弓状核にある摂食誘導性のNPY/AgRP神経と摂食抑制性のα-MSHを産生するPOMC（proopiomelanocortin）神経の拮抗的支配であることが明らかになってきた．NPYは弓状核NPY-Y1とY5受容体を介して最も強い摂食誘導を引き起こす中枢内在性の神経活性ペプチドである．絶食負荷は摂食行動を強く誘導するが，これは末梢での血糖，インスリン，レプチンの低下が摂食中枢の神経ペプチドNPY/AgRP遺伝子転写を誘導し，逆に摂食抑制性のPOMC,CART遺伝子を抑制することに依る（血糖恒常説，脂肪恒常説）．摂食関連ペプチド群の中でNPY系が摂食調節にどのように関わるかを調べるために，NPY-Y5受容体ノックアウトマウスの摂食行動と脳内摂食関連ペプチドの変化が調べられた．急性投与ではNPY受容体Y1,Y5アンタゴニストはそれぞれ摂食行動を有意に抑制するが，NPY-Y5受容体の生後よりの持続的遮断を反映するY5受容体ノックアウトマウスでは逆に特徴的な肥満と，それに伴う自由摂食時と絶食負荷時の摂食量の増加が認められた．自由摂食時の視床下部弓状核でのNPYは著しく減少していたが，摂食抑制性のPOMCは弓状核で有意に減少していた．絶食負荷時にはこれらのの変化が増強された．NPY受容体ノックアウトを用いた実験から，NPY神経系が持続性遮断されるような状態では他の摂食関連，特にPOMCが視床下部摂食中枢で代償的に変化する代償機構の存在が明らかになった．

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近年、化学物質の有害性評価方法に細胞試験が注目されている。デー タの取得も次世代シーケンサの実用化により大規模かつ正確になっているが、そ の一方で、データの解析方法は未だに確立されていない。本研究では、 データの解析方法の確立に向け、複数の細胞試験データ間の相関を特 徴づけるRNAの抽出アルゴリズムの開発を行う。具体的には、相関係数に対して 設定された最適化問題の最適解を様々なメタ戦略を用いて探索し、各 データ間の情報を要約する。

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解析を難しくしている要因の１つに発現データの不均一性があげられる。データは特定の集団においても正規分布ではなく多様な分布を示す場合が多く、t検定などの記述統計的手法では対応できない場合が多い。このような問題に対応するためと解析の自動化を目的としたデータの解析手法を開発した。これは、層別化された患者群の情報のヒストグラムから自動的にデータを評価するためのMembership Functionを形成し、これを用いてFuzzy Logicを行う方法である。この手法を用いて、関節リウマチ患者への抗TNF-α製剤の投与後14週後の効果を薬剤投与前のデータから予測するモデルを構築したところ、モデル生成用のデータ群において89％、トレーニング用のデータ群において94％、バリデーションのデータ群において89％の予測結果を得られた。以上の結果から、解析において、本研究による自動Membership Function生成機能を適用したFuzzy Logicが極めて有効なツールであることが示唆された。

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多くのGタンパク質共役型受容体と異なり，ヒスタミンH₁受容体刺激はH₁受容体の亢進を介して，同種の受容体アップレギュレーションを引き起こした．この分子機構にはタンパク質キナーゼC-δの活性化シグナルが関与する．また，IL-4受容体刺激により，H₁受容体亢進を介する異種のアップレギュレーション機構も存在する．この分子機構にはJak3，Stat6を介するシグナルが関与する．アレルギー性鼻炎モデルラットの鼻粘膜において，鼻炎発作に伴いヒスタミンH₁受容体遺伝子の発現亢進を介するH₁受容体アップレギュレーションが引き起こされた．このH₁受容体アップレギュレーションにはH₁受容体を介する同種のH₁受容体亢進機構とH₁受容体を介さない異種のH₁受容体亢進機構が関与する．異種のH₁受容体亢進機構もH₁受容体シグナルが関与するが，1週間以上の長時間のH₁受容体シグナルを必要とした．異種のH₁受容体亢進シグナルはIL-4により仲介されることが示唆され，アレルギー性鼻炎の症状悪化に関係することが考えられる．アレルギー性鼻炎モデルラットの症状は抗ヒスタミン薬の投与量よりヒスタミンH₁受容体レベルに依存することから，H₁受容体遺伝子はアレルギー疾患感受性遺伝子であることが明らかである．タンパク質キナーゼC-δ活性化シグナルを介するヒスタミンH₁受容体亢進は抗アレルギー作用が伝承される緑茶，および，苦参などの天然物医薬により強力に抑制され，これらの天然物医薬はアレルギー性鼻炎モデルラットの症状を強力に抑制した．タンパク質キナーゼC-δシグナルを抑制する天然物医薬は抗ヒスタミン薬と薬理機構が異なり，新規アレルギー疾患治療薬としての有用性が期待される．

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