オルガノイドは複数種の細胞からなる三次元培養組織であり、二次元で培養された細胞に比べて生体内組織に近い性質を持つとされている。オーガンオンチップシステムは灌流装置とマイクロ流体を用いた細胞培養方法である。これらの技法はin vitroで臓器の構造や機能を再現し、将来的に動物実験を代替する有力な選択肢として期待されている。

　本研究ではより生体に近い環境で薬剤感受性試験や薬剤による副作用の評価を行うことを目的に、乳がん罹患猫から作製した乳がんオルガノイドをCAD設計・アクリル切削加工により作成したマイクロ流路デバイスに搭載し、動物用抗がん剤であるトセラニブを灌流させ、非灌流時との比較解析を行った。

　トセラニブ10μMの培養液を9.5μl / minで48時間、猫の乳がんのオルガノイドに灌流させた後に、live/dead染色を行い、細胞生存率を解析したところ、抗がん剤を灌流させたオルガノイドにおいて生存率が顕著に低下していた。 また、顕微鏡像においても灌流したオルガノイドの形が不整になっていることが観察された。

　今後は、PCRやRNAシークエンスにより、抗がん剤を灌流したオルガノイドと非灌流オルガノイドにおける分子機構の違いを明確にするとともに、灌流している最中のチップ内の培養液の流れ方のシミュレーション解析や、他の薬剤を使った灌流を行い、オルガノイドを搭載したマイクロ流路デバイスにおける灌流による効果をより詳細に検証する予定である。

Background: Cleft palate (CP) is the second most common birth defect in humans worldwide. Previous studies have identified gene mutations, chromosomal abnormalities, and teratogens in CP. In addition to genetic mutations, genetic background (e.g. ethnicity, population of origin, and gender), substantially influences CP prevalence. Maternal age, smoking, alcohol consumption, obesity, and micronutrient deficiencies are known, or strongly suspected, experimental risk factors for CP. Therefore, the etiology of CP is complex, and its risk factors are still being elucidated. Folic acid is known to decrease the risk of CP. Although dietary intake of folic acid is first choice to prevent CP, searching the alternative method is also important for the patients such as folic acid metabolism anomaly. In the present study, we examined the protective effects of Sasa vetichii extract (SE) in all trans-retinoic acid (atRA)-induced cell proliferation inhibition in human embryonic palatal mesenchymal cells (HEPM cells).

Results and Discussion: We demonstrated that atRA induced cell proliferation inhibition in a dose dependent manner in HEPM cells. We found that SE did not affect cell proliferation. Co-treatment with SE restored atRA-induced toxicity. Furthermore, we found that atRA-induced miR-4680-3p and co-treatment with SE downregulated miR-4680-3p. Additionally, downstream gene (ERBB2 and JADE1) of miR-4680-3p was potentiated by co-treatment with SE. These results suggested that SE protected atRA-induced cell proliferation inhibition by modulating miR-4680-3p

SARS-CoV-2の世界的な流行に伴い、日本でも新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に罹患する患者及び死亡者数の急激な増加が認められ、本邦においてCOVID-19に対する治療薬の患者への早期使用を目的とした特例承認及び緊急承認の制度を利用したCOVID-19に対する治療薬が承認されている。緊急承認制度において、医薬品の安全性は通常承認の医薬品と同等な水準が求められているが、有効性が推定できる成績を得るための臨床試験では、臨床試験からの安全性に関する情報が限定的となる場合が想定される。その一方で、COVID-19に対する治療薬などの感染症に対する治療薬の場合には、承認申請された時点では、成人のみならず小児又は妊婦等、広範囲な患者への使用が想定される場合があり、安全性については慎重な考察が求められている。限定的な臨床試験が迅速に実施される条件下における非臨床安全性試験は、ICH-M3(R2)ガイダンスに依らず柔軟な試験の実施が必要であり、当該試験成績に基づくヒトへの安全性評価は、通常承認の医薬品と比較した場合に重要性は高く、毒性所見に対するヒトへの安全性については、臨床試験における安全性評価に依存しない考察が必要な場合がある。以上の点を踏まえ、本発表では、特例承認又は緊急承認されたCOVID-19に対する治療薬の初回治験届出時の調査及び特例／緊急承認、並びに特例承認解除時における審査経験に基づき、臨床試験開始又は承認申請時に必要な非臨床安全性試験の項目や、試験実施時の留意事項及び試験結果のヒトへの外挿性に関する審査側の視点について、当該制度において使用が許可された医薬品における具体的な事例を基に報告する。

【目的】脱毛はアントラサイクリン系抗がん剤の主要な副作用の一つであり、患者のQOL向上の観点から改善が求められている。既存のアントラサイクリン系抗がん剤である、塩酸ドキソルビシン（DOX）、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム製剤（DOXIL）、ピラルビシン（THP）、およびピラルビシンにポリマーを結合した製剤（P-THP）による脱毛誘発作用およびその発現強度について、マウスを用いて評価した。

【方法】Day 0に7週齢のC57BL/6雌性マウスの背部被毛を脱毛ワックスにより強制脱毛し、成長期VI期であるDay 9に薬物を単回静脈内投与した。Day 15に肉眼的に被毛の状態を観察後、背部皮膚を採取し、病理組織学的観察を行った。

【結果・考察】肉眼的にはDOXILおよびP-THP投与群で顕著な脱毛はみられなかったが、DOX投与群の5/5例およびTHP投与群の4/5例で脱毛がみられ、その強度はDOX>THPであった。病理組織学的観察においては、重度の障害時においてみられるdystrophic catagen経路による脱毛変化がDOX投与群の5/5例およびDOXIL投与群の3/5例でみられ、軽度の障害時においてみられるdystrophic anagen経路による脱毛変化がTHP投与群の全例、P-THP投与群の4/5例でみられた。P-THP投与群ではTHP投与群と比較しhealthy anagen経路の割合が高く、脱毛変化が少なかった。以上の結果から、脱毛変化の強度はDOX＞DOXIL＞THP＞P-THPであり、ポリマー結合によりTHPの脱毛誘発作用が軽減されることが明らかになった。

Recent researches revealed that the global prevalence of diabetes mellitus is increasing. According to the International Diabetes Federation prevalence, there were 463 million diabetes mellitus patients in 2019 and will grow to 700 million in 2045. Diabetic retinopathy (DR) is a microvascular complication of diabetes mellitus that affects the retina and leads to visual disability and blindness . Aryl hydrocarbon receptor (AhR), a ligand-activated nuclear receptor, has been identified as an essential role in multiple aspects of normal physiology, including vascular development, neurologic function, inflammation, and vision. Aza-PBHA (AzP), an aryl hydrocarbon receptor activator, is a patented compound could inhibit human gastric cancer cell migration in in vitro study and decrease inflammation cytokine in the hamster oral mucositis model. This study was to estimate the treatment potential of AzP in DR. The results showed that AzP (500 mg/kg/day) oral treatment for 12 weeks attenuated the DR retinal changes in db/db mice such as reduced vascular density, retinal blood perfusion, retinal thickness and increased DR lesion, VEGF expression, and lipofuscin accumulation. In addition, AzP treatment reversed the high-glucose-induced AhR decrease and HIF-1α increase in ARPE-19 cells. We concluded, the AhR activator, AzP, is considered a potential candidate to inhibit the DR development.

The number of people suffering from Age-Relative Macular Degeneration (AMD), of which 90% are dry macular degeneration, will reach about 288 million in 2040. Although scientists have already confirmed AMD has something to do with chronic inflammation and poor circulation, which leads to drusen. But, no good drug to cure AMD and no preclinical animal model to research. Our laboratory has been committed to establishing a preclinical animal disease model of dry macular degeneration for many years. We found that the retinopathy induced by blue light includes chronic inflammation, poor vascular circulation and hypoxia and other dry-form AMD-like symptoms. Moreover, the extent to which electronic products are widely used today has resulted in non-negligible hazards. 3C products have a powerful background light source, which contains a large number of irregular frequencies of blue light with high-energy short-wave. Blue light irradiation on the retina produces free radicals, leading to the decline of retinal pigment epithelial cells, resulting in visual damage caused by the lack of nutrients in the visual cells. Aza-PBHA is a histone deacetylase (HDAC) inhibitor, which has anti-inflammatory, anti-mucosal ulcers and can increase aryl hydrocarbon receptor (AHR) protein expression in cancer cells, blood cells, immune cells, and even eye retina cells, triggering various downstream regulatory functions. This study mainly explores the therapeutic role of Aza-PBHA by regulating AHR protein in blue light-induced retinopathy and investigates the mechanistic pathway of further effects.

【背景】近年、抗体医薬品の薬効増強を目的として、Fc受容体との結合性を改変したFc改変抗体の開発が進んでいる。FcγRIIbは細胞内領域に免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ (ITIM)を持つため、FcγRIIbとの結合を増強したFc改変抗体は免疫抑制が懸念される。抗原と抗体が免疫複合体（IC）を形成してFcγRIIbを架橋すると、ITIMリン酸化及びB細胞アポトーシスが引き起こされる。我々は、ヒト及びカニクイザルの免疫細胞にFc改変抗体のICを処置し、ITIMリン酸化及びB細胞アポトーシスの誘導について検討した。

【方法】抗Latent myostatin Fc改変抗体、GYM329またはそのFc改変サルサロゲート抗体のICを末梢血単核細胞(PBMC)に処置し、ITIMリン酸化をWestern blottingで検出した。また、PBMCから単離したB細胞にICを処置して培養し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。抗体と FcγRIIbの結合を、Biacoreを用いて検出した。

【結果・考察】ヒトFcγRIIbへの結合を増強したGYM329のICは、ITIMリン酸化及びB細胞アポトーシスを誘導しなかった。一方、同程度ヒトFcγRIIbへの結合を増強したサルサロゲート抗体は、ITIMリン酸化及びB細胞アポトーシスを誘導した。GYM329とサロゲート抗体では FcγRIIb機能への作用が異なるため、免疫抑制作用に対して、サルサロゲート抗体を用いた試験結果をヒトへ外挿することは難しいと考えられた。また、FcγRIIbへの結合の強さとFcγRIIbを介した免疫抑制機能が、必ずしも相関しないことが明らかになった。従って、Fc改変抗体の生物反応を理解するためには、FcγRIIbへの結合に加え、FcγRIIbを介した免疫機能についても評価することが重要と考えられた。

