Exposure to arsenic (As) is a major threat to the public health worldwide. Association of As exposure with neoplastic diseases has been well established. Mounting evidence suggest the involvement of As in non-neoplastic diseases. In our study, we explored the association of As exposure with the risk of diabetes and asthma recruiting human subjects from low and high As exposed areas in Bangladesh. We found that As exposure was dose-dependently associated with risk of hyperglycemia including IGT and DM. Females showed greater susceptibility to As exposure-related hyperglycemia than males. In a follow-up study, we found that chronic As exposure was inversely associated with serum creatinine levels. Serum creatinine levels directly reflect the skeletal muscle mass. Arsenic exposure-related increased blood glucose levels were inversely associated with serum creatinine levels suggesting that decreasing skeletal muscle mass may be a potential mechanism of As-related diabetes. In another study, we found that As exposure associated with the risk of the reversibility in airway obstruction and asthma-like symptoms, the two important characteristic features of asthma. Subjects’ As exposure levels were also associated with the elevated levels of serum immunoglobulin E and Th2 cytokins. Arsenic exposure-related reversibility in airway obstruction, asthma-like symptoms and elevated levels of serum IgE and Th2 cytokines suggest that As-exposed people are susceptible to the allergic asthma. Taken together, our results show the risk and underlying mechanism of diabetes and asthma associated with chronic As exposure.

Metabolic disorders are frequently caused by nutritional, behavioral and metabolic factors as well as by diverse chemical exposure. Together with inflammation and endothelial dysfunction, fatty liver is one of the related disorders in metabolic syndrome. Chemicals induce fatty liver by disturbing normal lipid metabolism including enhanced lipogenesis and free fatty acid uptake as well as decreased fatty acid oxidation and VLDL secretion. As a novel mechanism of ethanol- and diet-induced fatty liver, we report that downregulation of 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), a critical enzyme involved in the serine synthesis, and low hepatic serine level contribute to the development of fatty liver disease through suppressing SIRT1. Autophagy is one of the essential catabolic pathways activated in response to nutrient deprivation. Recently, lipid droplets have been identified as a substrate for autophagy. Some NSAIDs induces hepatic lipid accumulation and fatty liver by disturbing lysosomal degradation of PLIN2, a substrate for chaperone-mediated autophagy. Identification of novel mediators of fatty liver will contribute to the development of strategies for the treatment and prevention of the disease.

Drug-induced liver injury (DILI) remains a major safety concern; it occurs frequently; is idiosyncratic; cannot be adequately predicted; and a multitude of underlying mechanisms have been postulated. Many experimental approaches to predict human DILI have been proposed utilizing in vitro screening such as inhibition of mitochondrial function, hepatobiliary transporter inhibition, reactive metabolite formation, and cellular health, but achieving only minimal success. We have shown that none of the multitude of hypothesized and investigated predictive markers does any better than just avoiding extensively metabolized, poorly soluble compounds, so-called Biopharmaceutics Drug Disposition Classification (BDDCS) Class 2 drugs. Yet, this is not a useful restriction as more than 1/3 of approved drugs are BDDCS Class 2 compounds. Once a clinically relevant dose is known, studies have shown total administered dose (> 50 mg) to be correlated with higher predictability of DILI. It would be best to have a predictive DILI methodology early in drug development, long before the clinical dose is known. We hypothesize that many of the deficiencies of the high-throughput screens employed based on in vitro measures of hepatocyte toxicity can be overcome with long-enduring metabolically competent hepatocyte co-cultures. The long- enduring status has the potential to allow formation of active metabolites and/or accumulation of intracellular toxic substances in hepatocytes due to inhibition of relevant efflux transporters, as well as giving sufficient time for the hepatotoxicity to manifest.

Rodent in vivo carcinogenicity bioassays are required for human risk assessment and have been utilized in this capacity for decades. Accordingly, there is an abundance of data that could be accessed and analyzed to better understand the translatability of xenobiotic-induced rodent tumors to human risk assessment. In the past decade various groups have studied and published their assessment of the value garnered by these very lengthy and costly studies. The Expert Working Group (ICH-S1 EWG) was initiated in 2012 to evaluate the predictability of the current testing paradigm and to propose a more comprehensive and integrated approach to human carcinogenicity risk assessment. Results and recommendations by this working group are pending. Key to this effort is the translation of rodent carcinogenicity findings to humans. Some tumors were shown to be rat-specific based on mechanism of action, while others with insufficient evidence remain of potential risk to human. CNS tumors in the rat are very rare and translatability to human remains unknown. This presentation focuses on one type of CNS tumor (microglial cell tumor [MCT]) which is observed specifically in male rats that were exposed to a few pharmaceutical drugs and discusses the classification, nomenclature, potential mechanism of action of this type of CNS tumor, and speculates about its relevance to human.

　金属アレルギーは細胞性免疫依存のIV型アレルギーに分類され、接触性皮膚炎などの臨床症状を呈する。様々な金属アレルゲンのうち、ニッケル（Ni）は、抗原性検査における陽性率の高さなどから最も重要視されている。一方、金属アレルギーの治療には「原因金属の除去」という古典的とも言える手法が標準的に用いられているのが現状である。このため、金属アレルギーの病因論にもとづいた、新たな予防・治療法の開発が望まれている。

　我々の研究室では、グラム陰性菌の菌体成分であるリポポリサッカライド（LPS）をアジュバントとして用いる金属アレルギーマウスモデルを開発し、金属アレルギーの病態解明と治療法の開発に取り組んでいる。本マウスモデルでは、LPSを含む金属イオン溶液の腹腔内投与により金属に対する特異免疫を誘導する（感作相）。そして、耳介に金属溶液を皮下接種し（チャレンジ）、耳介の腫脹を指標としてアレルギー反応を測定する（惹起相）（Sato N. Clin. Exp. Allergy 2007; 37: 743-751.）。

