大腸癌切除例40例の新鮮凍結連続切片を用いAgNOR dot数,α陽性細胞率(positive rate:PR)を算出した,これらと臨床病理学的事項との関連性,およびAgNORとαとの相関性を解析した.臨床病理学的事項との関連では,AgNOR数は肝転移陽性例は陰性例に対して,リンパ節転移陽性例は陰性例に対して有意に高値を示した(p<0.05).Dukes'stageに関しても有意の関連を認めた(p<0.05).α PRでは臨床病理学的事項との間に有意の関連を認めなかった.またAgNORとαの間に相関性をみなかった.以上より,AgNORは細胞増殖に直接関与する因子ではなくαとは独立した因子であることが示唆された.また肝転移,リンパ節転移を予測する指標となり得ることが示された.

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エールリッヒ腹水癌細胞の核小体を部分精製したところ, 既に知られている三種のポリメラーゼが存在していることが, 明らかになった. 単離した核小体を, 超音波処理して可溶化した上清をDEAE・カラム・クロマトグラフィーで分画化した. DEAE・カラムから, 0.08M NaClでも溶出して来る第Ⅰ分画に存在するは, N-エチルマレイミドに対する感受性は少なく, 至適pHは, 8.0であり, 一方, 0.15M NaClで溶出して来る第Ⅱ分画は, N-エチルマレイミドで強く阻害され, 至適pHは7.5であった. 第Ⅰ分画にはβ, 第Ⅱ分画にはαが含まれているものと考えられる. 第Ⅱ分画および0.4M NaClで溶出される分画には, γが存在することも分かり, 核小体には, 核で見出されているα, βおよびγの三種類の総てが存在していることを確認した.

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色素体とは植物細胞内存在する葉緑体やアミロプラスト、白色体など、2重の膜に包まれたオルガネラの総称である。細胞内共生により生じた色素体には独自のDNAが存在し、核とは異なるDNA複製・修復機構を持っている。細胞の分裂に伴って色素体DNAも複製するが、その機構については不明な点が多い。
以前、私達は始めて色素体内で機能するのcDNA(OsPolI-like)を単離し、同定した。この種はバクテリアのIと相同性があり、真核生物のの分類のAファミリーに属する。このは真核生物においてこれまで発見されているどのクラスにも属さないため、今回私達は新たにπ(POLP)という名前を提案するとともに、イネ細胞内に存在する2種のPOLPのうちの1つであるOsPOLP1の全長組換えタンパク質の酵素活性の特性について紹介する。さらに、これらの結果から、色素体DNAの複製修復様式について議論したい。

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我々はタバコ培養細胞BY-2からバクテリアの Iと相同なタンパク質をコードする遺伝子を二つ（NtpolI-like 1およびNtpolI-like 2）単離した。両遺伝子産物はいずれも分子量128kDa、アミノ酸レベルで互いに97.2%相同であり、122kDaに切断されて色素体に局在すると推定された。また、大腸菌内で発現させたNtpolI-like2のドメインはin vitroで 活性を示し、その性質は単離色素体核（核様体）中に存在するの性質と一致した。これらの結果から、NtpolI-like 1/2遺伝子産物は、いずれも色素体で働くであることが強く示唆された。しかし、作成したNtpolI-like2に対する抗体を用いたウエスタン解析の結果、単離色素体核だけではなく単離ミトコンドリア核中にも抗体によって認識される分子量約120kDaのタンパク質が存在することが明らかになった。この結果は、NtpolI-like1/2遺伝子産物のどちらか、または両方がミトコンドリアでも機能しているか、あるいはそれに極めて類似したミトコンドリア型が存在することを示し、植物のミトコンドリアと色素体のは互いに酷似しているという我々のこれまでの主張に合致する。現在、NtpolI-like1/2遺伝子産物の細胞内局在、ならびに両オルガネラに存在する の異同について、さらに検討を進めている。

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盛んに増殖をしているマウスのエールリッヒ腹水癌細胞から核および核小体を単離精製し, そこに存在するの諸性質およびその含量を検討した. 細胞内でのの分布を調べるに当って, これら酵素の細胞内分布は, 細胞をホモジェナイズする溶液等によって左右され易いので, 全く異なる2つの方法で, 核を単離した. 1つは低張液, MgCl₂および界面活性剤であるNonidet P-40を用いる方法で, 他は等張液とCaCl₂のみで, 界面活性剤は用いない方法である. 核, 核小体およびクロマチンから を抽出し, DEAE-セルロース・カラムクロマトの後, α, βおよびγを夫々選択的に測定した. 核と核小体では, 夫々のDNA含量に比例しでも存在した他, 核小体クロマチンにも強く結合しているが存在したので, その複製に関与していることを示唆している.