Current clinically used plateletα_IIbβ₃ antagonists such as Eptifibatide (Ept), are highly efficacious antithrombotic agents. However, the incidences of bleeding and thrombocytopenia are frequently reported. Thus, developing a novel α_IIbβ₃ antagonist with little bleeding risk is critical for treatment of arterial thrombosis diseases. Through a structure-activity relationship experiment, we found an optimized α_IIbβ₃ antagonist KGDRR mutant (8036 Da) endowed with a residue Arg⁵⁵ in the KGD-loop. This mutant exhibits a highly potent activity in blocking platelet aggregation induced by collagen (IC₅₀ 30 nM) without causing a significant prolongation of mice tail bleeding time while Ept caused a profound increase of bleeding time. Intravenous injection of KGDRR mutant (0.125 mg/kg) or Ept (0.5 mg/kg) markedly delayed the occlusion time in FeCl₃-induced thrombosis model. KGDRR mutant did not prime the platelets in binding to fibrinogen and AP5, a specific LIBs monoclonal antibody while Ept did. KGDRR mutant did not affect resting platelet binding to immobilized fibrinogen while Ept did. KGDRR mutant did not cause platelet activation in presence of AP2, an inhibitory mAb of α_IIbβ₃ while Ept did. In contrast to Ept, KGDRR did not inhibit the hemostatic function in whole blood as measured by thromboelastometry. Thrombin-induced clot retraction of platelet-rich plasma was suppressed by Ept but not by KGDRR. Ept significantly decreased platelet count and prolonged bleeding time in FcrRIIa transgenic mice, however, KGDRR mutant (2.5 mg/kg) did not. The KGDRR-based pure platelet α_IIbβ₃ antagonist displays a selective inhibition of platelet activation and thrombus formation without affecting integrin-dependent hemostasis processes. This KGDRR mutant is a highly efficacious antithrombotic agent with little tendency in causing bleeding risk.

With the popularity of 3C electronic devices, the number of patients with retinopathy is getting younger and increasing rapidly. Dry macular degeneration is one of the public health epidemics caused by 3C electronic devices, and there are few drugs to treat it. Previous studies have suggested that natural ingredients from fungi have the advantages of easy fermentation and mass production, species diversity, undeveloped, and novelty. In the future, fungal natural drugs will be an irreplaceable screening target in pharmaceutical development. Therefore, this project used blue light to induce macular degeneration as a disease model and intends to explore the protective effects of medical fungi Cordyceps sobolifera and Hericium erinaceus. In vitro studies, we observed that the extract of Cordyceps sobolifera and Hericium erinaceus reversed the protein expression level of Nrf-2/Keap-1 and autophagy-related signal pathway induced by blue light in retinal pigment epithelial cells (RPE) and photoreceptor cells (661W). As for in vivo studies, the results showed that medical fungi extract could effectively alleviate blue light-induced function and structure damage in mice’s retinas. In conclusion, the ingredients of medicinal fungus would be a potential preventive drug for dry macular degenerationdiseases.

Open-angle glaucoma is an asymptomatic chronic disease that can lead to irreversible vision loss. Due to high intraocular pressure, this disease usually causes permanent damage to eye tissue. Eye drops are a kind of non-invasive administration and are widely used in the market. However, eye drops are blocked by the physiological barrier of the eyes, with low ocular bioavailability of approximately 5%. However, the problem of rapid clearance and repeated administration usually contribute to patients' poor adherence. Therefore, using a thermosensitive in situ gel to increase the viscosity of the drug solution enables the resultant gel to stay on the eye surface and improve the treatment efficiency. In this study, sodium phenylbutyrate (SPB) was used as the target drug for the treatment of glaucoma and incorporated with a poloxamer 407 (P407) and hypromellose (HPMC) thermosensitive in situ gel. The gelation characterization and rheological studies showed that the SPB gel formulation gelation temperature is 29.3±0.8°C and exhibits shear thinning behavior. Therefore, it is appropriate for ophthalmic therapy applications. Ex vivo studies showed that the SPB gel formulation could increase the retention time and achieve a control release profile of SPB in the ocular tissue compared to the SPB solution. The in vivo dexamethasone acetate-induced glaucoma animal model shows that SPB gel significantly reverses the dexamethasone acetate-induced mice intraocular pressure, and the vascular mean blood flow rate and retina OPs diminished without affecting the morphological structure of retina layer. In conclusion, our data show that the SPB incorporated with a thermosensitive in situ system could attain great gelation temperature, increase the retention time of the drugs on the corneal, and alleviate the relative symptoms of glaucoma.

T-cell engagers (bispecific antibodies) can bind to both tumor cells and immune cells such as T-cells, and direct immune cells to kill tumor cells by the dual binding. However, the bispecific antibodies can be easily getting into a status being depleted which cause activated T-cells becoming unresponsive shortly after application due to lack of costimulatory molecules. Based the above observation, a multi-specific antibody with adding a costimulatory molecule was created to avoid incapacity of T-cells activated by a single signal which expects to improve T-cell killing efficacy to tumor cells. This study evaluated the anti-cancer efficacy and potential toxicity of CD3/CD20/CD28 antibodies and Blinatumomab analog on Raji-NPG mouse model with human hematopoietic stem cells (HSC) reconstitution, as well as their in vitro effect on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) activation. Results showed that both the CD3/CD20/CD28 antibodies and Blinatumomab analog could induce T-cell activation in vitro, significantly inhibited proliferation of tumor cells in vivo, and induced cytokine release and T-cell depletion. Target-related histopathological changes were observed in spleen. The results indicated that the multi-specific antibody with CD28 added as a costimulatory factor, its cell-killing effect on tumor may be higher than that of Blinatumomab analog, but the risk to trigger cytokine release may also increase.

バイオ医薬品や核酸医薬品等における毒性試験では、標的分子に対する結合親和性や薬物動態に関するヒトとの類似性等により、非ヒト霊長類（NHP）が多く利用されている。しかしながら、近年では、①新型コロナウイルス感染症の治療薬やワクチン開発においてNHPの利用が増加したこと、②主なNHP原産国からの輸出が制限されたこと、③動物福祉（3Rs）の観点から航空輸送が困難となったこと等の理由から、本邦を含めて世界的なNHPの供給不足が生じている。この状況は、NHPは産子数が少なく、性成熟するまでに時間を要することを踏まえると、当面持続する可能性があり、本邦における医薬品開発に深刻な影響を及ぼすことが懸念されている。

そこで、我々は、医薬品開発におけるNHPの使用実態を明らかにするために、過去7年間に本邦での製造販売承認時に提示されたNHPの非臨床安全性試験成績を用いて、モダリティ、薬理作用、毒性試験のデザイン（動物種の選択、動物数、用量設定等）等を調査した。本発表では、これらの調査結果や我々の審査経験を踏まえて、NHPを用いた試験の必要性、試験デザインの適切性、Weight of Evidence及び代替モデル（サロゲート、遺伝子改変動物等）を利用したアプローチ等に関する我々の考え方を紹介し、NHPの使用が削減できる可能性について議論したい。

感染症予防及び治療のワクチンの非臨床安全性評価として，ワクチンの直接的な全身毒性及び局所反応に加え，ワクチンで誘導される抗体や抗原による自己免疫または目的としない感作などの有害な免疫反応や製剤中に含まれる不純物及び混入物質の毒性の評価は重要である．自社の探索研究におけるmRNA-LNPワクチン製剤のラットにおける反復投与毒性試験において，強い貧血症状が認められため，その貧血の原因及び機序を検証した．まず，ラットを用いた投与と貧血発現の経時的な検討から，貧血は被験物質投与後3週目以降で認められたことから，被験物質自体の曝露による直接的な作用ではなく，発現したタンパクに対する抗体による免疫介在性の貧血が疑われた．また，再現性の実験から貧血は一部の製剤のみでロット間差が認められたことから，ワクチンのmRNA配列や添加剤ではなく，不純物や混入物質由来である可能性が考えられた．骨髄検査並びに貧血を呈したラットの骨髄を用いたコロニー形成アッセイ及び貧血を呈したラットの血漿と正常ラットの骨髄を用いたコロニー形成アッセイの結果から，貧血の機序としては，骨髄における免疫介在性の赤芽球系細胞の分化抑制あるいは直接傷害が示唆された． このような遅発性・免疫介在性の貧血は，意図しないmRNA等の不純物や混入物質による抗体だけでなく，意図的に発現させたタンパクに対する抗体が動物では自己抗原に高い親和性を有する場合にも生じる可能性があり，今回のラットで認められた貧血の原因及び機序の検討は有意義であると考えられた．

ヒト初回投与（FIH）試験に参加する被験者の安全性を確保するためには，ヒト初回投与量の慎重な設定が重要である．ヒト初回投与量は，治療対象や被験薬の特性及び臨床試験デザイン等によりその設定手法は調整されるが，原則として最も感受性の高い動物種における無毒性量（NOAEL）あるいは最小薬理作用量（MABEL）をもとにヒト等価用量（HED）及び安全係数を考慮して設定される．再生医療等製品のヒト初回投与量についても低分子医薬品やバイオ医薬品と同様に，薬理試験を実施して有効性が確認できる用量に基づいて臨床用量を定め，その用量範囲を含む投与量を用いて毒性試験を実施して安全性を確認した上で設定することが，日米EU各極のガイドラインにおける共通した原則とされている．しかしながら，再生医療等製品はヒト細胞加工製品（ヒト体細胞加工製品/ヒト体性幹細胞加工製品）や遺伝子治療用製品（プラスミドベクター製品/ウイルスベクター製品）などの多様な先端的なモダリティを含んでおり，製品の特性によっては当該原則の適応が困難なケースも存在する． そこで今回，2022年までに日米EUの規制当局のホームページで公開された審査報告書や申請書類をもとに，既承認再生医療等製品16品目についてヒト初回投与量設定の考え方を調査し，それらが現行ガイドラインの規制要件に沿ったものかを評価した．その結果，調査した品目（ヒト体性幹細胞製品，ヒト間葉系幹細胞製品，CAR-T細胞製品及びin vivo遺伝子治療用製品）のヒト初回投与量は，いずれも既存ガイドラインの考え方に概ね沿っていたが，品目の特性により個別に考慮した点もあることが明らかとなった． 本発表では，製品の特性や適用されるガイドラインの要件を考慮した上で，各品目のヒト初回投与量を設定するためのアプローチについて考察したい．

