ウシ尿中EPF様物質による早期妊娠診断の可能性

抄録

【目的】超早期妊娠因子（Super-EPF）は，妊娠初期の母体血清中に検出される妊娠特異的なタンパク質で，ロゼット形成を抑制する。このロゼット抑制の有無を調べる試験（RITest）により妊娠診断の可能性が示唆されているが，技術的煩雑さから臨床応用には至っていない。当研究室ではRITestに代わる血清によるELISA法を開発している。本研究では，尿からもロゼット抑制力価を持つEPF様物質の検出が報告されていることから，非侵襲的で比較的容易に採取ができる尿を用いて，ELISAによる検出の可能性を探ることを目的とした。【方法】尿は人工授精日をDay0として，Day0および血清中のSuper-EPF濃度が最も高いと推察されるDay7に採取した。その後，遠心分離し上清を–20℃で保存した。融解後，10倍希釈し96穴プレートにアプライし4℃で一晩静置した。翌日，ブロッキングを行った後に，一次抗体は当研究室で作出したSuper-EPF抗体を，二次抗体はBiotin標識抗体を，標識酵素はStreptavidin-HRPを使用した。次に，TMBを添加し反応させ硫酸で反応を停止し，吸光度（A_450nm）を測定した。検定はStudentのt検定を用いてDay0とDay7の吸光度を比較した。また，各尿をイムノブロッティングに適用してEPF様物質の確認を行った。【結果】7頭のウシ尿（Day40以降超音波診断妊娠確定）をELISAに適用した結果，Day0とDay7を比較してDay7の吸光度が有意（P<0.01）に高いことを確認した。先行研究では，尿中にもRITestでEPF様物質の存在が報告されていることから，血清と同様に尿でもELISAによる妊娠診断が可能と推察された。現在，ROC曲線を用いてカットオフ値を選定中である。また，妊娠尿をSDS-PAGEにアプライし銀染色を行った結果，Super-EPFの分子量とされる21.5kDa付近にバンドが確認された。現在，ウエスタン・ブロッティングに適用し検討中である。