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抗がん機能性食品素材の開発を目指して, 天然材料からDNA合成酵素 () 阻害物質を探索したところ, 乾燥グァバ葉の50%エタノール抽出物「グァバ葉(1)」に強い活性を見出した。また, 疎水クロマトグラフィーで粗精製した「グァバ葉(2)」には, より強い活性があった。一方で, 抗がん作用が知られているアガリクス粗精製物についても阻害活性があることを見出したので, グァバ葉とアガリクスを混合して併用効果を調査した。その結果, 複製型であるαに対しては, 阻害の相乗効果がみられたが, 修復型であるλについては, 阻害が減弱した。

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Recently, it was shown that the synthetic polymers, poly rA·oligo dT and poly rCm·oligo dG were effective template-primers for assaying reverse transcriptase originated from RNA tumor virus. These template-primers have been used for distinguishing reverse transcriptase from DNA dependent DNA polymerase (DNA polymerase β or γ). Reverse transcriptase activities were estimated in leukemia and hemopoietic dysplasia. They were five cases of AML, one case of APL, one case of AMoL, two cases of CML, three cases of hemopoietic dysplasia, three cases of ALL and one case of hairy cell leukemia. DNA polymerase activities and the ratio of DNA polymerase activities were measured by different template-primers, poly rA·oligo dT, poly rCm·oligo dG and poly dA·oligo dT.
As a result, reverse transcriptase activities were found in one case of AML, two cases of hemopoietic dysplasia, one case of APL and one case of hairy cell leukemia. It is especially noted that reverse transcriptase activities have been found in two cases of hemopoietic dysplasia. They should be measured repeatedly during the clinical course of these patients. It is inferred from these results that RNA virus might be concerned to the etiology of some cases of human leukemia.

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切除された大腸癌および大腸腺腫に対し抗αモノクローナル抗体を用いてその増殖能を同定し, 病理組織所見との関連について検討した. 腫瘍細胞1000個あたりのα陽性細胞率をα labeling index (L.I.) として算出したところ, 大腸癌ではL.I.: 51.6%で大腸腺腫のL.I.: 28.6%に比べて有意に高かつた. 大腸癌のL.I.は stage が進行するにつれて, また壁深達度が深くなるにつれて高値を示した. 一方, 大腸腺腫におけるL.I.は, その異型度が高度になるにつれて高値となる. L.I. は大腸癌および大腸腺腫の生物学的悪性度および組織学的異型度の判定に有用と思われる.

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我々はタバコ培養細胞BY-2からバクテリアIホモログのcDNAを2種類単離し、対応する遺伝子をNtPolI-like1およびNtPolI-like2と名付けた。両遺伝子はアミノ酸および塩基配列レベルで97-98%と、実質的に同一といってよいほどの高い相同性を示す。遺伝子産物は活性をもち、色素体とミトコンドリアの両方に輸送され、色素体核およびミトコンドリア核の両方に存在すること、その分子量や生化学的性質はオルガネラ核に含まれる活性のそれと一致することが明らかになっていた。さらに、オルガネラDNA合成が一過的に活発化する時期にNtPolI-like転写産物が一過的に増加することも分かっていた。今回、転写産物レベルだけではなく、単離オルガネラ核中に含まれるNtPolI-likeタンパク質量も、植え継ぎ直後の細胞増殖ごく初期に一過的に増加することを確認したので報告する。NtPolI-likeタンパク質量の変化は、オルガネラのDNA合成活性や活性量の変化と極めてよく一致しており、NtPolI-like産物が細胞増殖初期に見られる一過的なオルガネラDNA合成の活性化に関与するであることを強く示唆する。現在、NtPolI-likeの発現とオルガネラDNA合成活性との関係についてさらに検討中である。