遺伝子治療とは，遺伝子を体内に導入して細胞機能の欠陥を修復・修正する疾患治療である。遺伝子治療は，予め取得した標的細胞に目的遺伝子を導入して体内に戻すことで治療効果を期待するex vivo遺伝子治療と，目的遺伝子を搭載した治療薬を体内に直接投与することで効果を期待するin vivo遺伝子治療に大別される。In vivo遺伝子治療用医薬品の開発はめざましく，2022年12月現在，全世界で既に10品目以上が承認されており，その他多くの品目が承認申請中もしくは第Ⅲ相臨床試験段階にある。今後のin vivo遺伝子治療用医薬品の開発を効率的に進めるにあたり，代表的な品目について開発時に実施された非臨床パッケージを調査し考察しておくことは有用と考えられる。 今回我々は，既承認ベクター製品の非臨床評価パッケージを紐解き、現行ガイドラインを満たしているか否かについて検討した。調査対象は、2022年6月時点において承認申請・評価に関する公開情報を日米EU各極より入手可能であったアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター製品3品目（Zolgensma^TM，Luxturna^TM，Glybera^TM）及び単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター製品2品目（デリタクト^TM，Imlygic^TM）と，プラスミド製品1品目（Collategene^TM）とした。調査にあたっては、承認申請書，審査報告書又はインタビューフォーム等の公開情報より非臨床評価パッケージに係る情報を収集するとともに，国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）による調査報告も参照した。その結果、調査対象の各品目は各極のガイドラインを概ね満たしていることが明らかとなった。本発表では、各品目で実施された非臨床評価パッケージを整理するとともに、各品目間での対応の共通点や違いについて、品目ごとの特性と各極のガイドラインの要求内容を踏まえながら考察したい。

遺伝子治療とは，遺伝子を体内に導入して細胞機能の欠陥を修復・修正する疾患治療である。遺伝子治療は，予め取得した標的細胞に目的遺伝子を導入して体内に戻すことで治療効果を期待するex vivo遺伝子治療と，目的遺伝子を搭載した治療薬を体内に直接投与することで効果を期待するin vivo遺伝子治療に大別される。In vivo遺伝子治療用医薬品の開発はめざましく，2022年12月現在，全世界で既に10品目以上が承認されており，その他多くの品目が承認申請中もしくは第III相臨床試験段階にある。今後のin vivo遺伝子治療用医薬品の開発を効率的に進めるにあたり，関連するガイドラインの要求事項を整理しておくことは有用と考えられる。 今回我々は，ベクターを用いたin vivo遺伝子治療用医薬品の非臨床評価に係る日米EU各極の医薬品規制当局（PMDA，FDA，EMA）より発出された現行ガイドラインに記載された要求事項を比較した。その結果，概して，薬理，動態及び毒性評価において各極間で大きな違いは認められなかったものの，記載上の相違点なども明らかとなった。本発表では，各極ガイドライン要求内容の類似点や相違点の詳細を紹介するとともに，調査結果に基づく考察も行う。

ヒト初回投与試験に参加する被験者の安全性を確保するためには，ヒト初回投与量の慎重な設定が重要である．ヒト初回投与量は，一般に最も感受性の高い動物種の無毒性量又は最小薬理作用量を基にヒト等価用量及び安全係数を考慮して設定される．再生医療等製品の開発に必要な要件については，日米EU各極の医薬品規制当局でハーモナイズされた共通の指針はなく，初回投与量設定の考え方は各極で策定された規制要件に準じている．そこで今回，再生医療等製品開発時におけるヒト初回投与量設定の考え方を理解するため，2022年までに日米EUの規制当局のホームページで公開されたヒト細胞/組織加工製品及び遺伝子治療用製品に関する通知を調査対象とし，各極の規制要件を比較検討した．

その結果，再生医療等製品のヒト初回投与量は，低分子医薬品やバイオ医薬品と同様，薬理試験を実施して有効性が確認できる用量に基づいて臨床用量を定め，その用量範囲を含む投与量を用いて毒性試験を実施して安全性を確認した上で設定することが，日米EU各極のガイドラインで共通した原則とされていた．しかしながら，再生医療等製品は細胞/組織加工製品や遺伝子治療用製品などの多様な先端的モダリティを含んでおり，製品の特性によっては当該原則の適応が困難で，非臨床試験に基づいたヒト初回投与量の設定が難しい場合も存在する．そのため，欧米のガイドライン等では上記の共通原則の限界に触れた上で，先行類似品目のデータや臨床経験等も活用できることなどが記載されていた. 現時点では，再生医療等製品のヒト初回投与量は，基本原則に加えてモダリティの特性や標的疾患を考慮して個別に設定することが最良であると考えられた．本発表では，日EU欧のガイドラインを比較し，各製品のヒト初回投与量を設定するための留意点について考察したい．

Many regenerative medical products (human cell/tissue-based products) are recently under development, and non-clinical safety studies for regenerative therapies are requested.

Especially, a biodistribution assessment of drugs is the most important. Many methods, such as quantitative polymerase chain reaction (qPCR), flow cytometry (FCM) and immunohistochemistry, have been reported for detecting human cells in animals. Since each detection method has both advantages and disadvantages, an optimal assessment system is needed for each product.

The purpose of this research was to validate qPCR and FCM methods for analysing blood concentration of human mesenchymal stem cells (MSCs) in mice. Human specific Alu PCR was applied for the quantification of human MSCs in mice blood. Antibodies to human MSCs specific cell surface markers (CD73, CD90 and CD105, positive MSCs markers) were analysed for FCM. Both methods were compared on same blood samples from male immunodeficient mice administered human MSCs intravenously. Parameters (accuracy, precision, sensitivity) were evaluated for both qPCR and FCM methods. Blood samples were collected by continuous blood sampling and were divided for qPCR and FCM methods. A standard curve for measuring cell counts of human MSCs was constructed.

We will report the assay methods to detect human cells in mice by using qPCR and FCM methods.

【目的】重度免疫不全動物であるNOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug/Jic（NOG）マウスはヒト細胞を含む異種細胞の生着性が高いため、再生医療等製品のIn vivo造腫瘍性試験に用いられている。In vivo造腫瘍性試験は移植細胞自体が増殖して腫瘍を形成するリスクを評価する試験で、本邦のガイドラインにおいて、陽性対照細胞の最低腫瘍形成用量（TPD_min）を事前に評価しておくことが推奨されている。今回我々は、HeLa細胞及び未分化iPS細胞をNOGマウスに投与し、TPD_min及び腫瘍形成期間の検討を行った。

【方法】ヒト間葉系幹細胞に対し、HeLa細胞及び未分化iPS細胞がそれぞれ0.0001%、0.001%、0.01%の割合で混在するようにスパイクし、各細胞3用量をNOGマウスに皮下投与した。未分化iPS細胞は、マトリゲル及びROCK（Rho-associated coiled-coil containing kinase）阻害剤を混合して投与した。観察期間は、HeLa細胞投与群は投与後16週間、未分化iPS細胞投与群は投与後20週間とし、一般状態観察、触診及び腫瘤径測定、剖検、並びに病理組織学的検査を実施した。

【結果及びまとめ】HeLa細胞投与群では、投与後13週までに全ての用量で投与部位に腫瘤が形成された。腫瘤は剖検日まで増大し、病理組織学的検査では皮下にHeLa細胞による腫瘍形成が認められた。未分化iPS細胞投与群では、投与後20週まで全ての用量で経時的に増大する腫瘤はみられなかった。病理組織学的検査では一部の動物で投与部位の皮下に線維形成が認められ、線維細胞が抗ヒト核抗体を用いた免疫染色に対して陽性を示したものの、造腫瘍性を疑う病変ではなかった。

4-ヒドロキシフェニルピルビン酸デオキシゲナーゼ(HPPD)阻害型除草剤の実験動物に対する毒性作用機序は、全身にチロシンが過剰に蓄積されて誘発される。HPPDが阻害された場合、チロシンの異化にはバイパス経路であるチロシンアミノトランスフェラーゼ (TAT)が関与する。TAT活性はHPPD阻害剤によるチロシン血症の重症度を促進する主な要因であり、実験動物とヒトの種差の根拠となる。これまでに報告されているTAT活性の検討には一貫性がなく確実性がなかった。特に、イヌは比較的高いTAT活性を示した一方で、毒性試験において角膜混濁が散見される事実と一致せず、TAT活性の種差を科学的根拠とする上で合理性に問題があった。そこでこの問題を明確にするため、ヒト並びに実験動物種におけるTAT活性を確認するための新たなin vitro実験系を開発した。初代肝細胞モデルを用い、薬理効果としてHPPDを阻害するニチシノンを処理したところ、TAT活性は毒性感受性と明瞭な相関関係を示した。これらのデータは、イヌを含むチロシン血症に基づく毒性の種差を説明する上で、TATの役割を支持するものである。これにより、ヒトの健康リスク評価において最も関連性の高い動物モデルとしてマウスを選択する際の信頼性を高めることが証明された。