　金属イオンは単独では抗原性を発揮せず、何らかの自己分子と結合することにより免疫応答を惹起するハプテンとして機能すると考えられている。近年、我々は、ケモカインの一種であるCXC chemokine ligand 4が新規Ni結合タンパク質であり、感作相および惹起相のいずれにおいてもNiアレルギーを増強することを報告した（Kuroishi T. Clin. Exp. Allergy 2017; 47: 1069-1078.）。

　さらに、金属イオン蛍光プローブを用いた解析から、皮膚所属リンパ節の遊走性樹状細胞は高いNi結合能を示し、Niアレルギーの惹起能を有することを明らかにした。

　本講演では、我々の研究成果を紹介するとともに、金属アレルギーの新たな予防・治療法の可能性について考察したい。

ヒトに初めて投与する臨床試験に先立ち、薬剤の候補化合物の安全性を評価する目的で、各種の安全性試験が開始される。これには、哺乳動物を用いたin vivoの毒性試験や、細胞を用いた in vitro の試験が含まれる。薬物動態評価についても、1990年代の前半までは実験動物を用いたものに限られていたが、その後ヒトの肝臓試料等が入手可能になり、従来の動物実験に加えて、in vitro のヒトでの代謝試験、毒性研究が大きな比重を占めるようになった。これにより、非臨床の薬物動態試験は、1。毒性試験で用いられた動物とヒトの代謝の類似性を確認して毒性試験の妥当性を示す、2。ヒトの薬物動態をシミュレートして副作用(特に薬物相互作用)を予測する、というようなヒトの安全性を担保する役割を担っている。しかし、その問題点は、均質なヒト肝細胞の試料の安定供給であり、我々の目的である新たなヒト肝細胞の作製は、新規毒性試験のツールを提供することが可能となる。すでに我々は、生体外で成熟肝細胞を肝前駆細胞へとリプログラミングする技術を開発した(勝田、落谷ら、Cell Stem Cell, 2017)。この方法は低分子化合物を用いるだけで遺伝子組み換え操作を伴うことなく安全かつ効率的に、自己複製能をもつ肝前駆細胞を作製できる、画期的な技術である。また、作製した前駆細胞からの機能的肝細胞の誘導も極めて容易であることから、毒性研究はもとより再生医療への幅広い応用が期待される。

　経済協力開発機構（OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development）はEAGMST（Extended Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics）というプロジェクトにおいて、化学物質のヒトや野生動物への悪影響に関する知識向上のため、毒性発現経路（AOP: Adverse Outcome Pathway）を開発している。AOPとは、化学物質等が個体または集団に有害性をもたらす経路であり、化学物質の曝露から、吸収・分布・代謝の過程、および分子、細胞、組織・臓器・器官、個体に生じる連続的な事象である。AOPは当初、環境毒性の発現経路を明確にするために、米国環境省（US EPA：United States Environmental Protection Agency）で開発され、以後OECDにて採用され、この情報をもとに環境毒性やヒト健康影響に関するin silicoやin vitro試験の開発を促すためにその概念が発展してきた。このプロジェクトは2012年に設置され、US EPAとEU JRC（Joint Research Centre）が中心となって作成ガイダンスや入力フォームAOP wikiやEffectopedia等の開発、AOPの普及・教育が行われてきた。ただし、これまでに成立したAOPはまだ10に満たず、現在、70程度のAOPが開発中であるに過ぎない。OECDのAOPとは、毒性発現までの過程をなるべくシンプルに、枝分かれ少なく記載しようというものであり、MIE（Molecular Initiation Event）から始まり、KE (Key Event)とKER（Key Event relation ship）からなり、AO（Adverse Outcome）に至る。それにより、証拠の重み付け（WoE: Weight of Evidence）が明確になっていくことが期待される。開発者はEAGMSTに申請した後、入力フォームにそれぞれのAOP案を入力し、そのAOPはEAGMSTによる内部評価を受けた後、外部第三者評価を受けて公定化される。

　日本においては、このプロジェクトの中で、免疫毒性、発がん性などに関する25本のAOP開発を提案している。残念ながら、まだ成立した日本のAOPはないが、今後、種々の日本発AOPが公定化され、全身毒性試験に関する多くのin silicoやin vitro試験の開発に寄与できることを祈念している。

環境医学において硫化水素（H₂S）毒性とイオウ解毒代謝機構が長く議論されてきた。近年、硫化水素関連代謝物であるシステインパースルフィド（CysSSH）が生体内で大量に合成され、強力な抗酸化活性や親電子シグナル制御機能を発揮していることが明らかとなった。我々は、CysSSH生合成機構を解析するなかで、タンパク質翻訳酵素の一つであるシステインtRNA合成酵素（cysteinyl-tRNA synthetase, CARS）が、全く新規のCysSSH生成酵素（cysteine persulfide synthase）であることを証明した。真核細胞・ほ乳類細胞においては、細胞質に存在するCARS1とミトコンドリアに局在するCARS2があるが、この内CARS2により合成されるCysSSHとその還元代謝物である硫化水素が、ミトコンドリアの膜電位形成を介して、電子伝達系を維持・促進することで、イオウに依存したエネルギー代謝を営んでいることが分かってきた。一方我々は、ミトコンドリアにおいて、硫化水素の解毒酵素であるsulfide:quinone reductase（SQR）が、 CysSSHから還元的に放出される硫化水素を酸化的に分解し、硫化水素のプロトンと電子を呼吸鎖のQサイクルを介して電子伝達系に再導入していることを明らかにした。イオウ代謝物を用いた電子伝達系は、原核細胞ではイオウ呼吸として知られており、生物進化におけるエネルギー代謝の起源である。すなわち、この原始的なイオウ呼吸が、真核細胞、ほ乳類・ヒトにおいても重要なエネルギー代謝経路として進化論的に良く保存されており、一方で、その代謝制御の破綻がイオウ毒性による代謝病態をもたらすことが示唆される。本講演では、内因性イオウ代謝物のユニークな生理機能の理解と毒性学という視点から環境医学の新たなパラダイムを展望する。

