腎障害は、医薬品開発において肝障害と並び懸念される副作用の1つである。従来、非臨床安全性試験では腎障害バイオマーカー（BM）として血中尿素窒素（BUN）、血清クレアチニン（sCre）、尿中総タンパク（uTP）及び尿中N-アセチル-グルコサミナダーゼ（NAG）等が使用されてきた。しかしながら、BUN及びsCreは腎臓に器質的変化が生じるまで変化しないことや、NAGは酵素活性があるためばらつきが大きいなどの問題を抱えている。従って、これら古典的BMは感度と特異性において十分とは言い難く、より早期かつ特異的に腎障害を検出できるBMが求められている。現在、これら問題を解決すべく、非臨床分野において新規腎障害BMが多く報告されており、特に試料採取時に侵襲性の低い尿中BMが注目されている。
　非臨床分野ではPSTC（米国Critical Path Instituteの安全性予測試験コンソーシアム）から7種（uTP、β2-マイクログロブリン、Cystatin C、Kidney injury molecule-1（Kim-1）、アルブミン、クラスタリン、Trefoil Factor 3（TFF3））^1）、臨床分野では腎臓病学の国際的組織であるKDIGO（Kidney Disease: Improving Global Outcomes）から5種（L-FABP、Cystatin C、Neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL）、Interleukins、Kim-1）^2）の尿中BMが提唱されており、日本腎臓学会のCKD診療ガイドライン2013^3）にも新規尿中BM（uTP、アルブミン、α1-マイクログロブリン、β2-マイクログロブリン、L-FABP）の有用性が記載されている。また、薬剤性腎障害診療ガイドライン2016^4）にもL-FABPとNAGが記載され、最近では日本腎臓学会を含む5学会合同でAKI（急性腎障害）診療ガイドライン2016^5）が発行され、AKIの早期診断におけるL-FABPとNGALの有用性が記載されている。
　我々は、これらの内、本邦発のBMで日本及び欧州において腎尿細管障害の体外診断薬（尿細管機能障害を伴う腎疾患の診断の補助）として認可されているL-FABPに着目し、非臨床安全性試験への応用を検討し、非臨床から臨床への橋渡しを目指している（図１）.

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　薬物が心臓の機能に及ぼす影響について評価する際には、カテーテル法や超音波検査法といった手法を用いて測定が行われている。カテーテル法は、観血的な測定法であるため血管内にカテーテルを入れる必要がある。一方、超音波検査法では、生体に超音波をあて、その反射やドップラー効果・反響・透過の状況を確認する非観血的な測定法であるため、カテーテル法に比べ侵襲が少ない。そのため、動物への負担を軽減した心機能の反復測定が可能で、毒性試験へ組み込んで長期投与中の経時的な心機能変化を測定することができる。また、心臓の大きさや壁の厚さといった形態的な評価ができる他、心臓の壁や弁の動き、心臓内の血流情報を評価することも可能である。さらに、非侵襲的検査であるため臨床でも広く利用されており、ヒトの臨床試験で得られたデータを非臨床試験においても同じ測定方法で得られたデータと比較することが可能である。

　本稿では、薬物投与時の超音波検査法とカテーテル法のデータの比較、モデル動物作製時の心臓の壁や弁の動き並びに心機能の変化など、超音波検査法を用いて測定した動物のデータを紹介し、心臓超音波検査法による薬物安全性評価の有用性について考察する。

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Atopic dermatitis is a chronic skin disease that causes various symptoms such as itchy eczema, dryness, and redness, with repeated exacerbations and remissions. In order to examine the effect of tacrolimus on the symptoms of atopic dermatitis, we evaluated skin functions, scratching behavior, and inflammation using atopic dermatitis models of hairless mice and NC/Nga mice.