【背景・目的】ミクログリアの活性化により生じる神経炎症は種々の神経疾患の発症要因として注目を集めている。本研究では、神経炎症を引き起こすリスクを有する環境化学物質を同定するとともに、エクソソームを介してニューロンに及ぼす影響とそのメカニズムの一端を解明することを目的とした。【方法】ヒト不死化ミクログリアHMC3に各種化学物質を曝露し、細胞生存率および炎症性因子（IL-6等）の遺伝子発現変化を指標としてミクログリアの活性化を評価した。ヒト不死化ドーパミン作動性ニューロンLUHMESとHMC3の共培養モデルを作製し、ミクログリアの活性化がニューロンの神経突起伸長に及ぼす影響を評価した。超遠心法によるミクログリア由来エクソソームの回収を検討し、その性状および機能に関する解析を行った。【結果・考察】フェニルピラゾール系農薬の1種フィプロニルは濃度依存的な細胞生存率の低下およびIL-6発現の上昇に伴うミクログリアの活性化を引き起こし、主要代謝物であるフィプロニルスルホン（FipS）ではその作用がさらに大きくなることを見出した。単独培養のLUHMESに対するFipS曝露は10 µM以上の濃度において神経突起伸長を抑制したが、共培養下においてはその作用が軽減したことから、活性化ミクログリアから放出される液性因子は神経毒性に対して保護的に働くことが明らかになった。超遠心法により回収したミクログリア由来エクソソームはエクソソームマーカーであるCD9およびCD63の陽性を示し、それらの発現量にFipS 曝露による変化は見られなかった。また、FipS 10 µMを曝露したHMC3由来のエクソソームをLUHMESに曝露すると、対照群と比較して神経突起長がより増加した。本研究から、化学物質によるミクログリアの活性化がエクソソームを介して神経分化に影響を及ぼす新たなメカニズムが明らかになった。

化学物質の内分泌系に及ぼす影響を評価する一環として、近年、甲状腺機能への影響をみるためのガイドライン改正が行われている。例えばOECD 408にはT3、T4、TSHの測定が導入された（2018）。今回、農林水産消費安全技術センターのHPに農薬抄録が開示されている約290種の上市農薬を対象に、甲状腺に対する安全性評価の実態を農薬抄録及び食品安全委員会の農薬評価書から調査・解析した。

各農薬で実施されたマウス、ラット、イヌの亜急性、慢性・発がん性試験等で得られた甲状腺関連の検査（重量測定、病理組織学的検査、ホルモン測定等）結果を調査し、甲状腺に対する影響を解析した。調査した農薬の約3割で何らかの甲状腺への影響（甲状腺関連ホルモン変動、重量増加、濾胞/濾胞上皮の非腫瘍性/腫瘍性病変、C細胞への影響）が認められた。濾胞/濾胞上皮への影響を示した約80種のうち、約8割で肝重量増加や小葉中心性肝細胞肥大等の変化がみられ、甲状腺への影響の背景に肝薬物代謝酵素誘導があることが示唆された。実際、このうち約6割でUDPGT活性の増加等によって酵素誘導が確認されていた。一方、甲状腺の濾胞/濾胞上皮への直接的影響として、TPO阻害や脱ヨード酵素阻害等がみられた事例もごく少数ながら認められた。ただ、濾胞/濾胞上皮への影響がみられた農薬の1割以上では変化について何ら考察がなされていなかった。甲状腺関連ホルモン（T3、T4、TSH）測定が実施された約60種のうち約8割で変動がみられ、その9割以上で肝薬物代謝酵素誘導が認められた、あるいは示唆された。

以上、農薬抄録及び農薬評価書に掲載された情報の調査・解析から、調査した上市農薬の約3割で各種毒性試験において何らかの甲状腺への影響がみられた。うち甲状腺に直接的影響を及ぼした農薬は少数であった一方、肝薬物代謝酵素誘導に伴う二次的影響によるものが多数を占めた。

目的：我々は生体リズムを考慮した毒性学を「時間毒性学」として展開してきた。過剰量の銅は肝障害を引き起こす。単回投与で夜中では毒性が出やすく、朝方にかけては毒性が出にくい結果を得ているが、曝露回数で結果が異なる可能性が考えられる。本研究では、投与回数での銅による毒性の感受性の違いの検討および感受性時刻差をもたらす因子の解明を目的とした。

方法：(1) 7週齢のC57BL/6J雄性マウスを用いて、銅を10時と22時に対して、週に2回反復腹腔内投与を行い、8週間経時的に観察を行なった。また、投与5週間後での肝障害も評価した。(2) マウス肝癌由来Hepa1-6細胞を用いて、銅処理における細胞増殖試験、時計遺伝子の発現量を測定した。また、時計遺伝子 (Ciart, Cry2, Per1) を過剰発現させた条件下での細胞増殖試験および銅の恒常性維持に関わる遺伝子、細胞周期や細胞死に関わる因子の解析を行った。

結果および考察： (1) 22時投与では、10時投与よりも致死率 (8週間投与) および肝障害の程度 (5週間投与) が強く認め られた。したがって、銅による毒性の感受性時刻差は単回投与と反復投与で同様の傾向を示すと考えられた。 (2) 銅処理により、3種類の時計遺伝子 (Ciart, Cry2, Per1) の発現量が増加し、さらにCry2, Per1の過剰発現 で銅による細胞毒性は増強した。また、Cry2, Per1の過剰発現で取り込みに関与するCTR1の増加、排泄に関わるATP7Bの減少が認められた。また、アポトーシスの亢進ならびにCyclin Eに起因する細胞周期に作用することが確認された。以上の結果から、夜中に発現量が高いCry2, Per1が銅トランスポーター機能を制御することで肝臓蓄積量を増加する結果、夜中の曝露では肝毒性が増強することが示唆された。

カドミウム（Cd）による腎障害は、近位尿細管における低分子量タンパク質やリンの再吸収障害を特徴とするが、Cd長期曝露実験で再吸収障害の機序を検討するのは困難だった。私たちはCd-メタロチオネイン（MT）を投与すると、腎臓の近位尿細管細胞に取り込まれ、free Cd²⁺を生じて短期に再吸収障害を誘発できる急性腎障害誘発モデルを構築している。本研究では、Cd-MT投与後の濃度および時間依存的な近位尿細管障害の変化を調べ、カルシウム（Ca）およびリン酸（Pi）などの再吸収障害の機構を解明することを目指した。 Cd-MT（0.2、0.3、0.4 mg Cd/kg体重）をマウスに皮下投与し、投与後1～7日までの経時変化を解析した。近位尿細管障害の指標である尿中β₂-MGおよび尿糖の排泄増加はいずれの投与群でも投与1、4日後まで上昇した。Cd-MT投与よるPiの尿中排泄亢進は、Cd-MT投与1日後に弱いながら観察され、Na依存性PiトランスポーターのNpt2aの発現低下がPiの再吸収障害に関与していることが示唆された。一方、Caの尿中排泄亢進は、投与4日後に最も高くなり、PiとCaの再吸収障害が観察される時間は異なっていた。 次に、Cd-MT投与によるミトコンドリアの形態および機能維持に関わる因子の発現変化を調べた。Cd-MT投与後のマウス腎臓において、ミトコンドリア機能調節因子のSIRT3タンパク質、ミトコンドリアの融合に関わるOPA1およびミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の発現は投与後4日目以降に低下した。このように実験動物を用いてCd曝露によるβ₂-MG、グルコース、PiおよびCaの再吸収障害を短期間で検討できる系が樹立できた。今後、Cdによるこれらの再吸収障害における各輸送体の発現変化やミトコンドリア機能障害の関与について明らかにしてきいたい。

【目的】水俣病の原因物質であるメチル水銀は、中枢神経系への障害を引き起こすことが知られている。血管は生体内に普遍的に存在しており生体の恒常性維持に機能する。脳の毛細血管内皮細胞は、外来異物の侵入を防ぐ血液脳関門（BBB）と呼ばれる生体バリアを形成している。BBBは脳組織を体循環由来の異物や組織から隔絶し、栄養成分の選択的な供給や血管透過性の制御などを通じて脳の恒常性を維持している。これまでにメチル水銀を投与したラットにおいて末梢由来成分であるIgGが脳内に移行することが報告されており、メチル水銀がBBBの脆弱化を引き起こす可能性が指摘されているが、その詳細に関しては未だ不明である。そこで本研究では、メチル水銀がBBBの構成要素である脳毛細血管内皮細胞の密着結合（TJ）に与える影響を培養血管内皮細胞を用いて検討した。【方法】ヒト脳毛細血管内皮細胞（HBMEC）をメチル水銀で処理し、遺伝子発現量はリアルタイムRT-PCR法で、タンパク質発現量はウェスタンブロット法で測定した。【結果・考察】メチル水銀でHBMECを処理し、TJ構成分子の発現に与える影響を検討した。その結果、メチル水銀はBBBを構成するclaudin-1, 3, 5, ZO-1, 2, 3, JAM-A, B, C, ESAMのmRNA発現には影響を与えず、claudin-12, occludinのmRNA発現レベルを濃度依存的および時間依存的に有意に低下させた。またメチル水銀はoccludinのタンパク質発現レベルを低下させた。同様に、細胞同士の接着制御に寄与する接着結合構成分子の発現に与える影響を検討したが、メチル水銀による影響は認められなかった。occludinはBBBの透過性制御に関与することから、メチル水銀によるoccludinの発現抑制は、血管透過性亢進などに寄与する可能性が考えられる。

これまで我々は、thio-dimethylarsinic acid (Thio-DMA)が紡錘体チェックポイント（SAC）を活性化することで細胞死を誘発することを明らかにしているが、GSH共存下ではSACの活性化が抑制されるとともに細胞死も抑制されることを報告している。さらにSACが活性化した細胞にGSHを添加すると、SACの活性化が抑制されるとともに、分裂前中期に蓄積していた細胞の分裂が再開し、染色体数異常を持つ細胞の出現頻度が亢進することを明らかにしている。そこで本研究では、Thio-DMAによるSACの活性化とGSHによる抑制機構において、細胞内のヒ素量がどのように関与するのか解明することを目的とした。【方法】種々のチオール化合物（GSH、N-acetyl cysteine、cysteine、cystineおよびGSSG）をThio-DMAと同時、あるいは途中添加した時の細胞内外のヒ素量をICP-MSを用いて解析した。【結果・考察】GSSG以外のチオール化合物はThio-DMAと同時処理により細胞内ヒ素量を顕著に低下させた。Thio-DMAでSACが活性化した細胞にこれらのチオール化合物を途中添加した場合でも、細胞内ヒ素量が顕著に低下した。さらにThio-DMAで16時間処理後にThio-DMAを含まない通常の培地に置き換えたところ、2時間後には細胞内ヒ素量が約1/2にまで減少し、代わりに培地中で増加した。なお細胞内ヒ素低下と培地中への増加が認められたタイミングで、分裂前中期に蓄積していた細胞の分裂が再開した。以上の結果から、チオール化合物は細胞外においてThio-DMAの細胞内への取り込みを抑制する一方、SACが活性化した細胞に対しても新たに取り込まれるThio-DMAを細胞外でトラップすることで、SACの不活性化を引き起こし、分裂を再開させる可能性が示唆された。

Renal uptake and excretion of radionuclides after internal exposure are important factors influencing persistence of the nuclides in the body and resulting dose estimation. The renal proximal tubules are responsible for reabsorption of substances from urine and divided into three regions from the upstream (S1, S2, and S3 regions). In the previous studies, the region-specific metal transport was demonstrated [1, 2], but the information on the region-specificity of internal radionuclides is lacking. Uranium is a naturally occurring radioactive heavy metal and exhibits nephrotoxicity. We developed a simple method of single-cell imaging of uranium by μPIXE (particle induced X-ray emission with microbeam) [3]. In the present study, using the analytical technique, the uptake and cellular distribution of uranium were examined in cell lines derived from the S1, S2, and S3 regions of mouse proximal tubules.