　脂溶性を有する化学物質は受動拡散などにより細胞内に取り込まれ、CYPのような異物代謝酵素によって酸化される（フェーズ1反応）。生じた代謝物はGSH転移酵素やUDP-グルクロン転移酵素の存在下、GSHやグルクロン酸のような極性基が導入され（フェーズ2反応）、最終的にトランスポーターを介して細胞外に排泄される（フェーズ3反応）。一連の反応は異物代謝の世界で広く受け入れられてきた。一方、我々は約10年前から東北大学・赤池教授らと共同研究を開始し、親電子物質と未知の求核低分子との相互作用について検討を行ってきた。その結果、システインパースルフィド（CysSSH）、グルタチオンパースルフィド（GSSH）や硫化水素（H₂S）のような活性イオウ分子（Reactive Sulfur Species: RSS）との反応により生じるメチル水銀、カドミウムおよび1,4-ナフトキノンのイオウ付加体を同定した。それぞれのイオウ付加体は、母化合物曝露で観察されるレドックスシグナル伝達活性化や毒性を殆ど示さなかった。このことは従前から知られていたGSHによる解毒・排泄以外に新たな機構が存在することを示唆している。我々はRSS産生酵素のひとつであるcystathionine γ-lyase（CSE）のノックアウト（KO）および高発現（Tg）マウスを作製し、CSEKOマウス臓器中RSS量が野生型のそれらより顕著に低いにもかかわらず、Tgマウスの臓器中RSS量は野生型と殆ど変わらない知見を得た。しかしその一方で、Tg マウスの血漿中RSS量は野生型より有意に高く、初代肝細胞でも細胞内は同程度であるが、培養液中RSS量はTgマウスの方が野生型より有意に高かった。また、その培養液と親電子物質を反応させると、イオウ付加体の生成が見られた。このことは、細胞内で産生された活性イオウ分子は細胞外に排泄され、親電子物質の細胞内侵入の前に捕獲・不活性化していることを示唆している。本教育講演では、我々が提案する「フェーズゼロ反応」について紹介し、新たな解毒システムについて考察したい。一連の研究は基盤研究（S）(2013〜2017年度、2018〜2022年度)の支援により実施している。

　毒性学は現実の科学である。対象，曝露濃度，曝露時間，毒性指標などの研究条件は，原則として実際に人に起こったか，少なくとも現実的に起こり得るものに限られる。血管の生物学が1980年代以降に急速に発展したのに対し，血管を標的とする毒物の例が大きな問題にならなかった経緯もあって血管の毒性学は国際的にも停滞が続いていた。しかしながら，生活習慣病として重要な循環器疾患に環境汚染物質が関与するのではないかという観点から，血管の毒性学に属する研究が少しずつではあるが疫学や動物実験を中心に行われてきた。

　我々はそのような研究のメカニズムを解明するための重金属の血管毒性研究を進めてきたが，血管の毒性学の意義はそれにとどまらないことに気づいた。すなわち，「血管は，あらゆる組織に普遍的に存在するので，血管の機能障害が重金属の器官毒性に影響を及ぼす可能性を常に考えなくてはならない」「器官実質細胞は血管内皮細胞を経ることなく重金属に曝露することは不可能なので，内皮細胞は重金属毒性の標的になり得る」「重金属の器官毒性における血管毒性の影響の大きさと現れ方は，その器官を構成する細胞によって異なる」。

　血管を構成するcell typeはその血管の大きさによって異なるが，共通しているのは内皮細胞が血管内腔を一層で覆っていることである。メチル水銀は代表的な神経毒であるが，それによる大脳障害は深い脳溝の周囲に限局して発生する。その理由として，メチル水銀が引き起こす脳浮腫が深い脳溝で循環障害を発生させることが示唆されていた（浮腫仮説）。我々はメチル水銀の血管毒性を解析し，浮腫仮説に分子基盤が存在することを示した。

　血管毒性を視野に入れることで不明であったメカニズムが理解できた一例である。血管の毒性学が新しい視点をもたらし，毒性学研究が前進することを期待している。

武田薬品工業株式会社は湘南にある最先端の設備を備えた自社研究所をオープンイノベーションの拠点として2018年4月に開所した。新たなサイエンスパークは湘南ヘルスイノベーションパーク（アイパーク）と名づけられ、多様な研究者やプロジェクトが集い、最先端の科学を革新的な解決法として患者に届けていく活発なイノベーションエコシステムの構築をめざしている。企業家精神を醸成しベンチャーを支援することで、革新的なアイディアの実用化を加速していく試みである。また入居企業同士が交流し、アイディアが結びつくことであらたなサイエンスやビジネスが生まれていくことを期待している。2019年1月31日時点でアカデミア、企業、ベンチャー、法律事務所など多様な会社が32社入居しており、今後も魅力的な技術やサービスをもったライフサイエンスのプレーヤーが湘南に集結し、日本のホットスポット形成に貢献することを期待している。