Female Hos: HR-1 hairless mice were fed a special diet (HR-AD) and applied the mite antigen ointment to induce dermatitis symptoms. Female NC/Nga mice were only applied the mite antigen ointment. Before and after induction, skin functions (skin moisture content, transepidermal water loss, viscoelasticity), scratching behavior, skin inflammation scoring were evaluated. After application of tacrolimus, serum IgE concentration, cytokine in the auricle, and histopathological findings were evaluated.

As a result, a decrease in skin functions, an increase in scratching behavior, and an exacerbation of inflammatory symptoms were observed in both models. Although application of tacrolimus improved skin function and inflammation, the hairless mouse model tended to show scratching behavior. Both evaluation methods were considered useful to evaluate the symptoms of atopic dermatitis.

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Information obtained from biodistribution tests conducted in non-clinical studies is important in the development of regenerative medicine products.

Some evaluation methods have been reported for detecting administered human cells, including quantitative PCR (qPCR), flow cytometry (FCM), and immunohistochemical staining (IHC). Since each product has its strengths and weaknesses, it is necessary to develop an optimal evaluation method for each product.

In a previous study, we measured human mesenchymal stem cells (hMSCs) in the blood of mice using qPCR and FCM methods. As a result, differences in hemodynamics were observed depending on the time elapsed after administration, suggesting that differences in measurement methods may have an effect.

In this study, we developed qPCR and IHC analysis methods to evaluate the distribution in mouse tissues, and compared the bio-distribution of hMSCs 30 minutes after administration.

In the qPCR method, the number of hMSC cells was calculated using the standard curve method and compared between each tissue, and 3931 to 4530 hMSC cells were detected in the lungs.

In the IHC method, immunostaining using anti-HLA (class 1 A, B, C) antibodies was performed on the lungs, liver, spleen, cerebrum and cerebellum, kidneys, and heart, and HLA-positive cells were found in the blood vessels of the lungs. It was seen here and there.

There is little knowledge of evaluating the same sample using different measurement methods, and it is hoped that the results of this study will help in selecting evaluation systems when developing regenerative medicine products.

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GLP施設での電子データ管理として，スタンドアローン仕様で利用され，電子データを生データとして使用されている分析機器を例としたデータインティグリティ確保のための運用管理方法，標準書操作手順書や教育記録の電子化，試験計画書・試験報告書への電子署名システムの利用等を紹介する．

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Many regenerative medical products (human cell/tissue-based products) are recently under development, and non-clinical safety studies for regenerative therapies are requested.

Especially, a biodistribution assessment of drugs is the most important. Many methods, such as quantitative polymerase chain reaction (qPCR), flow cytometry (FCM) and immunohistochemistry, have been reported for detecting human cells in animals. Since each detection method has both advantages and disadvantages, an optimal assessment system is needed for each product.

The purpose of this research was to validate qPCR and FCM methods for analysing blood concentration of human mesenchymal stem cells (MSCs) in mice. Human specific Alu PCR was applied for the quantification of human MSCs in mice blood. Antibodies to human MSCs specific cell surface markers (CD73, CD90 and CD105, positive MSCs markers) were analysed for FCM. Both methods were compared on same blood samples from male immunodeficient mice administered human MSCs intravenously. Parameters (accuracy, precision, sensitivity) were evaluated for both qPCR and FCM methods. Blood samples were collected by continuous blood sampling and were divided for qPCR and FCM methods. A standard curve for measuring cell counts of human MSCs was constructed.

We will report the assay methods to detect human cells in mice by using qPCR and FCM methods.