Uranium uptake was determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry. Cells attached onto polypropylene film after incorporation of uranium were subjected to μPIXE analyses. Intracellular distribution images of uranium and endogenous metals among three type of cells reflected the region of the proximal tubules were compared. Cell-type dependent formation of the concentrated areas of potassium and phosphorus co-localized with uranium were found.

[1] H. Fujishiro et al., J. Toxicol. Sci. 2019; 44: 611-619.

[2] H. Fujishiro et al., Toxics 2020; 8: 24.

[3] S. Homma-Takeda et al., Minerals 2021; 11: 191.

It is essential to determine concentration and chemical forms of actinides such as uranium in bio-fluids in cases of triage and therapeutic studies for acute internal exposure following nuclear accidents. Using X-ray absorption fine structure (XAFS), structural information that is useful for the decorporation study, such as bond lengths, and coordination number of the uranium-bound ligands can be investigated. We previously reported that XAFS spectra of uranium in serum in the presence and absence of the chelating agents for decorporation can be distinguished, uranium chelating ability in the serum was evaluated depending on the concentration of the chelating agents [1]. In the present study, chemical form of uranium was analyzed using rat serum of only 1 µL for screening study, put on polypropylene film with 6 µm thickness at the diameter of 1.6 mm of rat serum mixed with uranyl acetate. XAFS spectra of uranium in serum at absorption of U L3 edge (17.16 keV) were measured at BL37XU, SPring-8. Concentration dependence of uranium on XAFS spectra in the serum droplet was examined. Chemical form of uranium in serum was estimated by comparison with the spectra of standard uranyl acetate as the reference.

[1] A. Uehara, et al., Anal. Methods, 14 (2022) 2439.

【目的】メチル水銀 (MeHg) は水俣病で知られるように、中枢神経障害を主とし様々な毒性を呈する。我々は、オレアノール酸 (OA) を骨格としたサポニン誘導体の1つであるOA-3-グルコシド (OA3Glu) を、MeHg毒性を予防・治療する抗MeHg薬の候補化合物として見出した。今回in vivoにおいて、MeHg毒性に対するOA3Gluの保護効果について、行動試験及び組織学的解析により評価することを目的とした。【方法】雄性、5週齢のBALB/cマウスを、Control群、OA3Glu投与群、MeHg投与群、MeHg＋OA3Glu投与群に分け、MeHg (1, 2, 4 mg/kg) およびOA3Glu (100 µg/kg) を週5回・4週間にわたり経口投与した。投与終了後、回転するロッドからマウスが落下するまでの時間を測定するロータロッドテスト、細い棒の上を歩く間に後脚を踏み外す回数を測定するビームウォーキングテストによって運動機能を評価した。また、大脳および小脳はホルマリン固定後パラフィン包埋し、HE染色を行った。【結果・考察】ロータロッドテストにおいて、落下までの経過時間はいずれの投与群の間にも顕著な違いは認められなかった。一方、ビームウォーキングテストにおいて、MeHg投与濃度が上昇するにつれて後脚を踏み外す回数が増加し、4 mg/kg MeHg投与群はControl群と比較して後脚踏み外し回数が有意に増加した。また、4 mg/kg MeHg + OA3Glu投与群では4 mg/kg MeHg投与群と比較して後足踏み外し回数が有意に減少した。このことから、MeHgによって生じた後肢障害が、OA3Glu投与によって緩和されたことが示唆された。現在、脳組織においてOA3Gluの抗MeHg作用について組織学的解析を進めている。

【目的】有機金属化合物は、それを構成する有機骨格構造および金属と異なる反応性を示しうることから、活用の機会が広がっている。我々は報告例の少なかった求核性有機金属化合物の細胞毒性を有機セレンおよび有機テルル化合物を用いて検討したところ、diphenyl selenideおよびdiphenyl tellurideが血管内皮細胞に対する傷害性が低いことを明らかにした。本研究では、これら化合物の誘導体が内皮細胞機能の一つである線溶活性に及ぼす影響を検討した。

【方法】無血清あるいは10% ウシ胎児血清を含むDMEMで培養したヒト血管内皮細胞株EA.hy926細胞に2-[(N, N-dimethylamino)methyl]phenyl phenyl selenide（HU JK10-03）および2-[(N, N-dimethylamino)methyl]phenyl phenyl telluride（HU JK10-09）を処理した。細胞生存率はMTT assay、mRNA発現は定量的RT-PCR、培養上清中の線溶活性はフィブリンザイモグラフィーにより解析した。

【結果・考察】両化合物とも血清を含む培養条件では血管内皮細胞の生存率の低下は認められなかったが、無血清培養条件ではHU JK10-09は5 µＭから生存率の低下が認められた。次に、血管内皮細胞における線溶活性の活性化因子t-PAおよびその阻害因子PAI-1のmRNA発現を検討したところ、HU JK10-03の処理下においてのみ濃度依存的なt-PA mRNAの誘導が認められ、PAI-1 mRNA発現への顕著な影響は認められなかった。また、本結果と相関して、HU JK10-03を処理群の培養上清における線溶活性の亢進も認められ、中心金属の選択により血管内皮細胞の線溶活性を調節可能な有機金属化合物であることが明らかとなった。

　フードテック、すなわち食に関する最先端技術を活用した、これまでに食経験のない、もしくはこれまでとは違った方法により摂取されるような「新規の食品」の研究開発が進められているが、食経験に基づく安全性担保が困難なことから、安全性確保の仕組みが必要である。本研究では、諸外国における新規の食品の安全性確保に関する取り組みを把握することを目的に、規制の枠組み、定義、適用範囲、上市プロセス、5つの食品（遺伝子組換え食品、ゲノム編集食品、昆虫、細胞培養食品（いわゆる培養肉）、サプリメント）に着目してWeb上の公開情報を調査した。

　EU、シンガポール、オーストラリア・ニュージーランド、カナダには、新規の食品についてはNovel Foodsという包括的な規制の枠組みが存在し、その定義や適応範囲には食経験や製造方法の違いが考慮されているが、前述の5つの食品の規制上の位置づけは、それぞれの国で異なっていた。一方、米国にはNovel Foodsという枠組みは存在しないが、個々の規制区分とGRASの仕組みが受け皿となっている。米国以外の上記の国では、食経験のない食品については、安全性確保のために上市前の承認が求められている。例えば、細胞培養食品をNovel Foodsの枠組みの中で取り扱っているシンガポールでは、2020年に世界で初めてEat Just社の培養チキンナゲットの販売を承認し、培養肉に特化した安全性評価要件を示した。米国医薬食品安全局（FDA）は、2022年にUpside Foods社の鶏培養肉の市販前コンサルテーションを終了、安全性に関するこれ以上の質問がないことを表明し、オーストラリア・ニュージーランドの食品規制機関（FSANZ）は、2023年にVow社のウズラ培養肉の申請を受理し評価を開始した。今後も、新たなフードテックの開発状況に呼応した安全性に関する調査研究が必要と考えられる。

Recently, nanoplastics (NPls) has been detected in the natural environment, in marine organisms and in consumed condiments. Recently, evidence of microplastics has been found in human tissues, with polyethylene terephthalate (PET) being the most identified material. Polylactic acid (PLA) is advertised as biodegradable material. However, our previous study has found that PLA tea bags can also release NPls after hot water treatment. Recent in vivo study have found the accumulation of NPls in adipose tissue, while little research investigated the potential hazards to it. Therefore, this study used self-synthesized 94 nm PET and commercial 176 nm PLA to investigate the effects of different NPls on adipocytes. The results showed that when adipocytes exposed to NPls at concentrations of 1×10⁹ – 5×10⁹ particles/cm² for 24 h, the lower cell survival rates measured by the Cell Counting Kit–8 (CCK–8) assay was found for PET. The hydrophobicity of the particle surface may affect cellular uptake, so a Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was used to measure the proportion of NPls in octanol and water. We found that PET had 72% and PLA had 56% hydrophobicity. idye-pink labeled PET and green fluorescent PLA NPls were exposed for 4, 12 and 24 hours and observed an increasing trend in cellular uptake of the NPls as measured by flow cytometry, with PET showing a faster rate of increase. We will further investigate the role of NPls on adipocyte lipogenesis/lipolysis via triglycerides assay and related protein expression, and the release of cytokines (IL-6, CXCL-2, and RANTES) will also be detected.

