今回の発表では，CpISPS 酵素を構成するアミノ酸に変異を導入する手法を用い，酵素活性の観点から解析することでCpISPS の進化起源に迫った．まず，CpISPS の酵素反応におけるの立体構造ついて，タンパク質立体構造予測ツールのAlphaFold2 を用いて分子モデルを作製した．その結果，顕花植物由来のISPS 酵素のを構成する2 つの芳香族アミノ酸が，CpISPS にも保存されていた．この2 つの芳香族アミノ酸は，ISPS 酵素のの容積を縮 小し（Sharkey et al., 2013），ISPS の基質を特異的に認識させる一方で他のテルペン合成酵素の基質の認識を妨げていると考えられた．

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先に S. cerevisiae グルカンを希酢酸加水分解後, 水溶性画分を DEAE-cellulose カラムにより水溶出画分 (Fr. I_G)と, 0.05M食塩溶出画分(Fr. II_G)を得, 自己融解菌抗血清との反応性をみた結果, Fr. II_Gのみが反応することを報告したが, 今回両画分について次のことを報告した. 即ち, 両画分の比施光度, 過ヨウ素酸酸化, スミス分解, メチル化分析を行い, 両者ともグルコース残基の3位と6位で分岐し, β1→3結合の側鎖を有し, その鎖長はFr. I_G 5, Fr. II_G 8～9, S値は Fr. I_G 1.8, Fr. II_G 6.3であつた. concanavalin A に対しては両者ほゞ同程度の反応性があることから,自己融解菌抗血清の combining site の平均のsizeはグルコース残基5コまでは反応せず, より長い鎖長を要求することを討論した.

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膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる複核中心をにもっており、2分子の一酸化窒素（NO）から亜酸化窒素（N₂O）に還元する反応を触媒する。本研究では、NOR の構造を検討できる手法として核共鳴非弾性散乱（NRVS）に着目し、酸化型、還元型、配位子結合型試料の測定を行った。

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On the basis of the “subsite” concept, we tried to elucidate the active-site structure of the glucoamylase from Rhizopus niveus: The subsite structure, that is, the arrangement of the subsites and the affinity of each subsite, of the glucoamylase active-site was evaluated using the steady-state kinetic method described by Hiromi et al. The binding subsites for glucose, gluconolactone, maltose, isomaltose and some maltooligosaccharides were investigated by means of UV-difference spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry, and as to steady-state inhibition-kinetics and stopped-flow kinetics. Based on several lines of evidence, it was concluded that the nonreducing-end-glucose-residue of a substrate (in a productive mode) and gluconolactone, a transition-state analogue are bound at Subsite 1, at which one tryptophan residue is located. The tryptophan residue was clearly discriminated with the stopped-flow chemical modification with N-bromosuccinimide.

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一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる複核中心をにもつ膜結合型の金属酵素であり、2分子の一酸化窒素（NO）を2当量の電子とプロトンを利用し、亜酸化窒素（N₂O）に還元する。本研究では、核共鳴非弾性散乱（NRVS）測定によりNORのの詳細な構造情報を得ることを目的とし、その試料の調製法や測定条件を検討した。

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Liposaccharide component called "Lipid A" is a common structural unit of bacterial endotoxin, possessing most of the biological activities of endotoxin, e.g., lethal toxicity, pyrogenecity, adjuvant activity, antitumor effect and so on. Though the basic sturucture of lipid A has been recently established as 1, it exists in natural state as a mixture of congeners and analogs in fatty acid moieties and has never been obtained as a chemically pure substance. Therefore, synthetic approach to this lyposaccharide has been keenly requested particularly for the purpose of elucidation of the relationship between chemical structure and biological activity. We now describe the preparation of two acylated gulcosamine disaccharides 2 and 3 corresponding to the fundamental sturucture of Salmonella-type lipid A lacking phosphate moiety. While tetradecanoic acid was used for N- and O-acylations in 2, synthetic optically pure (R)-3-hydroxytetra-decanoic acid was employed for N-acylation in 3. Test of these synthetic liposaccharides for various biological activities of lipid A is now in progress.

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フェニルケトン尿症(PKU)は、フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)の変異による酵素活性の低下によって生じる、先天的なフェニルアラニン代謝異常である。近年、変異型PAHの酵素活性を回復させる低分子化合物(ファーマコロジカルシャペロン; PhC)が複数提案されており、PKU治療のための新規治療薬としての可能性を有している。より有効なPhC薬の分子設計のために、変異によるPAHの活性低下機構およびPhCの作用原理の理解が重要である。本研究では、分子動力学法によりこれらのメカニズムを解析した。この結果、PAHの熱運動が変異によって増大することが示された。この結果は変異によるの熱運動の増大によって酵素活性が低下することを示唆する。加えて、PhCの結合による変異型PAHの熱運動の安定化によって、酵素機能が回復されることが示された。