食品が安全であることは公理であり定理ではないといわれる。一方で食品安全にはゼロリスクも存在しない。食品の国際基準を決めてきたコーデックス委員会が人々の健康保護を最優先に掲げて「科学」を基本とした食品安全の枠組み「リスクアナリシス」を構築してから20年、我が国がその枠組みを導入してから15年が経過した。リスク評価はこの枠組みの構成要素の一つであり、懸念の対象となる化学物質や微生物などのハザードについて科学的知見に基づき解析し、人々への健康のリスクを科学的判断により導き出す役割を担う。もう一つの構成要素であるリスク管理ではリスク評価結果を基に人々の健康が保護されるよう適切な措置を講じる。しかし人々の関心は未だにリスク評価結果でなく、発がん性の有無に代表されるようにリスク評価の最初の段階であるハザード評価に集中しているように思える。また残念ながら我が国では、人々がそのハザードを現実的にどのぐらい摂取しているかというデータに基づく曝露評価や、その現実的な曝露量で健康への懸念が起きうるのかというリスク判定に関する議論が国際的なレベルに至らない場合も多い。施設内で行われる動物実験とは異なり、人々の食生活は地域により多様であることから、曝露評価によるハザードの国ごとの摂取量の適切な推計は、その国の人々の健康を守るため必要である。近年では目覚ましい科学技術の進歩とともに、新たな機能や特定の機能を付与された食品の開発や、残留成分の分析法の精緻化が進んでいる。現在国内外で取組みが進められているが、ハザードのばく露評価を基軸とした食品のリスク評価へと歩を進める時期が到来したと言わざるを得ない。そこで本講演では、会場の皆様とともにもう一度食品のリスク評価の基本的構造や理念を復習し、曝露評価を重要性について再確認したい。本講演が、続くシンポジウムでの各専門家の講演の一助となれば幸いである。

我が国、欧米等の化学物質管理規制と、毒性評価方法の国際的動向を踏まえ、現在当省で進めている、インシリコ手法による毒性評価手法に対する期待について説明する。

　2017年6月から、経済産業省による毒性関連ビッグデータを用いた人工知能による次世代型安全性予測手法開発プロジェクト（AI-SHIPSプロジェクト）がスタートした。現在、毒性発現メカニズムに基づく毒性予測システム開発に取り組んでいるが、そのために必要となる各モデル構築のためのデータの整理及び実験によるデータ取得インビトロ実験を実施している。AI-SHIPSプロジェクトにおいて開発が進められている、毒性発現メカニズムに基づく毒性予測システムの開発の背景、目的、開発システムの概要および毒性予測システムを構成する予測モデル構築の考え方について紹介する。特に、予測モデルに関しては、毒性発現に関係すると思われる実験データから得られる情報を予測モデル構築時の記述子として導入することで、毒性未知の化学品に対して予測された毒性の発現メカニズムに関する情報提供が可能となることを目指している。このほか今後のシステム開発の方向性などについて、プロジェクトリーダーとしての考え方を述べる。

　工業用途に使用される化学物質の中でとりわけ機能性化学物質は、高度なテクノロジーが求められる高性能電池や次世代半導体開発等において不可欠の重要な要素であり、優れた機能性を有する化学物質をいかに迅速に、効率的に創製するかが我が国の産業の競争力強化に向けた課題である。

　一方で、機能性の追求と毒性は不可分であり、周知のとおり国内においては新規な化学物質の上市時「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」（以下化審法）の届出が義務付けられており年間国内で一定量以上生産・輸入される新規物質は生分解試験、蓄積性試験およびスクリーニング毒性試験が求められる。　　

　このうち「哺乳類を用いる28日間反復投与毒性試験」は動物に被験物質を28日間毎日反復投与したときに現れる生体の機能及び形態の変化を観察することにより、被験物質の毒性を明らかにすることを目的とするものであるが本試験では一般的に期間約6か月、1200万円以上のコストがかかっているのが実体である。　　

　現在、化学物質の研究開発コストの削減と動物愛護の観点から、欧米では動物を使った従来の毒性試験に替わる試験（インビトロ試験及びインシリコ手法）の開発が推進されている。このような状況で我が国は、化審法に基づき40年間にわたり蓄積された質の高い膨大な動物実験データを用い、人工知能技術や毒性学、分子生物学等の最新の研究成果を活用し、化学物質の毒性発現機序に基づく高精度な有害性予測手法を開発することを目指すことが求められた。本講演では本有害予測システム開発プロジェクト（AI-SHIPS）の推進するうえで具体的内容、課題と米国EPAや欧州における同様なシステムの開発状況を概説する。

　化学物質の安全性評価において動物実験代替法の開発が求められている。反復投与毒性試験は、化学物質の毒性学的特徴を評価する重要な試験であるが、評価項目の多さ、毒性発現機序の複雑さなどの理由により、ほとんど開発が進んでいない。安全性評価においては毒性発現機序に基づいた考察が重要であることから、代替法の開発においても機序情報を考慮する必要がある。私達のグループでは、製品評価技術基盤機構により公開されている有害性評価支援システム統合プラットフォーム（HESS）に搭載されているラット反復投与毒性試験データを学習用データセットとして利用して、各種インビトロ試験ならびにカテゴリーアプローチやリードアクロス手法等のインシリコ手法を活用した、反復投与毒性、特に肝毒性の評価・予測モデルの開発に取り組んでいる。本シンポジウムでは、平成29年度から実施している経済産業省受託事業「毒性関連ビッグデータを用いた人工知能による次世代型安全性予測手法の開発（AI-SHIPS）」の取り組みの一端を紹介する。本プロジェクトでは、インビボ反復投与毒性試験結果をHESSより入手可能な化学物質を被験物質として、毒性発現機序と関連する多数のインビトロ試験を実施し、その結果を基にインビボ毒性を予測することを目指している。より具体的には、化学物質の作用点として、解毒や代謝活性化に関わる薬物代謝酵素のシトクロムP450やグルクロン酸転移酵素、肝毒性や肝機能ホメオスタシスに関わる核内受容体、ならびに胆汁排泄関連トランスポーターとの反応性評価、また、細胞レベルでの化学物質応答性の指標として、初代培養ラット肝細胞のハイコンテントイメージング解析などを実施してデータの蓄積を進めている。本発表では、開発戦略と開発状況、今後の展望を紹介したい。