『細胞培養食品』の技術革新がすすみ、近い将来市場化されることが考えられる。従って、その安全性評価に向けた課題の抽出についても同時に検証されなくてはならない。そこで本研究では、マウス消化管の線維芽細胞とウシの気管平滑筋細胞を用いて、その遺伝子発現解析から細胞培養食品の安全性指針について考察することを目的とした。（方法）成熟個体（８週令）のマウスの大腸ならびに小腸の筋層からPDGFRα陽性の線維芽細胞（Pa細胞）を採取した。また、ウシ気管より平滑筋細胞を単離しそれを15代まで培養継代した。これらの細胞からRNAを抽出し、RNAseq解析を行い、発現遺伝子について比較解析した。（結果）若齢個体の大腸ならびに小腸のPa細胞について遺伝子発現解析したところ、大腸では細部外基質系、細胞外骨格系、外部カプセル構造体系の遺伝子群の発現が多かったのに対して、小腸のPa細胞では血液循環系、細胞間接着制御系、細胞接着の正の制御系の遺伝子群の発現が多かった。ウシ気管平滑筋細胞について初代培養細胞と15代培養後の細胞についての遺伝子発現解析を異なる研究員二人で実施した。その結果、研究員によって変動する遺伝子発現に大きな相違が認められた。一方、15代継代した細胞であっても、がん遺伝子系や生理活性物質など人体の健康に影響を与えるような遺伝子の異常な発現増加は認められなかった。（まとめ）細胞培養食品の安全性指針として、 1) 一定の細胞培養系の樹立が必須であり、同じ細胞の培養食品であっても培養細胞製造場所や方法が異なれば、それぞれ遺伝子発現変動について確認する必要性が考えられた。同じ臓器であっても、部位が少し異なるだけで対象とする培養細胞の発現遺伝子群の構成は大きく異なることから、同じ細胞であっても採取する臓器の部位を一定にすることが重要と考えられた。

Perfluorooctanesulfonate (PFOS) is one of the most abundant organic pollutants and is widely distributed in the environment. Its toxic effects and biological hazards are associated with its long elimination half-life in humans. PFOS exposure has been reported to impair airway and lung function, but how it affects the lungs remains unclear. Experimental PFOS exposure in mice was used to elucidate the damage caused by PFOS to the lungs of mice. In the experiment, L-carnitine or perfluorooctane sulfonate were injected intraperitoneally for 3 months. At the end of experiment, the lung was examined. PFOS-exposed mice showed significantly enlarged alveolar spaces, thickened septa, and higher lung injury scores compared with unexposed or exposed with intraperitoneal L-carnitine injection. Compared with the other groups, the bronchial epithelium of the PFOS exposure group had more goblet cells stained by periodic acid-Schiff (PAS), and the interstitial tissue had a higher density of Masson's trichrome staining. In the immunohistochemistry study, we demonstrated that the percentage of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG)- and transforming growth factor-β (TGF-β)- positive cells were significantly higher in PFOS exposure mice. From these features, it can be concluded that PFOS induces oxidative stress and epithelial-mesenchymal transition (EMT)-associated fibrosis, thereby activating lung injury, which is attenuated by L-carnitine.

[背景・目的]

テトラブロモビスフェノールA (TBBPA)は世界で最も主要な難燃剤である。ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)は近年まで使用されていた難燃剤であるが、その毒性のため日本では2014年に原則製造及び使用が禁止された。TBBPAやHBCDは培養神経細胞において神経細胞死を引き起こすことが報告されているが、その詳細なメカニズムは明らかではない。本研究ではPC12細胞においてTBBPA及びHBCD処置後の遺伝子発現をRNA-seqにより網羅的に解析した。

[方法]

PC12細胞にTBBPA及びHBCDを24時間処置し、RNA-seqにより網羅的に遺伝子発現を解析した。発現変動遺伝子の検出及びエンリッチメント解析はiDEP.95により実施した。

[結果・考察]

TBBPA及びHBCDの処置により濃度依存的なPC12細胞毒性が観察された。TBBPAの処置により636個、HBCDの処置により271個の発現変動遺伝子がそれぞれ検出された。エンリッチメント解析によりTBBPA及びHBCDのいずれの処置においても、GO term “endoplasmic reticulum unfolded protein response”でアノテーションされた遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなった。

[結論]

臭素系難燃剤であるTBBPA及びHBCDはPC12細胞において小胞体ストレス応答を誘導し、神経毒性を引き起こすことが示唆された。

[参考文献]

Abe N, Sasaki M, Nakajima A. Environ Toxicol Pharmacol. 98:104056. (2023)

タンパク質のシステイン残基 (Cys) の酸化・還元を介したレドックスシグナル伝達は細胞内恒常性の維持に関与する．プロテインフォスファターゼ (PTP) 1B/上皮成長因子受容体シグナルは，PTP1BのSH基（PTP1B-SH）が酸化修飾（SO_nH化, n = 1 ­­- 3）を受けると，本酵素活性の阻害を介して活性化する．先行研究において，PTP1BのCysは過剰な活性酸素種の存在下ではSO₂HもしくはSO₃Hへと不可逆に過酸化されるが, 本Cysが超硫黄化（SS_mH化, m ≧ 1）されると，SSHが酸化されてSSO_nHが生成されてもS-S結合の還元を介してR-SHに再生されることを示した (Doka E et al, Sci Adv, 2020)．SH基は酸化修飾を受けるだけではなく, 親電子物質によっても修飾を受けることから, SH基の超硫黄化は親電子修飾に対しても可逆性の担保に寄与すると想定される．そこで本研究では，親電子物質曝露におけるPTP1B超硫黄化の保護作用について検討を行った．PTP1Bと二硫化ナトリウム（Na₂S₂）を反応させるとPTP活性は低下し, さらに1,4-ベンゾキノン（BQ）もしくは1,2-ナフトキノン（NQ）との反応によって本酵素活性はより阻害された. ところが, ジチオスレイトール（DTT）を加えると, PTP1B-SHへと還元されると共に阻害された本活性が回復した．また，DTTの代わりにTCEPを用いて還元を行っても同様の結果であった．PTP1Bの活性部位のCysがNa₂S₂の存在下で超硫黄化してPTP1B-SSHになり，BQおよびNQ曝露によりPTP1B-SS-BQおよびPTP1B-SS-NQのような付加体が形成されるが，S-S結合が還元されることでPTP1B-SHに再生されることが示唆された．

ジフェニルアルシン酸（DPAA）は、2003年茨城県神栖町（当時）の井戸水ヒ素汚染事故における主な原因物質である。DPAAは脳内の標的細胞であるアストロサイトに、濃度・時間依存的な細胞増殖亢進とそれに続く細胞死を引き起こし、10 µM の濃度で96時間ばく露するとMAPキナーゼ（p38MAPK、SAPK/JNK、ERK1/2）の活性化、および転写因子（CREB、c-Jun、c-Fos）の活性化、そして酸化ストレス応答因子（Nrf2、HO-1、Hsp70）の発現誘導といった異常活性化を引き起こす。本研究では、亜ヒ酸（iAs3）とヒ酸（iAs5）、そしてDPAAの代謝産物と考えられているフェニルメチルアルシン酸（PMAA）およびジメチルアルシン酸（DMAA）による影響を評価し、DPAAと比較することでアストロサイト異常活性化におけるDPAAの特殊性を評価した。まず、iAs3、iAs5にばく露したところ、iAs3またはiAs5による細胞増殖亢進はみられず、iAs3の細胞毒性はDPAAと同等であったが、iAs5の細胞毒性は100 µMでもみられなかった。DPAA（10 µM）、iAs3（10または20 µM）、iAs5（10または100 µM）ばく露による異常活性化の程度については、iAs5 ＜＜ iAs3 ＜ DPAAであった。また、PMAA、DMAAにばく露したところ、PMAAは二峰性の細胞毒性を示し、10 µM程度と100 µMのばく露により細胞生存率を低下させたが、DMAAは100 µMでも細胞毒性を示さなかった。DPAA（10 µM）、PMAA（10 µM）、DMAA（10 µM）ばく露による異常活性化については、DMAA ＜＜＜ PMAA ＜ DPAAであった。以上の結果は、アストロサイトの異常活性化はヒ素化合物の中でもDPAAに特異的なものであることを示唆する。

メチル水銀（MeHg）は水俣病の原因物質として知られる中枢神経障害を惹起する環境汚染物質である。我々は、変性タンパク質等の分解系であるオートファジーとMeHgの相互作用という視点から、低濃度MeHgに対する防御機構の解明に取り組んできた。本研究では、MeHgによる脂肪細胞への影響を明らかにする目的で、脂肪細胞の分化に対するMeHgの影響とオートファジーの関与について検討した。3T3-L1細胞に分化誘導剤を処理し、2、4、6、8日後における細胞内の脂肪滴をOil Red Oを用いて染色したところ、分化誘導剤処理4日後から脂肪滴が顕著に増加し、8日にかけて脂肪滴のサイズが増大した。MeHg（0.5 µM）を2日毎に加えた細胞は、対称群と比較して脂肪滴の数が多かった。LipiDye IIを用いて脂肪滴を染色した結果においても、1細胞あたりの脂肪滴の数は対称群よりMeHg処理群で有意に多かった。一方、直径10 µm以上の大きな脂肪滴を有する細胞の数は対象群よりMeHg処理群で減少しており、小さな脂肪滴が多く観察された。また、MeHg処理群は対象群と比較してPPARG、ADIPOQ、FABP4等のアディポカインの発現が有意に高く、特に脂肪細胞分化後期（Day 6-8）において顕著であった。さらに、オートファジー阻害剤であるクロロキンを脂肪細胞分化の初期（Day 0-2）に処理すると、MeHgによるアディポカインの発現の増加が顕著に抑制したが、後期（Day 6-8）では発現抑制効果は僅かだった。以上の結果から、MeHgが脂肪滴形成に影響を及ぼすこと、脂肪細胞分化を促進することが明らかとなった。また、脂肪細胞分化の初期におけるオートファジーが脂肪細胞分化に必要であることが示唆された。

子供の脳発達には甲状腺ホルモン（TH）が必須であることから、血中TH濃度を低下させる化学物質には発達神経毒性（DNT）が懸念されている。DNTを特定するガイドライン試験の実施には多大な資源を要することから、DNT試験に供試すべき化合物を適切・迅速に事前識別する方法の開発が切望される。近年、我々はラットの母動物と児動物の血中TH濃度への影響を調べるComparative Thyroid Assay（CTA、米国環境保護庁）に関し、児動物の脳中TH濃度測定や脳病理検査を追加した上で動物数を半減させた改良型CTAの実用性検証に着手した。既に、①TH合成阻害剤6-propylthiouracil（6-PTU, 10 ppm）の投与で、母動物での顕著な（>70%）血中TH濃度の低下、児動物での顕著な（>50％）血中・脳中TH濃度の低下や脳の組織異常（Heterotopia）が検出可能であること、②肝代謝酵素誘導剤sodium phenobarbital（NaPB, 1000 ppm）の投与で、母動物で軽度な（<35%）血中TH濃度の低下、胎児で軽度な（<35%）血中・脳中TH濃度の低下が検出されるものの、哺育児にTH濃度低下や脳の組織異常は誘発されないこと（再現性あり）を確認し本学会で報告した。今回、③TH濃度低下と脳組織学的異常の相関性を知るため、Heterotopia形成の臨界期（GD19-LD2）に6-PTU（0, 1, 3, 10 ppm)を投与した結果、母動物の血中TH濃度や児動物の血中・脳中TH濃度の低下、離乳児（生後21日）のHeterotopia形成が、いずれも用量依存的に出現することを確認した。①‐③の結果から改良型CTAは児動物へのTH影響評価法として実用性があると考えられるので、DNT試験への供試化合物スクリーニング法として、改良型CTA の活用を提案する。

