1. はじめに

　植物疫病菌（Phytophthora属糸状菌）は、ジャガイモなどの重要農作物に感染し甚大な被害を与え、世界３大植物病害の1つとして知られている。疫病菌の多くは有性生殖を行い、耐久性と遺伝的多様性を獲得した次世代が誕生するが、この有性生殖の存在が地球規模の蔓延、急速な薬剤耐性化や悪性化の要因と考えられている。したがって有性生殖メカニズムの分子レベルでの解明は、疫病菌防除に繋がる重要な課題であると言える。疫病菌の有性生殖には2つの交配ホルモンa1（A1交配型が分泌）とa2（A2交配型が分泌）が関与しており、この２つの交配ホルモンの構造と生合成経路が15年以上の歳月を経て当研究室で解明された^{1）, 2）}。これまでに両ホルモンの構造活性相関^３）および普遍性が検討され、疫病菌の有性生殖の化学的基盤が整った。しかし、疫病菌有性生殖の全容解明には「交配ホルモンがどこから来て、どのように作用するのか」というケミカルバイオロジー的課題が未解明である。

　現在のところ、疫病菌有性生殖システムを図1のように推定している。すなわち、①A2交配型がa2合成系を使って植物に含まれるフィトールからa2を生合成し細胞外に分泌する。②近くのA1交配型は受容体によりa2を認識し、③細胞内シグナル伝達経路により核内の有性生殖関連遺伝子が活性化し造卵器、造精器が分化する。④a2は同時にA1交配型のa1合成系によりa1へと変換され細胞外に排出される。⑤A2交配型は受容体を介してa1を認識し、⑥シグナル伝達経路の活性化を経て生殖器官の分化を引き起こす。互いの生殖器官は融合して卵胞子を形成する。異なる交配型A1, A2が出会った時だけ有性生殖を行う（自家不和合性）理由がこれで説明可能である。

図1. 推定される疫病菌の有性生殖システム

　今回、交配ホルモンの生化学・分子生物学的基盤の確立を目指し、以下の点を検討したので報告する。

(1) a１の受容体R^α１を特定するための蛍光プローブを合成し菌体の染色を試みた。

(2) 交配ホルモンはフィトールからa2を経てa1へと生合成されるため、a2の生合成に関わる酵素を探索した。

2. a1受容体探索用蛍光プローブ

2-1. 蛍光プローブの合成

　疫病菌の菌体におけるa1受容体の分布を調べるために蛍光プローブを合成した。a1の構造活性相関から分子の右側16位水酸基の修飾は活性を保持することがわかっていたので³⁾、この位置にリンカー（脂肪鎖、PEGおよびその組み合わせ）を介して蛍光基AlexaFluor488を結合した、「a1−リンカー−蛍光基」の基本構造を持つ蛍光プローブ1-3を合成した（図2）。

図2. a1受容体探索用蛍光プローブ

　まず、これらのプローブのホルモン活性を確認するためにA2交配型に投与したところ、a1に対する相対ホルモン活性はそれぞれ表1のようになった。そこで以降の実験は、活性の最も高いプローブ1を用いて行った。

表1. a1受容体探索用蛍光プローブのホルモン活性

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1. はじめに

　植物疫病菌（Phytophthora属糸状菌）は、世界三大植物病害の１つの原因菌として知られ、ジャガイモなどの重要農作物に感染し甚大な被害を与える。疫病菌は有性生殖により急速な変異（薬剤耐性化や悪性化）を起こすため、有性生殖のメカニズムの分子レベルでの解明は、疫病菌防除に繋がる重要な課題と言える。自家不和合性（ヘテロタリック）疫病菌種の有性生殖は、2つの交配型A1とA2が出会うことで開始されるが、その際、相手が分泌する交配ホルモン（a1とa2）を認識している^{1), 2)}。これまでに両ホルモンの構造、生合成前駆体、構造活性相関³⁾などの化学的基盤が整ったが、その生理的意義や生合成機構などケミカルバイオロジー的課題が未解明である。

　現在のところ、交配ホルモンの生合成経路は次のように推定している（図1）。

① A2交配型がa2合成系（酸化酵素？）を使ってphytol（植物由来）の2箇所を水酸化（11,16-ジヒドロキシル化）することによってa2を生合成し細胞外に分泌する（遊離したa2がA1交配型の有性生殖を促す）。