　ラット28日間反復経口投与毒性試験では、被験物質の血中濃度推移（曝露）に関する評価はほとんど行われていない。化学物質の毒性予測基盤整備のため、経口投与時の生体に入る過程である消化管吸収性と生体レベルでの肝中濃度の時間推移を予測した。検討対象化合物は、ラット経口投与試験による肝毒性情報を含む有害性評価支援システム統合プラットフォーム （HESS）」収載化学物質（以下HESS化合物」を一次対象とし、一般化学物質のランダム5万分子の記述子計算結果を2次元可視化し、等間隔な空間エリアを25個設定したケミカルスペースでの多様性を考慮した医薬、農薬等を含む化合物53種とした。本発表では、肝への化合物の移行と代謝消失速度を加味した簡易生理学的薬物動態（PBPK）モデルを使い、化学物質の生体内濃度の時間推移を予測し、肝毒性との関係を推定する経産省次世代型安全性予測手法AI-SHIPSプロジェクトの一端を紹介する。

　ヒト結腸がん由来細胞株Caco-2 細胞を用い、化合物の in vitro 透過係数を調べたところ、17種HESS化合物の肝無作用量（NOEL）値と対数変換した透過係数実測値の間に有意な逆相関が認められた。推定物性値を用いる重回帰分析で得られた回帰式より算出した透過係数の予測値は、実測値と良好に相関した。構造情報を活用することで透過係数、さらに化学物質の経口吸収性をも予測しうることが示された。血中化学物質濃度推移の文献・実測値を活用し、ラット各種体内動態パラメータ値を算出し、コンパートメントおよび消化管、肝臓および全身循環からなるPBPKモデルを活用して、仮想投与後の血中または肝臓中濃度推移を予測した。両方法で予測した化合物の血中濃度および時間曲線下面積は一致したが、血中と肝中濃度の相関係数は低下した。1日あたりの肝中濃度時間曲線下面積と7種HESS化合物の肝最小作用量（LOEL）値は有意な逆相関を示した。各化合物の薬物動態３種パラメータ値［吸収速度定数、分布容積および肝代謝消失］を化合物の構造特性値から推定する手法の整備を契機に、薬物動態モデルを用いる化学物質の体内濃度推移と安全性評価技術の統合に期待したい。

環境中に存在する化学物質や放射線、さらには生体内での通常の代謝活動によって活性酸素種が生じており、これらは様々な作用を生体にもたらす。中でもDNAの酸化は突然変異を引き起こすことが示され、発がんさらには生体の老化に深く関わっていることが示唆されてきた。種々の酸化DNA損傷でグアニン塩基の酸化型である8-オキソグアニン（8-oxoG）は、その強力な変異原性で注目されている。本発表では、8-oxoGと対合したアデニンを除去する塩基除去修復系のMUTYHの遺伝子を欠損するマウス個体での解析を中心に、酸化DNA損傷に起因する発がん抑制機構に関する研究を紹介する。

Mutyh遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べて、自然発がん、とりわけ消化管での発がん頻度が高い。 Mutyh遺伝子欠損マウスでは食品添加物としても使用された臭素酸カリウム（KBrO₃）の飲水投与で小腸での腫瘍発生が用量依存的に上昇したが、腫瘍の発生を認めない低用量（0.05% KBrO₃）域が存在し、遺伝毒性発がん物質にも実質的な閾値があることが示唆された。 Mutyh遺伝子欠損マウスに生じた腫瘍組織の解析で、 Apc遺伝子あるいは Ctnnb1遺伝子での特徴的なG:C→T:Aトランスバージョン型の突然変異が高頻度に検出され、ヒトの家族性大腸腺腫症の内、 MUTYH遺伝子に変異を有するMAP（MUTYH associated polyposis）患者では、Wntシグナル経路の破綻が発がんに繋がっていることが示唆された。さらに、8-oxoGに代表される酸化DNA損傷に起因する突然変異の抑制に関与する種々の遺伝子の改変マウスの解析から、酸化DNA損傷の修復並びに酸化DNA損傷に起因する細胞死の両方に関わるMUTYH並びにミスマッチ修復系（MSH2）が、酸化ストレスによって誘発されるがんの抑制に重要な働きをしていることが示された。

遺伝毒性に係わるリスク評価に一般的に使われるのは，複数の遺伝毒性試験法の組み合わせによる証拠の重み付け（weight of evidence: WoE）のアプローチである．WoEは医薬開発品等の発がん性を開発初期段階で予測するスクリーニングとして主に用いられ，また，化学発がんが生じたときに遺伝毒性の関与があるかを吟味するためにも使われる．WoEは規制科学として十分な役割を果たしているが，遺伝毒性の作用機序（mechanism of action: MoA）を明らかにすれば更に精緻なリスク評価が可能と考える．例えば，1）in vitro小核試験の陽性結果フォローにWoEでは2種の組織を用いるin vivo遺伝毒性試験が行われるが，in vitro小核試験にDNAアダクトーム解析を組み込めば陽性結果のMoAに化学物質によるDNAの直接損傷作用が含まれるかをin vitroだけで評価でき，遺伝毒性作用に閾値が想定できるかの議論を可能にする；2）予備的な解析結果から，in vivoでの化学物質の曝露量がin vitroでの曝露量と同等以上であることが化学物質により誘発されるin vivo染色体損傷を検出するために重要な因子であるかもしれないことが示唆された；3）化学物質のもつ化学的・生物学的な特性を考慮したケースバイケースの解析はリスク評価に有用であり，例えばpoly(ADP-ribose)polymerase-1阻害薬がin vivo小核を誘発する原因はその薬理学的特性（DNA修復阻害）によるもので，このMoAから小核誘発に対して閾値を有することが期待される．本講演ではこれら事例を紹介し，遺伝毒性作用機序を踏まえたリスク評価の重要性を議論したい．