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社会の高齢化に伴い、がん患者は増加傾向にある。近年におけるがん治療法の進歩は目覚ましく、分子標的薬を含む新規抗がん薬開発によりがん患者の予後は著しく改善している。従来の低分子抗がん薬は一般的に正常細胞を含めた不特定の細胞を標的としていたが、分子標的薬はがん細胞の表面に発現するタンパクや遺伝子などがん細胞特有の分子を標的とする。分子標的薬の副作用は、従来の低分子抗がん薬と比較して軽度であると考えられていたが、EGRFファミリーの阻害作用を有するトラスツズマブ（抗HER2抗体薬）はHER2陽性乳がんに対してアントラサイクリン系抗がん薬との併用により、単独投与と比較して心毒性の頻度が高まることが複数の臨床試験により明らかにされている。抗がん薬の併用投与における循環器へのリスク評価が課題になっているため、今回我々はマウスを用いて分子標的抗がん薬による新たな心毒性評価法を構築した。

トラスツズマブ及びドキソルビシンを雄性マウスにそれぞれ20又は3 mg/kgの投与量で週1回、単独または併用で10週間投与し、心機能を経時的に評価した。投与前、投与第1、2、4、6、9週及び剖検前日にイソフルラン麻酔下で心電図及び心エコ―検査を行った。心電図検査ではP、Q、R、S波、QRS幅、PR間隔及びQT間隔を、また、心エコー検査で左室の収縮能及び拡張能並びに右室機能評価を行った。加えて、臨床現場で心毒性診断の主流となっている心筋ストレインを測定した。また、剖検日に血液学及び血液生化学的検査を行い、血漿中の心筋トロポニンI、BNP濃度を測定し、摘出した心臓の病理組織学的検査、免疫組織化学的検査及びreal-time PCR検索を行った。今回、これらの心毒性評価法の検討結果について報告する。

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Allergic contact dermatitis is caused by substances such as plants, animals, medicines, metals and foods, and the skin barrier dysfunction causes the skin symptoms such as drying, itching and red flare. It was generally difficult to monitor the status of drying and itching. In order to quantify the skin function and scratching behavior and to determine the status of symptoms, we tried to develop the evaluation method for the drying and itching by atopic dermatitis model in hairless mice.

To produce symptoms similar to atopic dermatitis, female Hos: HR-1 hairless mice (Japan SLC Inc.) were fed a special diet (HR-AD) and applied the mite antigen ointment (Biostir AD®) to induce itching and drying. Before and after induction, skin moisture content, TEWL (transepidermal water loss) and viscoelasticity were measured by a Cutometor MPA580 (skin function measurement device), and scratching behavior was analyzed using the animal motion analysis system (ANIMA). Skin inflammation scoring, IgE concentration in the blood, cytokine (multiplex method) in the auricle related to inflammatory response, and histopathological findings were quantitatively evaluated the correlation with skin function and scratching. In addition, the improvement effect of tacrolimus on the skin symptoms was investigated by this quatification method.

In this conference, we will report not only this study result also the result comparing with “the skin toxicity evaluation of atopic dermatitis in NC / Nga mice” published last year.

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【目的】皮膚毒性の中でも皮膚障害の指標となる掻痒及び皮膚機能低下（水分含有量等）を検出し，定量化することは困難である．今回我々は，NC/Ngaマウスを用いて痒み及び乾燥を引き起こすアトピー性皮膚炎モデルを作製し，掻破回数，皮膚水分含量，経表皮水分蒸散量及び皮膚弾力性を測定し，痒み及び皮膚機能の評価方法を検討した．

【方法】NC/Ngaマウスに，ダニ抗原（ビオスタAD^®）を週2回，5週間塗布し，アトピー性皮膚炎に類似した症状を誘発した．誘発前及び誘発後，皮膚計測器（キュートメーター）を用いて経時的に皮膚機能（皮膚水分含量，水分蒸散量及び皮膚弾力性）を測定し，誘発後5週目に行動測定解析システム（ANIMA）を用いて掻破回数を測定した．また，皮膚炎症状のスコア評価，血中IgE濃度，皮膚の病理組織学的検査を実施し，掻痒及び皮膚機能評価との相関性を確認した．