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膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる複核活性中心をもっており、2分子の一酸化窒素（NO）を2当量の電子とプロトンを利用して、亜酸化窒素（N₂O）へと還元する反応を触媒する。本研究では、NORの構造の詳細を調べるために、核共鳴非弾性散乱（NRVS）に着目した。に基質の類似体であるシアン化物イオンを結合させた試料の測定を行い、鉄とシアン化物イオン間の振動モードの帰属を試みた。

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近年、動植物の防御応答を誘導する共通的な機構として、微生物固有の分子パターン（MAMPs: microbe-associated molecular patterns）認識に基づく防御応答が注目されている。我々はこれまでにグラム陰性細菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖（LPS）がイネ培養細胞にプログラム細胞死を含む防御応答を誘導すること(1）、またLPSとキチンオリゴ糖の同時処理によってシナジー効果と呼ばれる相乗的な防御応答の増大を誘導することを明らかにしてきた。
一方、LPSの機能部位に関しては、動物の先天性免疫では分子中のLipid A部分が認識されることが報告されているが、植物が認識する構造については明確になっているとはいえない状況にある。そこで今回我々は、グラム陰性細菌Pseudomonas aeruginosa由来のLPSを用い、植物によって認識されるの構造を解析した。LPSを穏和な加水分解によってLipid Aと糖鎖部分に分解し、それぞれの活性を調べた結果、イネにおけるLPSの生物活性は主としてLipid Aによって担われていることが明らかになった。このことは、動植物におけるLPS認識機構の進化的保存性を示唆するものとして興味深い。
1)Desaki et al.,Plant Cell Physiol.,47,1530(2006)

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我々はグラム陰性細菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖(LPS)がイネ培養細胞にプログラム細胞死を含む防御応答を誘導すること¹⁾、また単独では防御応答を誘導しない様な低濃度で前処理することで後から処理したキチンオリゴ糖に対する防御応答を増大させるPriming活性を持つことを明らかにしてきた。さらに、最近の研究によってこのPriming活性が新規の遺伝子発現や植物ホルモンの蓄積に因らない活性であり、むしろLPSとキチンオリゴ糖のシナジー効果としてとらえるべきことを見出している。
一方、LPSの機能部位に関しては、動物の先天性免疫では分子中のLipid A部分が認識されることが報告されているが、植物が認識する構造は明らかでない。そこで今回、LPS合成系に変異を持つ微生物から抽出され、構造の明らかなLOSを用いることで²⁾、植物によって認識される構造を解析した。LOSがLPS同様の活性を示すことを確認したのち、穏和な加水分解によってLipid Aとコア糖鎖に分解し、それぞれの活性を調べた結果、イネにおけるLPSの生物活性はLipid Aによって担われていることが明らかになった。
¹⁾Desaki, Y. et al., Plant Cell Physiol., 47, 1530 (2006). ²⁾Alba, S. et al., ChemBioChem, 9, 896 (2008).

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Greene の黒色腫細胞を材料として所謂ゴルジ分画を分離し電顕的に観察すると，本分画内にはこりレジ装置の fenestratedsheet 構造のみならず GERLと考えられる嚢状，吻合状，管状構造及び coated vesicle と考えられる spheroid bodies よりなるヘテロな構成要素がみられた．　所謂ゴルジ分画の dopa incubation 後，蔗糖密度勾配遠心分画法により，本分画内 dopa 陽性沈読2次分画を分離し，検討した結果，木沈澄2次分画は主に嚢状，管状構造のGERL 及び coated vesicle よりなるとともに，酵素活性的にも tyrosinase 活性の高値， TPP ase 活性の欠如ないし乏値を示した．本所見より電顕細胞化学的に dopa 反応陽性ゴルジ lamella と従来いわれて来た構造は GERL であることが生化学的にも明らかになった．

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NADP依存性Isocitrate Dehydrogenase (ICDH) の等電点を異にする2つのIsozymeの構造と生理的機能の関係を解析する目的で, Cytosol由来の等電点の低いICDHを牛耳下腺から単離し, そのを構成しているアミノ酸残基について検討した。アミノ酸残基の修飾は, Methylene blue (M. B) を増感剤とした光酸化と, Muhlrad9) らその他の方法に準じた, Diethylpyrocarbonate (DEPC) によるAcyl化の方法を使って測定した。その結果, 1) M. Bに よる光酸化では, His. 残基のpH依存性パターンと類似性を示した。2) DEPCでAcyl化されたHis. 残基は, ICDH1分子当り4ケ, 光酸化で失活したICDHでは2ケだけであった。3) NADPは, 光酸化, DEPC処理, 何れの場合にもICDH活性をprotectするが, 基質ではその効果が認められなかった。以上のことから, このICDHのとしてNADPを結合する部位は, 基質結合部位とは別の所に位置し, 活性発現に必須のものとして, 1分子当り, 少なくとも2ケのHis.残基を含んでいると考えられる。

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