現在の先進国における生活で、まとまった量の遺伝毒性物質に暴露する機会があるとすれば、最も可能性が高いのはがん治療かもしれない。今日、日本、米国、欧州ではいずれも、40-55％の人がその生涯のどこかでがんと診断されている。従来、抗がん剤であればその遺伝毒性はリスクベネフィットの観点から許容されると認識されてきたため、抗がん剤の遺伝毒性の強弱や活性は重視されなかった。しかしながら、近年のがん治療成績の大幅な向上により、がん患者の生存期間が長期化するにしたがって、抗がん剤による二次発がんが問題になっており、遺伝毒性の強弱や機序について理解しておくことは、QOLの予測や薬剤選択の面でも重要な要素になりつつある。γ-H2AXは、DNA傷害のサロゲートマーカーとして様々な細胞で簡便に測定できるバイオマーカーである。γ-H2AXはガンマ線によるDNA二重鎖切断に伴うヒストンタンパク質H2AXのリン酸化現象として発見されたことから、一般にDNA二重鎖切断のマーカーとして認識されている。一方で、トポイソメラーゼ阻害剤や紫外線など、二重鎖切断以外のDNA傷害を誘導する遺伝毒性物質もγ-H2AXを増加させる。さらに、アポトーシスに伴ってγ-H2AXが誘導されるし、細胞分裂の過程で生理的に増加するとの報告もある。ここでは、γ-H2AXの性質と、これを遺伝毒性機序研究に応用する背景、測定方法、これをin vitro及びin vivoにどう使って実際に何ができているのかについて、最新の知見に基づいて論じる。

　動物にがんを発生させるには化学物質を繰り返し投与しても長期間を要する。皮膚や肝においてイニシエーションとプロモーションによる作用によって腫瘍を比較的短期間で発生させる２段階発がんモデルが知られている。いずれの臓器においてもイニシエーションのためにはそれぞれの臓器にがんを引き起こす発がん物質を投与し，プロモーションのためにはそれぞれの臓器で細胞の増殖を促進させる非変異原性物質の投与や処置（例，肝部分切除）を行う。

　大腸においても，イニシエーターとして大腸変異原性発がん物質アゾキシメタン(AOM)とプロモーターとして炎症誘発剤デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の組合わせによる２段階発がんモデルが開発されている。私たちは，この２段階発がんモデルにおいてAOMの替わりに大腸に変異原性はあるが発がん性はないベンゾ[a]ピレン(BP)を投与しても腫瘍が短期間で誘発されることを見出した(BP/DSSモデル)。更にBP以外の大腸変異原性非発がん物質をいくつか調べたところ，全化合物で腫瘍が短期間で誘発されたことを見出した。このことは，大腸に発がん性はなくても変異原性を示す物質であれば，炎症を呈する大腸に腫瘍が発生することを意味する。

　BP/DSSモデルは，マウスに5日間BPを投与し，9日間回復させた後，1週間のDSS投与により，極めて短期間(DSS最終投与後約1週間)で大腸腫瘍を誘発する。BPとDSSの投与間隔を9日から6か月に延ばしても，大腸にBPによる遺伝子変異は存在し，腫瘍が発生した。DSSを投与してからBPを投与した場合，腫瘍の発生はなかった。これらの結果はイニシエーションにおける遺伝子変異に加え，プロモーションにおける微小環境，特に炎症の重要性を示す。本モデルは大腸化学発がん機序を新しい切り口から解明する研究ツールとして有用であり，抗腫瘍性物質の探索にも利用できる可能性がある。

環境中には多種多様な化学物質が排出されているが、その一部には発がん性や神経影響などの人への有害性が知られている。発がん性に関しては、WHO/IARCにより人での発がん性（グループ1）、あるいは、発がん性の懸念（グループ2A、2B）があると分類される化学物質が環境中に存在する。しかし、WHO/IARCの分類とは人で発がんリスクを増大させる可能性の「証拠の重さ」の評価である。化学物質の曝露による健康影響を未然に防ぐためには、有害性の定量的評価に基づく基準値の設定が行われている。大気中の化学物質については、わが国では健康影響が懸念される23物質が優先取組物質に選定され、うち5物質に環境基準、9物質に指針値が、主に疫学の知見に基づいて設定されている。グループ1、2A、2Bの物質のうち、ベンゼンには、発がん性の用量作用関係に「閾値なし」として、疫学の知見から環境基準が、塩化ビニルなど4物質にも同様の手法で指針値が設定されている。しかし、トリクロロエチレン（TriCE）、テトラクロロエチレン、ジクロロメタン、ダイオキシン類、アクリロニトリル（AN）については、神経影響などの発がん性以外の有害性から環境基準・指針値が設定されている。TriCEやANに関しては、幾つかの遺伝毒性の知見があるものの、その遺伝毒性が発がん性に関与する明確な証拠がない、あるいは、人で発がんの用量反応関係を示す知見が得られていないとして、発がん性をエンドポイントに採用しなかったと考えられる。一方、同じ環境からの化学物質曝露のリスク評価であっても、化学物質審査規制法のリスク評価では、TriCEやANなどには遺伝毒性の知見があることを評価し、動物への曝露実験での発がんの用量作用関係から実質安全量（VSD）を算出し有害性評価値としている。両者の評価値の違いは、リスク評価の手法の違いではあるが、リスク評価の考え方に起因する違いともいえる。この違いについて考察する。