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Yファミリーは細菌からヒトまで広く生物界に存在し、その特徴は鋳型DNA上の損傷部位（例えばピリミジン２量体）を乗り越えて複製を行う点にある。一方、活性酸素などによる損傷は、DNA鎖上ばかりでなく、その前駆体となるヌクレオチドプール中のdNTPにも起こる。このdNTPの酸化は、自然突然変異や発がんの有力な原因と考えられている。ヌクレオチドプールの酸化により生ずる8-OH-dGTPと2-OH-dATPが、YファミリーによりどのようにDNA中に取り込まれるかを検討した。
我々はこれまでに、ヒトのＹファミリーの一つであるη(pol η)が、8-OH-dGTPを鋳型鎖のAの向かいに取り込み、2-OH-dATPをTとGの向かいに取り込むことを報告している。今回、さらに詳細な検討を行うために(i) pol ηの反応速度論的解析と(ii)大腸菌を使ったin vivoの実験を行った。(i) pol ηがAの向かい側に8-OH-dGTPを取り込む効率(kcat/Km)は、正常なdTTPを取り込む効率の約60％であった。またpol ηは2-OH-dATPをTの向かい側だけでなくCあるいはGの向かい側にも取り込んだ。(ii) Superoxide dismutaseをコードするsodAsodB両遺伝子と、鉄の取り込みのregulatorをコードするfur遺伝子を欠損した大腸菌株の高い自然突然変異はDNA損傷ではなく酸化dNTPに基づくが、この変異は大腸菌のYファミリーをコードしているdinBとumuDCのどちらか一方あるいは両方を欠損させると80％以上消失した。
以上の結果は、Yファミリーが、鋳型DNA上の損傷部位を乗り越えて複製を行う以外に、酸化dNTPをDNA中に取り込むことで突然変異を促進する可能性を示唆している。

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DNAは損傷部位において突然変異が誘発される。この突然変異誘発機構にDNA損傷部位を乗り越えてDNA 複製を行うTLS(translesion　synthesis) が関与している。突然変異誘発機構はDNA修復機構であるとともに染色体の維持に必要不可欠な機能である。TLS の一部は、一次構造上の類似モチーフの存在からYファミリー と分類される。ショウジョウバエで同定されたdRad30A, dRad30B, dRev1は このファミリーに属している。我々の研究室ではin vitro の系で、これらいずれの遺伝子産物も損傷を乗り越えるDNA合成活性を持つ事が明らかにしてきた。近年、人でREV1タンパク質がYファミリー のTLS （Polh, Poli, Polk）と相互作用する事が明らかとなった。また、これらのTLS はPCNAとも相互作用する。このことは、TLS がDNA損傷部位において重要なDNA複製機能があるとこを示唆している。我々は、突然変異誘発機構を調べるために、ショウジョウバエのTLS の機能解析を行っている。我々はショウジョウバエにおいてdRad30A, dRad30B, dRev1の相互作用を調べた。dRad30Aは、dRev1と相互作用するのに人より1箇所多い2箇所のFF配列が重要であることがわかった。またdRad30Aは人から保存されているdRev1のC末で相互作用する事がわかった。dRad30Bは、dRev1と複数のドメインで相互作用し、dRev1のBRCTドメインで相互作用する事がわかった。また、イーストのツーハイブリッド法により幾つかの候補遺伝子も同定した。その遺伝子のうち一つについて解析を行ったのでこれについても報告したい。

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アヒル血中にHBウイルス類似のウイルスが存在する事が報告されてきた.今回著者らはアヒル血清中の活性を計59羽のアヒルより得た204検体にて測定,DHBV陽性群4,113cpm/0.2ml,陰性群530cpm/0.2mlと有意差(p<0.01)を認め,更に電顕によるウイルス様粒子の多寡と活性値との間に相関を認めた.更にCsCl2を用いたウイルス様粒子の分離精製によりDane粒子様のDHBV-Type-1粒子には高値の活性とDHBV-DNAを,球状DHBV-Type-2粒子には活性は低く,蛋白含量の多い事を明らかにした.又アヒル肝病変との対比により,病変の進行度とDNA-P活性は逆相関する事を認め,これらはHBVとDHBVが類似している事を示唆すると考えられた.