② A1交配型が分泌されたa2を取り込み、a1合成系（酸化酵素？）使ってa2をさらに酸化することによりa1を生合成し細胞外に分泌する（遊離したa1がA2交配型の有性生殖を促す）。

図1. 疫病菌の有性生殖を促す交配ホルモンa1, a2とその生合成経路

　今回、交配ホルモン生合成機構の解明を視野に、交配ホルモンの産生に影響を与える因子について以下の点を検討したので報告する。

(1) 菌株と培養日数

(2) 培地の種類

(3) 汎用培地V8 ジュース成分の効果

2. 菌株と培養日数

　異なる交配型を含む数種の疫病菌株（P. nicotianae、P. cryptogea、P. capsiciおよびP. cinnamomi）を、phytol（a2前駆体）あるいはa2（a1前駆体）を添加した20%

液体培地で振とう培養し（27 ℃、80 rpm）、培養上清をLC/ESI-ITMSで定量分析することによって、1週間の交配ホルモン産生量の経時変化を調べた（図2）。

図2. 交配ホルモン産生量と培地のpHの経時変化（値は平均値）

　その結果、菌株を4つのタイプに分類できることがわかった。まず、a2をa1に変換するとされるA1株（P. nicotianae38607およびP. cinnamomi 33180）では、a2は添加1日後からa1に変換され、2〜3日で最大になった後、pHの上昇（菌体生長にほぼ同期）とともに減少する傾向が見られた。第二にphytolをa2に変換するとされるA2株（P. nicotianae38606およびP. nicotianae 33190）では、a2ホルモンの産生量の増加はpH上昇と同期していた。第三として、A2株でありながらa2は検出されずa1のみを産生する株（P. cryptogea32326、P. capsici 30698およびP. cinnamomi33181）も見出された。この中でP. cryptogea 32326のa1産生量はA1交配型のそれを大きく凌ぎ、その経時変化は菌体の生長に伴うと考えられる培地のpH上昇とほぼ同期していた。第四のタイプはP. capsici 8386 (A2)で、a1、a2両ホルモンの産生が見られた。産生量は2日目以降増加していたが、生長に伴うpHの上昇は見られなかった。以上の結果より、交配ホルモンの生産パ

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Pyricularia zingiberi, causal organism of blast disease of mioga (Zingiber mioga), sporulated moderately in the dark. Sporulation of the fungus was enhanced by ultraviolet radiation shorter than 380 nm. On the other hand, blue light (390-540 nm) suppressed the sporulation. Incidence of blast disease of mioga was reduced to less than 10% in ultraviolet absorbingvinyl film greenhouse as compared with incidence levels in a common agricultural vinyl film greenhouse.

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In the course of a screening program for specific inhibitors of human topoisomerase I using a recombinant yeast, we have discovered two new active compounds in the culture broth of a fungus, Phoma sp. BAUA2861. We designated these compounds as topopyrone A (1) and B (2). The physico-chemical properties of 1 and 2 are summarized in Table 1. The molecular weight of 1 and 2 were deduced to be 372 from m/z 371 [M-H^-] in ESI-Neg. and the presence of one chlorine atom was indicated by a peak intensity ratio of isotope peaks. The molecular formulae of 1 and 2 were finally established as C_<18>H_9O_7Cl by HRFAB-MS. Treatment of 1 with an excess of diazomethane afforded the methyl derivative (3) whose HREI-MS gave the molecular formula C_<22>H_<17>O_7Cl. The ^1H and ^<13>C NMR data of 3 are summarized in Table 2. As a result of 2D correlation NMR experiment, these signals were assigned as shown in Fig. 2. Acetylation of 1 gave triacetate (5), which had no epoxide ring. These results indicated that epoxide ring of 3 was formed by addition of diazomethane with loss of N_2 to the ketone of 1. Methylation of 2 with diazomethane gave compound 4. From the result of 2D correlation NMR experiment, the ^1H and ^<13>C NMR data of 4 (Table 2) was assigned as shown in Fig. 3. The structures of 1 and 2 were thus elucidated as shown. Topopyrone A (1) and B (2) inhibited selectively recombinant yeast growth dependent on expression of human topoisomerase I with IC_<50> value of 1.22ng/ml and 0.15ng/ml, respectively. The activity and selectivity of 2 were comparable to those of camptothecin. The relaxation of supercoiled pBR322 DNA by human DNA topoisomerase I was inhibited by these compounds as potently as by camptothecin. 1 and 2 were cytotoxic to all the tumor cell line when tested in vitro, but slightly weaker than camptothecin. We also found that 2 has a potent inhibitory activity against herpes virus, especially varicella zoster virus (VZV). It inhibited VZV growth with EC_<50> value of 0.038μg/ml, which is 24-fold stronger than that of acyclovir (0.9μg/ml). 1 and 2 were inhibitory to Gram-positive bacteria including quinolone-resistant MRSA.