【目的】甲状腺ホルモンは脳の発達や心機能を担う重要なホルモンであり、その機能は核内受容体である甲状腺ホルモン受容体（TRα及びTRβ）の活性化を介する。内分泌かく乱作用を評価するin vitro試験系としてレポーター遺伝子アッセイが挙げられる。我々は、簡便な試験系として、これまでにヒト及びネッタイツメガエル由来のTRαあるいはTRβを高発現した出芽酵母を用いたレポーター遺伝子アッセイを４つ構築した。そこで、ヒト及びネッタイツメガエルの２つの甲状腺ホルモン受容体（TRα及びTRβ）を評価する４つのレポーター遺伝子アッセイの検出能力を甲状腺ホルモン類及び既知の抗甲状腺ホルモン物質を用いて2施設で検証した。また、これまで蓄積した試験結果から設定した試験成立条件（陰性対照物質の変動係数、陽性対照物質のレポーター活性の増加率）の検証を行った。【方法】ヒト及びネッタイツメガエル由来のTRαあるいはTRβを高発現させた出芽酵母を被験物質存在下で16時間培養した。その後、レポータータンパク質であるβ-ガラクトシダーゼを出芽酵母から溶出させ、酵素活性を測定した。抗甲状腺ホルモン物質の評価については、甲状腺ホルモンと被験物質を同時に処理した。また被験物質の出芽酵母に対する毒性影響をβ-ガラクトシダーゼを恒常的に発現している出芽酵母を用いて評価した。【結果】ヒト及びネッタイツメガエル由来のTRα、TRβともに、甲状腺ホルモン類について濃度依存的なレポーター活性の増加が認められた。一方、ヒト由来の受容体では今回試験した抗甲状腺ホルモン物質は全て阻害活性が認められたが、ネッタイツメガエル由来の受容体では、阻害が認められなかったものもあった。今回の2施設の結果より、設定した試験成立条件は妥当であると考えられた。さらに試験実施施設や被験物質を増やし検証を継続する予定である。

副腎は様々なホルモンを合成する内分泌器官であり，副腎皮質束状帯では主にコルチゾールやコルチコステロンなどの糖質コルチコイドの産生・分泌が行われる．コルチゾールなどのステロイドホルモンの合成は，細胞内のコレステロールがsteroidogenic acute regulatory protein (StAR) によってミトコンドリアへと輸送され，CYP11A1やHSD3B2等による変換を受けることで行われる．したがってStARや各種代謝酵素の発現・機能に影響を与える化合物の曝露によって，細胞内コレステロール代謝が阻害され，その結果副腎毒性が引き起こされることがある．

ある疾患の治療をターゲットとした自社化合物の反復投与毒性試験において，副腎皮質束状帯における毒性（脂肪滴の蓄積）が頻発し，ステロイドホルモンの合成阻害が疑われた．そこで，本毒性のスクリーニング及びメカニズム検証をin vitroで行うための実験系としてH295R細胞に着目した．H295R細胞はヒト副腎皮質由来細胞株であり主要な全ステロイドホルモンの合成能を有することから，主に化合物の性ホルモン合成への影響を評価する系として利用されている．自社の20化合物について，ラットにおける血中薬物濃度及び副腎病理所見の程度ならびにH295R細胞におけるコルチゾール合成阻害能を評価したところそれらは関連する傾向を示し，副腎毒性評価におけるH295R細胞の有用性が示された．

また，自社化合物による副腎毒性のメカニズムについてH295R細胞を用いた検証も進めており，ステロイドホルモンの多成分分析やプロテオーム解析などの結果から，化合物による副腎毒性の原因としてStARの機能が阻害されていることが示唆された．

本演題ではSHIONOGIにおける副腎毒性評価系としてのH295R細胞の活用事例と，メカニズム解明のための研究結果について紹介する．

【背景】齧歯類を用いた反復投与毒性試験における甲状腺機能抑制物質の検出には甲状腺ホルモン測定が有用であるが、採血時の条件による変動が大きい等の問題がある。我々は最近、甲状腺ペルオキシダーゼ阻害剤、ヨウ素取込み阻害剤及び肝臓での代謝亢進を通じてホルモン動態に影響を及ぼす薬剤を28日間投与したラットで、病理組織学的・免疫組織化学的解析による評価は血中ホルモン値測定と比較し、より簡便かつ効率的な指標であることを報告した。本研究では甲状腺ホルモン脱ヨウ素反応の阻害物質を用いて同様の検討を行った。【方法】6週齢の雄SDラット（5匹/群）に30、100、300 mg/kgのIopanoic acid（IOP）を強制経口、0.06、0.25、1、4%のErythrosine（ER）を混餌にて28日間投与し、血清ホルモン値測定、甲状腺・下垂体の病理組織学的・免疫組織化学的検索を行った。【結果】IOP投与群では、血清T4及びTSHが30 mg/kg以上、T3が300 mg/kgで有意に増加し、甲状腺重量が100 mg/kg以上で増加した。病理組織学的検索では甲状腺濾胞上皮細胞肥大の発生頻度が30 mg/kg以上で有意に増加し、免疫組織化学的検索において下垂体前葉のTSH陽性面積率が100 mg/kg以上で有意に増加した。ER投与群では、血清T4、T3値及び甲状腺重量に対照群との差はみられなかったが、甲状腺濾胞上皮細胞肥大の発生頻度が0.25%以上で有意に増加した。【考察】甲状腺の病理所見が血清ホルモン値変動と同じ用量（IOP投与群）または有意な変動の見られない用量（ER投与群）から検出され、これまでの検討結果と同様に抗甲状腺物質の検出において鋭敏な指標となる可能性が示唆された。IOP投与群では、血清TSH値の増加に伴い下垂体TSH発現の増加がみられ、抗甲状腺作用の検出に利用可能と考えられた。

セルロースナノファイバー（CNF）は、軽量で高強度、低熱膨張性等の特徴を有する新材料として期待される一方、繊維状で超微細な特性から、産業利用のため健康影響の懸念の払拭が望まれている。これまで我々は、異なる原料樹種と製法により作製されたCNFの細胞影響を調べた結果、有意な細胞生存能力の低下や、乳酸脱水素酵素の放出、活性酸素種産生の上昇が認められなかった一方、有意な炎症性サイトカイン産生や炎症に関わる遺伝子の高発現が認められたことを確認した。一方、CNFの原料樹種や製法、物理化学特性によりその程度が異なるものの、CNF懸濁液中に細菌やカビ、エンドトキシン、β-グルカンが検出された。このため、炎症性サイトカインの産生や炎症に関わる遺伝子の高発現は、CNFの直接的な影響と共に、CNF懸濁液に含まれる微生物や生体由来物質の関与が考えられた。そこで本研究では各種CNF懸濁液の生物学的特性を評価すると共に、抗生物質や高温処理、高圧蒸気滅菌を事例とし、CNF懸濁液の物理化学的特性を評価しながら、滅菌や不活化の手法としての有効性を検証した。この結果、抗生物質、高温処理、高圧蒸気滅菌はCNF懸濁液中の細菌やカビの滅菌に対して有効であったが、高温処理および高圧蒸気滅菌はCNF懸濁液の物理化学的特性を損ねることが明らかになった。また、抗生物質、高温処理、高圧蒸気滅菌はCNF懸濁液中のエンドトキシンおよびβ-グルカンを不活化できないことが分かった。CNFの生体影響を評価する際、被験材料の物理化学的特性のみならず生物学的特性を明らかにすることは重要である。本研究は、CNFの生体影響評価の手法の確立や、生体影響の解明のための有用な知見と考える。

Recently, cross-linked hyaluronic acid (cHA) is widely applied for injectable dermal filler. The current method to form cHA is to use BDDE (butanediol glycidyl ether) or DVS (divinyl stilbene) as crosslinkers. However, in addition to the structural strength of hydrogels that can be further enhanced, the potential toxicity and carcinogenicity of the residual cross-linking agent are problems that those kinds of products still need to improve. In this study, a two-step double-crosslinked hyaluronic acid (dcHA) was developed to enhance colloidal strength and lower crosslinkers concentration with the interpenetrating network. HA-PEG_DE/HA_Mal-PEG_SH (HP_DH_MaP_S) and HA_Mal-PEG_SH/HA_MAC-PEG_SH (H_MaP_SH_MAP_S), also named dcHA hydrogels, were prepared by HA or HA derivatives combined with one or two cross-linkers. The dcHA hydrogels could achieve the same strength and longer linear viscoelastic region (LVR) compare to commercial cHA products. In creep-recovery test, each dcHA hydrogel also showed lower permanent strain compared to commercial cHA products and indicated that there were more completely chemical networks in dcHA hydrogels. Moreover, dcHA hydrogels showed obvious double-crosslinking structure in scanning electron microscope (SEM). In animal study, both dcHA hydrogels and commercial cHA were found that the implants could keep at least 8 weeks in Balb/c mice by ultrasound. In addition, HP_DH_MaP_S showed the lower degradation rate than commercial cHA with a dorsal ear model of new zealand white rabbit. In conclusion, due to better rheology properties and suitable biocompatibility, dcHA hydrogel was a kind of potential dermal filler worthy of further development.