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　植物・藻類では、オルガネラゲノムの複製酵素は同定されていない。ゲノムプロジェクトによりゲノム塩基配列が決定されたArabidopsis thalianaや単細胞性紅藻Cyanidioschyzon merolaeには、ミトコンドリアの複製酵素と考えられているγは存在していない。C. merolaeの核ゲノムから、大腸菌Iと相同なをコードする遺伝子が2個見つかった (PolA、PolBと呼ぶ)。
　PolAとPolBの細胞内局在を、GFPと単離プラスチドについての免疫ブロットで調べた。これらの結果から、PolAとPolBはプラスチドとミトコンドリアの両方に局在することが示唆された。PolAとPolBをチオレドキシンとの融合タンパク質として発現、精製し酵素活性を測定した。PolAとC. merolaeのプラスチド核様体のDNA合成活性に対する阻害剤の効果を調べた。その結果、100 μM ddTTPを加えた時PolAの活性はほぼなくなるが、プラスチド核様体の活性は半分になった。この結果は、C. merolaeのプラスチド核様体には2種類のが存在することを示唆している。現在、C. merolaeの同調培養を行っており、細胞周期におけるPolAとPolBの発現パターンを調べる予定である。

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HBV(hapatitis B virus)キャリアの重症化例19例(プロトロンビン時間またはヘパラスチン時間<40%)にインターフェロンと免疫抑制剤を投与し,9例(47.4%)が生存した{劇症化例13例中5例(38.5%)が生存}. 治療前陽性者10例中が治療1週間後に陰性化した5例と低値(陽性)で推移した1例は生存した. 一方, 治療1週間後に有意に低下しなかった4例はすべて死亡した. 治療前陰性者4例中2例が生存, 2例が合併症により死亡した. 以上よりHBVキャリアの重症化例では治療によりHBV増殖が1週間以内に抑制された場合, 生存の可能性が高いと考えられた.

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ヒトには14種類のが存在し、アミノ酸配列の相同性に基づきA、B、X、Yの4ファミリーに分類される。Xファミリーは、β(polβ)、λ(polλ)、μ(polμ)から構成される。Xファミリーは、DNA修復反応時に、損傷し欠失したDNAを合成する。polβ及びpolλは、塩基除去修復に機能し、polλ及びpolμは、DNA二本鎖切断修復機構である非相同性末端結合(NHEJ)に機能すると考えられている。多くのDNA修復関連タンパク質は、DNA損傷時に損傷部位に集積する性質を示す。polβ及びpolλもまた、DNA損傷部位へ速やかに集積することが生細胞タイムラプス観察によって示されている。しかし、polμのDNA損傷部位への集積については、未だ生細胞を用いて観察されていない。我々は、polμのDNA損傷部位への集積機構を明らかにするために、パルスレーザーを用いて導入したDNA二本鎖切断部位へのpolμの集積をタイムラプス観察した。polμは、迅速にDNA損傷部位へ集積し、5分以内に損傷部位への集積が飽和した。polμは、polβが集積を示す、一本鎖DNA切断部位や塩基損傷部位への集積を示さなかったことから、DNA二本鎖切断部位へ特異的に集積していると考えられた。また、FRAP法及び光変換タンパク質を用いた解析によって、DNA損傷部位に集積したpolμと核質に存在するpolμは容易に入れ替わることが示された。さらに、polμ内のDNA損傷部位への集積に機能する領域を同定するために、polμの欠失変異体を用いてDNA損傷部位への集積を観察した。その結果、BRCTドメインを含むN末端領域、DNA結合領域であるHhHモチーフを含む領域、C末端領域のいずれも、DNA損傷部位へ集積することが示された。しかし、完全長polμに比べ、集積の遅延や集積量の減少が観察された。これらの結果は、polμのDNA損傷部位へ集積には少なくとも3つの領域が必要であることを示唆している。

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今までに報告された主なDNA塩基配列決定技術を紹介するとともに, それぞれの化学反応を論じる。おもに, ピペリジン処理によるDNA鎖の配列特異的化学切断を利用したマクサムとギルバートの方法, サンガーの開発したによるDNA合成を利用したジデオキシ法について解説する。また, 放射能標識を使わずに, 蛍光標識を用いた塩基配列決定法および耐熱性を利用した最新のシークエンシング技術についても紹介する。

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