【結果】ダニ抗原誘発モデル群では，正常群と比較して皮膚水分含量及び皮膚弾力性の低下，経表皮水分蒸散量の増加が認められた．また，誘発後5週目の掻破回数も正常群と比較して増加した．さらに，皮膚炎症状のスコア評価，血中IgE濃度及び皮膚表皮の肥厚についても同様の推移を示した．以上から，掻破回数及び皮膚機能測定は，皮膚障害の指標として皮膚毒性を評価できる一手法として有用であることが示唆された．本学会では，タクロリムスの投与による皮膚障害低下の検出結果についても併せて報告する．

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　1960~80年代（昭和の後半）、日本は薬害・公害の時代であった。ペニシリン/ショック、サリドマイド禍、コラルジル/リン脂質症、キノホルム/スモン病、有機水銀/水俣病、カドミウム/イタイイタイ病、ヒ素/ミルク事件、PCB/カネミ油症など枚挙にいとまがない。これらの痛ましい事故・事件の教訓から薬物安全性評価の充実が希求された。医薬品分野では、1984年「薬審第118号、医薬品の製造（輸入）申請に必要な毒性試験のガイドライン」が策定され、Minimum Requirementとして準拠が求められた。臨床適用以外の経路でも単回投与試験を実施し、LD50値や無影響量を算出する目的で数多くの動物が犠牲となった。ヒトへの外挿性が乏しいと知りつつも試験を実施した。これらへの反省は、国際調和という形で促された。1991年（平成3年）の効率的な新医薬品開発を目指した規制の国際調和会議（ICH）の設立である。日本は、ICHからの勧告を受け入れ、無影響量から無毒性量へと改めた。ICHでは、日本は欧州と共に非げっ歯類の長期反復投与試験の投与期間を最長6か月と主張したが、9か月で妥協・合意せざるを得ないという苦い経験もした。今日まで、S1（がん原性試験）からS11（小児用医薬品の毒性試験）まで、改訂を重ね、また、新たなトピックについて議論されてきた。このように、平成の30年間は、国際調和した規制・ガイドラインが策定・施行された時代であったが、平成時代の終わりとともに、ガイドラインに依存した画一的試験の時代から医薬品毎に熟考された多様な試験の時代となることを期待したい。

　核酸医薬品、遺伝子治療、再生医療などの革新的医療技術において、本当に従来型の毒性評価方法は通用するのか。50年間も医薬品の毒性評価に関わった経験から、新たな時代に毒性評価に携わる若い毒性研究者にとって参考になる情報を提供できたら幸いである。

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【目的】マイクロブラッドサンプリング（MBS）法は，少量の血液から薬物濃度の測定が可能であり，これをマウス試験に適用することで，3Rsへの貢献が期待できる．今回我々はこの方法を応用して，リファンピシン（Rif），ドキソルビシン（Dox）及びシクロフォスファミド（CP）をマウスに単回投与後，継時的にMBS法により採血し，その血液及び血液生化学的検査値に与える影響について検討した．

【方法】雄性ICRマウスを用いて，0.5%メチルセルロース溶液（以下，MC）投与群，Rif（200 mg/kg）投与群，Dox（10 mg/kg）投与群及びCP（15 mg/kg）投与群（各群N=6）を設定した．各群に単回投与を行い，投与後3，6及び9時間に頸静脈から，投与後24時間に後大静脈からそれぞれ血液約50 μLを採取した．採血サンプルは，各群3例を血液学的検査に，残り3例を血液生化学的検査に供した．血液及び血液生化学的検査値はMC投与群と各薬物投与群の間で，各採血時点において比較した．

【結果】血液学的検査では，全群で投与後24時間にRetの減少，Dox及びCP群で投与後24時間に白血球系パラメーターの変化が見られた．血液生化学的検査では，CP群で投与後3～24時間にかけて肝機能パラメーターの変化，及び投与後6～24時間にT.Cho.の上昇，Rif群では投与後6～9時間，Dox群では投与後3～24時間，CP群では投与後6～9時間にTGの低下，Rif群で投与後3～24時間にT.Bill.の上昇など薬剤の影響が認められた．