　海産毒は、食品衛生上、化学構造上の特性、さらに毒性学的作用機構などの観点から重要な毒性物質である。この国における海産毒食中毒事故や事件は、必ずしも食中毒全体からみると多くはないが、毒作用が強力である点から注意が必要とされる。海産毒の起源は、一般に有毒プランクトン（渦鞭毛藻類）などを魚介類が摂取し、蓄積していることが由来となり、その毒化した魚介類をヒトが摂取することで中毒が発生する。海産毒成分は、一般に熱に安定で、水溶性や脂溶性で、加熱でも影響を受けないことが多い。さらにこれらの毒性物質で汚染された魚介類は、見た目、臭いや味覚は正常である。これらの毒性物質は、一般にイオンチャネルに作用することが多い。すなわちイオンチャネルを開放、閉鎖、膜の脱分極の延長、知覚異常などを引き起こす。一方、特定の酵素や受容体に作用する海産毒もある。これらは、微量で作用し、基本的に中毒に対する解毒薬はなく、維持療法が主となる。海産毒の中には、その毒性発現機構を活用して、古くから海人草（マクリ、主成分はカイニン酸）のように駆虫薬として広く用いられていたり、最近ではコノトキシンのようにモルヒネをはるかに凌ぐ鎮痛薬としての開発も進んでいる。海産毒としての貝毒は、その毒性症状から、麻痺性、下痢性、神経性、記憶喪失性貝毒などと分類されている。主な海産毒には、テトロドトキシン（Na⁺,K⁺-ATPaseの阻害）、シガトキシン（電位依存性Na^＋チャネルの解放）、パリトキシン（Na⁺,K⁺-ATPaseの阻害）、サキシトキシン（Na^＋チャネルの遮断）、オカダ酸（セリン／スレオニンホスファターゼ１及び２Aの阻害）、ドウモイ酸：カイニン酸（イオノトロピックグルタミン酸受容体の興奮、特に記憶・学習の場である海馬）、ω-コノトキシ（脊髄N型カルシウムチャネル閉鎖、モルヒネを凌ぐ鎮痛作用）などがあり、各毒作用発現機序等を簡潔に紹介する。

　テトロドトキシン（TTX）はフグ毒として有名であるが、EUでは2016年にオランダ産の二枚貝（カキ）からTTXが検出され、欧州食品安全機関（EFSA）が海洋二枚貝に含まれるTTXのリスク評価の結果を2017年4月に発表した。その中でEFSAは、TTXとその類縁体のグループ急性参照用量（group ARfD: 0.25 µg/kg体重）を導出した。ARfDとは、ヒトがある物質を24時間以内に経口摂取した場合に、健康に悪影響を示さないと推定される一日当たりの摂取量である。

　TTXのリスク評価はEFSAが最初であり、いくつか注目すべき点がある。一つは、ARfDの導出において、多数あるヒトのフグ中毒データについては多くの不確実性があり根拠として不十分であるとして参考情報に留め、TTX標準物質を雌性マウスに単回“経口”投与した際の急性毒性試験のデータを根拠（無気力(apathy)という一般状態変化を指標）として使用した点である。このEFSAの判断は、日本のマリンバイオトキシンの研究分野に大きな衝撃となった。さらに、TTXの毒性の強さは従来、致死時間を考慮した上での急性毒性死をエンドポイントとする「マウスユニット（MU）」という単位で示すのが慣例であるが、EFSAはMUではなくARfD 由来の「µg/kg体重」を使用した点である。1 MUは、生後4週、体重20gの雄性マウスに、フグ粗毒原液（肝、卵巣、筋肉由来）由来の調製液を“腹腔内”投与して30分間で死亡させる毒量と定義され、TTX 0.22 µgに相当するといわれている。我が国のリスク管理では10 MU/gを超えるものは食用不適と判断されている。

　MUとARfDとでは、由来する実験動物の急性データのエンドポイントや投与経路等が異なる。TTXの毒性を見直すにあたり、従来のMUを用いる方法と新たなARfDを用いる方法との比較検討が必須と考える。

　フグ毒テトロドトキシン(TTX)は、電位依存性Na⁺チャネル(Na_v)を特異的に強力に阻害する。海洋生物ではカニ、タコ、巻貝などからも検出される。分析手法の高感度化に伴い、最近、ヨーロッパやニュージーランドで、二枚貝からも検出され、EFSA（欧州食品安全機関）により食中毒防止のための規制値が設けられた。一方、陸棲のイモリやカエルからもTTXが検出される。我々は、フグやイモリ、カエルから多くのTTX類縁体を単離、構造決定し、化学誘導体も作製した。その多くは、マウス腹腔内投与毒性試験、ラット脳シナプトソーム画分への結合試験、マウス神経芽細胞腫Neuro-2Aを用いた評価方法、および電気生理実験（共同研究）などの方法でNa_v阻害活性を評価した。測定方法が異なり直接比較できない類縁体もあるが、TTXの構造活性相関に関するデータを得た。それは最近報告されたCryo-EMによるTTXとNa_vの結合像を支持していた。