ナノテクノロジーの発展に伴い、その基幹材料であるナノマテリアルの安全性向上が求められている。ヒトを含む自然界の生物に悪影響を及ぼさないナノマテリアルの開発のためには、ナノスケールの物質特有の生体影響、特に他の化学物質と異なる影響を誘発する原因の解明が必須である。そこで我々は、ナノマテリアル特有の毒性を捉え、その機序解明を目的に行っている。特に本研究では、国際的に問題視されている、ナノマテリアルの発達神経毒性を対象に研究を遂行した。ナノマテリアルとして広範に用いられる二酸化チタンナノ粒子（TiO₂-NP）またはカーボンブラックナノ粒子（CB-NP）を妊娠5, 9日目のICRマウスに経気道投与（3～95 µg/kg）し、6, 12週齢仔から脳を摘出した。組織学的解析により脳全域を観察し、検出され病変部をin situ 赤外分光法やタンパク質発現解析を用いて評価した。結果、老廃物の除去を担う脳血管周囲マクロファージの消化顆粒肥大化と正常細胞数の減少が、NP曝露群に認められた。その異常な脳血管周囲マクロファージに接するアストロサイトにおいて、グリア繊維性酸性タンパク質（GFAP）とアクアポリン4（AQP4）の曝露量依存的な亢進が認められ、NP胎仔期曝露は脳血管周辺のアストロサイトの過剰活性（グリオーシス）を誘導することが示された。さらに赤外スペクトルを比較した結果、各細胞に異常が生じた脳血管周辺においてのみ、タンパク質の変性を示すスペクトルシフトが認められた。そのシフトの生じた脳血管周辺のアストロサイトと脳血管周囲マクロファージでは、異常構造タンパク質の蓄積に応答し、グリオーシスや細胞死の原因となる小胞体ストレスマーカーATF6とCHOPの亢進が確認された。以上から、NP胎仔期曝露は脳血管周囲病変を誘導し、それは異常構造タンパク質の脳血管周辺への集積に起因する可能性が示唆された。

二酸化チタン（TiO2）は人体への影響が少ないとされている一方で、TiO2ナノ粒子（NPs）の安全性が注目されている。我々は銀NPsの毒性はそのサイズによって異なり、10 nmの粒子はマウスに致死的な毒性を示すことを見出した。そこで本研究では結晶子サイズ6 nmのTiO2 NPsをF344/DuCrlCrjラットの雌雄に90日間反復経口投与し、毒性影響を検討した。死亡例はなく、体重、尿検査、血液学、血清生化学、臓器重量において、投与に関連した毒性影響は観察されなかった。病理組織学的検査では、消化管内腔、鼻腔、気管、回腸のパイエル板、頸部および縦隔リンパ節、気管支関連リンパ組織に黄褐色の物質の沈着が認められたが、その周辺には免疫応答などの生体反応は観察されなかった。肝臓、腎臓、脾臓のチタン濃度分析から、これらの組織にはTiO2 NPは蓄積されていないことが示された。大腸陰窩の免疫組織化学分析では、前がん病変を示唆するβ-カテニンの核移行は見られなかった。28日間反復経口試験の肝臓標本を用いてDNA損傷誘発性を調べたところ、小核やγ-H2AX陽性を示す肝細胞の有意な増加は認められなかった。また黄褐色物質の沈着部位でも、γ-H2AX陽性を示す細胞は認められなかった。これらの結果から、結晶子サイズ6 nmのTiO2 NPを1,000 mg/kg bw/dayの用量で90日間反復経口投与しても、ラットの一般毒性、チタンの蓄積、大腸陰窩異常およびDNA損傷の誘発において、毒性影響は見られなかったと結論した。

神経発達障害（自閉症や注意欠陥多動性障害など）の病因の一つとして、妊娠母体への農薬曝露が考えられている。特に、神経回路の基盤を成す「シナプス」の形成は脳発達時期の最も重要なステップであるが、農薬曝露による神経シナプスの調節機能への影響については未だ不明のままであり、その定量的評価が求められている。我々は、これまでに脳内遺伝子発現可視化マウスを用いた神経毒性の解析を通して、除草剤のグルホシネートを曝露することで神経活動依存的にシナプス調節を担うArc遺伝子に異常な発現誘導変化が生じることを発見した。そこで今回、グルホシネート曝露によるシナプス形成の変化の有無について解析を行った。胎生期にグルホシネート曝露を施したマウス胎児から調製した培養神経細胞を用いて、シナプス前終末への分化誘導能を測定・定量した結果、生理食塩水投与群（対照群）と比較して、シナプス前終末の誘導量に有意な低下を認めた。また、培養神経細胞の発達段階に沿った遺伝子発現解析を実施した結果、グルホシネート曝露群で発現変動を示した遺伝子に軸索誘導やシナプスなどの神経発達に関連するものが含まれていた。さらに、シナプス誘導前後の遺伝子発現解析から、グルホシネート曝露群では、神経活動依存的な応答性を示す遺伝子の一部において、発現誘導が生じにくくなっていることが分かった。引き続き、このシナプス病態の分子機序の詳細について解析を進めている。以上、シナプス形成の定量的な解析を通して、胎生期のグルホシネート曝露によってシナプス誘導能の一部が変化し、その結果、神経ネットワーク構築に影響が生じている可能性が示唆された。

グリオブラストーマ（GBM）は難治性の脳腫瘍であり、新たな治療法の開発が急務である。GBM患者組織の遺伝子発現に関するin silico解析から、セレノプロテインP（SeP）の発現量が多い患者で予後が悪いことを見出した。更に興味深いことにSeP遺伝子のアンチセンス鎖にコードされる遺伝子、CCDC152の発現が高い脳腫瘍は、悪性度の高いGBMと相関することが示唆された。そこで我々は、本遺伝子座が脳腫瘍の悪性化に関与するメカニズムの解明を目指した。 SePとCCDC152遺伝子の発現が認められるグリオブラストーマ細胞株T98G細胞に対してSePおよびCCDC152のsiRNAを処理することで、GBMの増殖抑制が認められた。SePは受容体であるApoER2を介して細胞増殖作用を示すと考えられる。ApoER2 siRNAによって確かに細胞増殖は低下し、SePとApoER2の二重発現抑制では相加的な作用は認められなかったことから、SeP/ApoER2は同一経路で細胞増殖作用を発揮していることが示された。一方、CCDC152を発現抑制するとApoER2のタンパク質レベルが低下した。ApoER2発現抑制細胞のRNA-seqでは、細胞周期関連遺伝子が大きく変動したこと、および発現抑制により細胞分裂周期がM期でアレストされる現象が観察されたことから、SePおよびCCDC152は少なくともApoER2を介した細胞分裂の亢進によってGBMの増殖促進に関与していると考えられる。ApoER2はセレン取り込み促進を介した抗がん剤によるフェロトーシス耐性獲得に関与することも知られる。CCDC152の発現抑制によってフェロトーシス耐性因子であるグルタチオンペルオキシダーゼ4の発現が低下するとともに、フェロトーシスが増強することが明らかとなったことから、上記機構は抗がん剤耐性獲得にも関与することが示唆された。

【目的】3次元培養したオルガノイドは、人間の脳や神経の発達、進化、機能、疾患、毒性試験など、幅広いテーマのための研究ツールとして、大きな可能性を秘めている。我々は、これまでにヒト胚性幹(ES)細胞を用いたin vitro神経発達毒性評価テストにおいて、メチル水銀の感受性や鍵となる遺伝子の同定や、サリドマイドのメカニズムなどを明らかにしてきた。そこで、より汎用性の高いiPS細胞を用いてin vitro神経発達毒性試験に適した3D神経オルガノイドの構築を試みた。【方法】RIKEN細胞バンクから分配を受けた日本人女性のヒトiPS細胞株を使用し、フィーダー細胞を用いない平面培養で維持培養した後に、分化培地を用いて、超低接着性96-well丸底プレートで均一したサイズのEB胚葉体を作成した。この基本培養条件において、EB胚葉体形成時にbFGF（4 ng/μL）の存在下、非存在下での生育影響を検討した。その後、Smad阻害剤入りの誘導培地で神経誘導を行い、マトリゲル包囲する条件下で神経上皮を増殖培養した後、小型オービタルジェーカーで50日目まで長期培養した。最終的に、EB胚葉体形成時の培養条件や、その内部構造の形態変化が毒性評価の指標になりうるかを解析した。【結果および考察】 分化初期におけるbFGFの曝露は、神経細胞の発生や増殖にあまり大きな変化は確認されなかった。従来の培養方法の改良により、長期培養を実現した。また、共焦点蛍光顕微鏡観察により、神経オルガノイドは、神経層構造や、散在する神経上皮細胞のクラスターも観察でき、既報と非常に近いオルガノイドの作製に成功した。さらにこの神経オルガノイドを用いて農薬化学物質の曝露影響を検討したので、併せてその結果を紹介し、創薬や食品成分の安全性・毒性評価への適用の可能性について検討した。

神経毒性における化学物質の in vivo 評価には、かなりの時間と費用が必要であること、げっ歯類からヒトへの外挿が必要であること、毒性メカニズムに関する情報が限られていることから、一定の制限がある。この問題に対処し、化学物質における神経毒性を評価するためには、New Approach Methodologies を使用した in vitro 試験法の開発が重要である。平面微小電極アレイ (MEA)は、電極上に神経細胞を培養することで神経の電気的な活動を計測することができ、化学物質暴露による神経ネットワークの活動変化を評価できる。ただし、化学物質の評価基準に関する議論は未だ不十分である。この研究では、ヒト iPS細胞由来ニューロンのMEAデータを使用して、神経活動に対する殺虫剤の影響を評価した。MEA計測で得られた電気生理学的パラメータについて主成分分析を行い、化学物質暴露による過剰な神経活動への影響を、溶媒添加時の神経活動の標準偏差を用いて定義した。MEA計測における神経毒性の陽性対照として既知の痙攣誘発化合物を使用し、ヒトでの神経毒性の検証が不十分な殺虫剤を評価することにより、これらの殺虫剤がヒトで神経毒性を示すことが示唆された。さらにMEA計測における、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、GABA_A受容体阻害剤、Naチャネルopenerとして作用する殺虫剤の特徴的な応答を明らかにすることで、殺虫剤の作用機序推定を検討した。結論として、ヒトiPS細胞由来ニューロンのMEAデータを使用した神経毒性評価法が、動物実験の代替となる in vitro 神経毒性試験法の 1 つとして期待される。