以上の結果から，マウスを用いたMBS法により継時的に採血を行った場合，血液及び血液生化学的検査値を経時的に評価可能であると考えられた．今後はMBS法を用いて反復投与による経時的変化を検討し，その結果も合わせて報告する．

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2017年にISO10993-4「血液適合性試験」の改訂により，血液接触デバイスにおけるin vivo血栓性試験が追加された．本試験方法は，血管内カテーテル操作の技術を有していれば可能であるが，デバイスへの血栓付着のスコア化の習得には，実際のデバイスを用いた評価が必要であると考えられる．そこで我々は，2種のガイドワイヤーの血栓性評価の検討をNAAI（Non-anticoagulated arterial implant）モデルを用いて行ったので報告する．

【方法】麻酔下で抗凝固剤非処置ビーグル犬の総頸動脈からシースイントロデューサーを介し，0.035インチガイドワイヤーAまたはBを大腿動脈まで挿入した．30分後，高単位ヘパリンナトリウムを静脈内投与し，ガイドワイヤーを血管から取り出して評価した．スコアは，【スコア0：血栓形成が皆無または最小限である】，【スコア1：最小限の血栓形成，物質表面の1%から25%覆われている】，【スコア2：わずかな血栓形成，物質表面の26%から50%覆われている】，【スコア3：深刻な血栓形成，物質表面の51%から75%覆われている】，【スコア4：広域で血栓形成，物質表面の76%から100%覆われている】として評価した．

【結果】ガイドワイヤーAを処置した結果，スコアは1~2で，赤白色または赤色の血栓（全周性または部分的な血栓）が散在していた．それに対し，ガイドワイヤーBのスコアは4で，評価部位のほぼ全域に赤色の血栓（ほぼ全周性の血栓）が付着していた．以上より，上記基準で血栓性をスコア化し判定可能であることが示された．NAAIモデルは血栓性試験にて用いられるモデルの中でも血栓形成がしやすい条件であることから，今後は，適切な抗凝固剤量で実施するAAI（Anticoagulated arterial implant）モデルを用いた評価検討も併せて報告する．

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【目的】マトリゲルはマウス肉腫から抽出された基底膜調製品であり、基質依存性細胞の接着や分化に有効であることから腫瘍細胞などの生着を助ける足場として広く利用されている。ヒトiPS細胞のような接着性細胞が増殖するためには足場となる接着基質が必要であり、接着基質のない環境下では細胞は増殖することはできず、アポトーシスを引き起こして死に至る。再生医療分野でのin vivo造腫瘍性評価においても、ヒトiPS細胞に由来する分化細胞に残存・混入する未分化なiPS細胞を検出するための細胞外基質としてマトリゲルが使用されている。本研究はマトリゲルによる細胞増殖への作用を検証する目的で実施した。

【方法】6週齢の雌C57BLマウスを各群10匹で飼育し、B16F10メラノーマ細胞を1匹あたり2×10⁴個+マトリゲル、2×10⁴個、1×10⁵個、5×10⁵個の細胞数でそれぞれ背部皮下に移植した。経時的に腫瘍径を測定し、腫瘍体積を算出した。腫瘍体積が一定になるまで動物の飼育を継続し、生存日数を求めた。

【結果】2×10⁴個+マトリゲルを移植したマウスでは移植後早期から腫瘍は増殖し、腫瘍体積の個体差も少なく、マトリゲルにより細胞増殖を安定させる作用が確認された。2×10⁴個の移植では腫瘍増殖に時間を要し、腫瘍体積の個体差も大きく、腫瘍細胞が生着しない個体も散見された。1×10⁵個および5×10⁵個の移植では、移植後から安定した腫瘍の増殖が認められ、特に5×10⁵個の移植における腫瘍体積の推移および生存日数は、2×10⁴個+マトリゲルの移植と同程度であった。