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本実験は, Aphanomyces属菌を罹病組織から分離する際に用いられている Bacto-CMA とこれに添加されている各種の殺菌剤を用い, A. iridis卵胞子の発芽を調べたものである. 得られた結果は以下のとおりである.
1. 本菌の卵胞子は顕微鏡(低倍)下で容易に形態的に完全と不完全の卵胞子に分けることができた.
2. FDLとCMDの培地は完全な卵胞子形成のための良好な培地であった. FDL培地で25℃, 2週間培養すると, 最も高い発芽率をもつ完全な卵胞子が得られた.
3. 卵胞子の発芽適温は25℃附近, 最適pHは約6.4であった.
4. クロラムフェニコールは用いた100ppmまでの濃度で発芽阻害作用を認めなかった. 同様に, ストレプトマイシン硫酸塩やバイコマイシンも用いた各80, 400ppmまでの濃度で阻害作用を認めないか, 反復すると中間の濃度でやや阻害的であった.
5. アソフォテリシン B, ベノミル, イプロジオンは各5, 0.5, 50-100ppm以上の濃度で明らかな阻害作用を認めた. ベノミルは0.5-1ppmの低濃度でも阻害力を保持していた. また, メタラキシルは用いた中間の濃度で, チォファネートメチルは10-50ppm以上の濃度で共に阻害的であった.

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　ヒシ白絹病菌（Corticium rolfsii）の水面浮上性菌核と水中沈下性菌核の発芽様式を比較観察した．両者は，外皮を解剖針で付傷すると付傷部位からのみ噴火状に発芽し，アンチホルミンで処理すると菌核表面から全面的に発芽し，菌糸状となった．乾燥処理した菌核の発芽は，浮上性菌核の方が沈下性菌核より早く，噴火状に発芽する割合も高かった．また，乾燥処理した菌核のインゲンマメ胚軸上での発芽は，浮上性菌核の方が沈下性菌核より早く，インゲンマメに対する病原性も強かった．両菌核とも，発芽時には外皮周辺の細胞の形態が変化しており，それより内部の細胞から出芽した．アンチホルミン処理あるいは乾燥処理を行った菌核の外皮は，無処理菌核と比較して皮膜との結合状態が緩く，この傾向はアンチホルミン処理菌核で顕著であった．

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　ヒシから分離された白絹病菌（Sclerotium rolfsii）15菌株およびヒシ以外の各種植物からの白絹病菌27菌株を供試して，菌核の水面浮上性に対する照明の影響について検討した．V-8寒天培地上に形成された菌核は，ヒシからの分離菌およびヒシ以外の植物からの分離菌ともに，照明培養を行った場合は水面に浮上しやすく，無照明培養では水中に沈下しやすい傾向を示した．1日当たりの照明時間を変えて培養すると，数菌株を除いて，形成された菌核は1時間の照明でも約50%またはそれ以上浮上し，12時間照明するとほぼ100%浮上した．菌核の内部構造を比較すると，浮上性の高い菌株は低い菌株に比べて菌核細胞間の空隙が多く，この空隙は水面浮上性に関与していることが示唆された．

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This chronology is the fifth in a series of publications on comparative food cultures.

This particular installment will cover part of the Showa era from 1961 to 1988. Previously, the authors have examined Japanese food culture in the period between the Jomon and Azuchi-Momoyama eras, as well as the Edo, Meiji, Taisyo, and Showa eras (specifically, the part of the Showa period from 1926 to 1960).

The year 1988 marks a clear cutoff in food culture phenomena in terms of such events having a lasting influence on later generations of Japanese food culture; mirroring that endpoint, this chronology also stops in the same year. The authors have only recorded food culture phenomena lasting for approximately a quarter of a century. Incidentally, 1988 also marks the end of the Showa era.

The authors have compiled information on 408 chronological items from 222 sources, including 48 print publications and 174 electronic publications. Food culture phenomena are classified in this chronology in the same manner as previous papers in this series.

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