【結論】以上の結果から、マトリゲルは少ない細胞濃度においても細胞の定着及び増殖を助け、移植された細胞の検出感度を高めることに有用であると考えられた。

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【目的】従来安全性薬理試験における呼吸機能評価は主にラットで実施されてきたが，近年はマウスでの評価も増えてきている．さらに，再生医療等製品の安全性評価では免疫不全動物が推奨されるなど，様々な動物種に対応する必要がある．我々は，これらの状況に対応すべくSDラット，ICRマウス及びNOGマウスの呼吸機能を測定し，比較検討した．

【方法】雄性SDラット及びICRマウスに，ジモルホラミン（呼吸機能促進）30 mg/kg及びクロルプロマジン（呼吸機能抑制）100 mg/kgを単回投与し，投与前及び投与後0.5，1，2，4，6，24時間にホールボディプレチスモグラフ法によりemka TECHNOLOGIES社の呼吸機能解析装置を用いて，呼吸機能を測定して1回換気量，呼吸数，及び分時換気量を評価した．また，NOGマウスにはヒト間葉系幹細胞（hMSCs）及びHeLa細胞の懸濁液を単回尾静脈内投与し，投与前及び1，2，4，8時間に呼吸機能を測定した．

【結果】ICRマウス及びSDラットのジモルホラミン投与群は投与後0.5～1時間，クロルプロマジン投与群は投与後0.5～24時間において薬物に起因した呼吸機能の変化が認められた．NOGマウスへのhMSCs及びHela細胞投与群では測定期間中，呼吸機能への変化は認められなかった．本学会では動物種ごとの呼吸機能の経時的変化及びICRマウスとNOGマウスにおける呼吸機能の比較結果について報告する．

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　腎障害は，医薬品開発において最も懸念される副作用の1つである．腎機能の一般的な検査方法として血中尿素窒素(BUN）及び血清クレアチニンが知られているが,感度と特異性において必ずしも必要十分なバイオマーカー（BM）とは言い難い．このような背景の中，より早期に腎障害を検出できるBMが求められており，非臨床及び臨床分野において尿中の新規腎障害BMが現在数多く報告されている．非臨床分野ではPSTC(安全性予測試験コンソーシアム)から7つ(総タンパク，β2-マイクログロブリン，シスタチンC，Kim-1，アルブミン，クラスタリン，TFF3），臨床分野ではKDIGO(国際腎臓病予後改善機構)から5つ(L-FABP, Cystatin C, NGAL, Interleukins, Kim-1)の尿中BMが提唱されており，日本腎臓学会の診療ガイドラインにも新規尿中BM測定の有用性が収載されている．しかし，臨床と非臨床分野を橋渡しする新規腎障害BMの報告は極めて少ない．そこで我々は，本邦発のBMであり日本及び欧州において体外診断薬として認可されているL-FABP(L-type Fatty Acid Binding Protein)に着目し，その有用性について検討を行ってきた．L-FABPは，腎近位尿細管に存在し，腎障害の前段階である腎微小循環障害を反映する虚血・酸化ストレスマーカーである．我々はこれまでにラット腎障害モデルにおいて，尿中L-FABPが腎組織障害の発症前から他の血中及び尿中BMよりも早期にかつ感度よく上昇し，休薬期間後の腎組織再生にともない回復することを報告してきた．本発表では，げっ歯類(ラット)と非げっ歯類(イヌ及びサル)を用いた腎障害モデルにおける尿中L-FABP及び他の新規腎障害BMの変動を比較検討し，非臨床安全性試験におけるそれらの有用性について報告する．

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　2011年欧州議会は，動物実験において霊長類の使用を原則禁止とし，イヌやサルの使用は難しくなりつつある．その代替動物としてミニブタが広く利用されるが，その大きさやハンドリングの難しさという課題が残っている．マイクロミニピッグは体重が10 kg前後の超小型ミニブタで，ハンドリングも容易であることから実験動物としてのニーズが高まってきている．
　昨年の第43回学術年会において，我々はマイクロミニピッグの一般毒性試験における有用性を確認するために抗悪性腫瘍薬であるシクロフォスファミド（CPA）を4週間反復投与し，その毒性について臨床検査データを中心に報告した．今回は，病理組織学的検査及び免疫毒性学的検査について，詳細な結果が得られたので併せて報告する．
【方法】雄性マイクロミニピッグ1群各3例の4群を設定し，それぞれCPAを0，1，3及び10 mg/kg，4週間反復強制経口投与し，一般状態の観察，体重測定，摂餌量測定，眼科学的検査，心電図検査，尿検査，血液学的検査，血液生化学的検査，免疫学的検査（免疫グロブリン検査，白血球貪食能検査，リンパ球サブセット検査）及びTK測定を行った．また，最終投与の翌日に剖検を実施し，器官重量測定及び病理組織学的検査を実施した．
【結果】CPAの4週間反復強制経口投与により，赤血球系パラメーター及び白血球系パラメーターの変動，免疫担当器官の重量変化，T細胞及びB細胞の減少，IgM及びIgGの減少がみられ，CPAの顕著な免疫抑制作用が認められた．病理組織学的検査では，造血器系組織の萎縮，消化管粘膜の出血，出血性膀胱炎及び腺上皮化生，精巣ライディッヒ細胞の萎縮が認められ，ヒトやその他の実験動物と同様の変化が確認された．以上から，マイクロミニピッグは一般毒性の他に免疫毒性の評価においても有用な動物種であると考えられた．

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今日、抗体医薬品をはじめとする様々なバイオ医薬品が数多く開発されており、世界の医薬品市場の売り上げ上位を占めている。しかし、バイオ医薬品の中にはヒトに対して免疫原性を示すものも存在し、それらを正しく評価することが重要である。特に生体試料中の抗薬物抗体（ADA: Anti-drug Antibody）の分析は重要な項目である。従来のLBA (Ligand Binding Assay)の分析方法は、ELISAや電気化学発光法が主流であったが、近年では欧米を中心に全自動LBAシステムであるGyrolabを用いた分析方法の開発も広がりを見せている。そこで、本報告では抗体医薬品に対するADAを測定対象物質として、新たな分析手法であるGyrolabによるADA分析方法の開発について報告する。

Recently, various biopharmaceuticals including antibody drugs have been increasingly developed, and account for the top sales of the world pharmaceutical market. However, since some biopharmaceuticals have immunogenicity to humans, it is important to evaluate it correctly. One of the most important issues is the analysis of anti-drug antibody (ADA) in a biological sample. In the conventional LBA (Ligand binding assay), ELISA and electrochemiluminescence methods have been considered as the mainstream, but in recent years, Gyrolab, a fully automated LBA system, has been expanding mainly in Europe and the United States. Based on this, in this study, we will report the development of the ADA analysis method by utilizing Gyrolab for ADA generated from antibody drugs.

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　【目的】再生医療等製品の評価において，組織中の移植細胞の検出は免疫染色あるいはPCR法で実施されている．通常，PCR法では新鮮凍結組織を用いるが，マウスから組織標本用と新鮮凍結組織を分けて採取するのは困難な状況が想定される．そこで今回，病理検査用として保存しているホルマリン固定組織及びパラフィン包埋組織から核酸を抽出し，PCR法による移植細胞の検出を試みた．

　【方法】ヌードマウス背部皮下にPBS，間葉系幹細胞（hMSC）及びHeLa細胞を移植して形成された腫瘍をサンプルとして用いた．腫瘍は定法に従いホルマリン固定後，パラフィンブロックを作製した．腫瘍が形成されたのはHeLa細胞移植群のみであったため，PBS及びhMSC群は移植部位の組織を使用した．ホルマリン固定組織から直接あるいは各ブロックからパラフィン切片を作成し，脱パラフィン後DNAを抽出した．抽出したDNAは2種類のヒトAlu配列特異的プライマー（Alu-A，Alu-B）を用いた定量PCRで検出した．

　【結果】パラフィン切片からのDNA抽出は，組織の溶解に時間がかかるものの実施可能であった．ホルマリン固定組織及びパラフィン切片から抽出したDNAを用いてAlu配列を増幅した結果，用いた2種類のプライマーのいずれにおいてもHeLa細胞移植群の腫瘍で増幅がみられた．一方，PBS及びhMSC群の移植部位付近からのサンプルでは増幅は認められなかった．以上より，ホルマリン固定組織及びパラフィン切片から抽出したDNAを用い，PCR法によって移植した細胞を検出できる可能性が示された．検出感度向上のためDNAの抽出法やPCR条件を検討し，その結果も併せて報告する．

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【目的】マイクロブラッドサンプリング（MBS）法は，ごく少量の血液から薬物濃度の測定が可能であり，これをマウス試験に適用できれば，使用動物数の削減につながり，3Rsへの貢献が期待できる．我々は今回，マウスを用いてMBS法により血中薬物濃度を測定すると共に，採血頻度が血液学的検査及び血液生化学的検査に与える影響の検討を行い，マウスからの頻回採血方法を確立した．
【方法】雄性ICRマウスを用いて，クラリスロマイシン200mg/kgを単回経口投与し，投与前及び投与後1，2，4，8，24時間の計6時点に，それぞれ頸静脈より約30µL採血した．その後，血漿中のクラリスロマイシン濃度をLC/MS/MSで測定した．群構成は，採血を実施しない群（対照群：1群，N=5），同一動物から6時点の採血を行う群（頻回採血群：2群，N=3）及び2匹1組で動物を入れ替えて，各動物3時点ずつ採血を行う群（スパース採血群：3群，N=6）を設定した．投与後24時間の採血終了後，全群で血液学的検査及び血液生化学的検査を行い，各群の結果を比較した．
【結果】血漿中薬物濃度は，2群と3群でほぼ同様の推移を示した．血液学的検査及び血液生化学的検査では， 1群と比較して，2群及び3群でRBC，Ht及びHbの低値が，2群のみにLDHの高値が認められた．3群で認められた赤血球系の低値は背景データの許容範囲であったため，スパース採血がより適切な方法と考えられた．トランスジェニックマウス等の希少動物を用いたファーマコキネティクス試験では，使用動物数を抑えるために同一動物からの頻回採血も選択肢の一つと考えられることから，採血回数の制限などを考慮する必要がある．現在，マウス4週反復投与毒性試験において初回投与時5時点，最終投与時6時点の頻回採血をスパース採血で行い，血液学的検査及び血液生化学的検査に与える影響について確認中であり，合わせて報告する．

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Creating an animal model of pulmonary emphysema, a type of COPD, requires exposure to cigarette smoke (CS) for more than 3 months. The pulmonary emphysema model was induced by combination of CS exposure and polyinosinic-polycytidylic acid [poly(I:C)] administration for 4 weeks in mice, and the effects of anti-thymic stromal lymphopoietin (TSLP) antibody (Ab) and rolipram (Rol) were examined.

CS was exposed for 4 weeks (Days 1 to 26) and poly(I:C) was administered nasally for 4 days. From Days 15 to 25, the anti-TSLP Ab was nasally administered every other day, and Rol was orally administered daily. In the model, the peak expiratory flow (PEF) and forced expired volume at 0.05 sec/forced expired volume (FEV_0.05/FVC) were decreased, and the tissue damping, inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue, and pulmonary air space size were increased on Day 27. The anti-TSLP Ab inhibited the decrease in PEF and the increase in eosinophils in BALF, but Rol did not suppress these changes.

Based on these results, in the pulmonary emphysema model, respiratory function depression, inflammatory cells infiltration and alveolar expansion were observed, and the anti-TSLP Ab inhibited the respiratory function depression and inflammatory cells infiltration, but the effect of Rol was not clear.

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