　TTXは細菌が生産し、食物連鎖を介してTTX含有生物に蓄積すると考えられるが、生合成機構や生合成遺伝子は未だ解明されていない。我々はTTXの天然類縁体および関連化合物の構造に基づき、生合成経路を推定してきた。イモリから単離したTTX関連グアニジノ化合物群の構造から、陸上環境下のTTXがモノテルペンから生合成される経路を提唱した。しかし、両生類由来のTTX類縁体の多くは、海洋生物では検出されない。フグからは別のスピロ二環性グアニジノ化合物群を単離、構造し、他の海洋生物にも存在することを明らかにした。これらの化合物群は、その構造からTTXの前駆体と考えられ、多段階の酸化反応やアミドの加水分解、ヘミアミナールやラクトン形成反応を経て、フグなど海洋生物中の主要な類縁体5,6,11-trideoxyTTXに変換され、さらに段階的な酸化反応によってTTXを生成する生合成経路を推定した。

　記憶喪失性貝毒であるドーモイ酸はグルタミン酸のアゴニストでありグルタミン酸受容体と強く結合する。グルタミン酸は中枢神経系における主たる興奮性神経伝達物質であるが、その受容体への適切な刺激は発生期の脳形成においても重要な役割を演じているとされる。本シンポジウムではドーモイ酸を用いての、発生期マウスの脳におけるグルタミン酸受容体の過剰刺激による神経シグナル異常が脳微細構造形成へ及ぼす影響と、それが引き起こす遅発性中枢行動毒性について紹介する。生後10週齢の成熟雄マウスにドーモイ酸（1mg/kg）を腹腔投与した群（成熟期投与群）と、妊娠11.5、14.5、17.5日齢の雌マウスにドーモイ酸（1mg/kg）を腹腔投与することによって経胎盤的にドーモイ酸をばく露し、得られた雄マウス群（発生期投与群）について、生後11～12週齢時にオープンフィールド試験、明暗往来試験、高架式十字迷路試験、条件付け学習記憶試験、及び、プレパルス驚愕反応抑制試験からなるバッテリー式の行動解析を行うとともに、行動解析を行ったマウスの終脳の神経細胞突起に焦点を合わせた形態機能解析を行った。その結果、成熟期投与群では、海馬依存性が高いとされる場所連想記憶の異常のみが認められた。これは、ヒトにおいて海馬を選択的に破壊し記憶障害を示すという貝毒事例の報告に合致していると考えられた。これに対し、発生期投与群では、①不安関連行動異常、②場所連想記憶異常のみならず音連想記憶の異常、③プレパルス驚愕反応抑制試験における抑制度の低下、確認されるとともに、④大脳皮質における神経細胞突起発達の不全、⑤軸索構成タンパクの生化学性状への影響が認められた。以上より、本系は発生期におけるグルタミン酸受容体過剰刺激を起点とする脳形成不全をともなう脳機能発達障害モデルとして位置づけることが出来ると考えられた。

臨床現場では中毒症例は意識的に状況を把握しければ難しいケースが多い。中毒の判断ではその病歴が重要であり、かつ症状から推察するトキシドロームを抑えていないと中毒起因物質の特定に時間を要し、治療介入を遅らせることとなる。マリントキシンとしてよく知られているのは、テトロドトキシン(TTX)でありフグ毒はそのトキシドロームから念頭におかれるものの一つである。TTXの症状は口唇部・指先の痺れといった軽症から、骨格筋の弛緩により運動麻痺となり呼吸停止から死に至る重症まである。厚生労働省の報告によると2003年から2017年のフグによる食中毒発生状況は407 件、平均31件/年の事件が発生し、75％が家庭内発生となっている。今回家庭内調理により発生したフグ中毒の１例を紹介する。原因食品別事件数では、魚介類・魚介類加工品での食中毒は全体の20％を占めている。重篤な症状は呈さないが、海洋生物での中毒としてアナフィラキシー様症状で来院する患者に見られるものにヒスタミン中毒があり、赤身魚のヒスチジンをMorganella morganiiなどのヒスタミン産生菌がヒスタミンに変換し発症する。報告例だけで2015年は405人、2016年は283人の患者数があり厚生労働省、農林水産省などが注意喚起を行っている。その他消化器症状を示すものには、アニサキス症、ノロウイルス、腸炎ビブリオなどの食中毒も散見され、症状評価や病歴聴取などを行いながら時節を考慮し診療を行う。臨床現場で直面する中毒症例以外にも、メチル水銀に対して主に胎児への健康が懸念されているため、妊婦への魚介類の摂食に関する注意事項が公表された。詳細なパンフレットが産婦人科外来に提示されているところもある。この様に海洋生物による食中毒は様々であり、各方面からの対策が取られており、マリントキシンのみでなく関連生物も念頭に置きながら診療を行なっている。

　ヒトiPS細胞技術は、再生医療の実現のみならず医薬品の開発ストラテジーにも大きな改革をもたらしており、国内外で精力的に取り組みがなされている。医薬品の安全性評価に関しては、内閣府「健康・医療戦略」にiPS細胞技術による医薬品の心毒性評価が盛り込まれ、2020年ごろの達成目標とされている。我々はこれまで産官学で催不整脈作用に関する標準的な薬理プロトコルを整備して、バリデーション研究を行うことにより標準化を推進し、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を利用した評価法を開発してきた。またFDAを中心に組織された国際コンソーシアムCiPAにおいても国際検証試験が実施されて、日本からもデータを提供し、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を利用した評価法の再現性や有用性が明らかになった。このような取り組みを背景に、ICHにおいてiPS心筋細胞の試験法等を用いた新しいアプローチの利用可能性を検討することとなり、議論が開始された。

　現在、さらなるiPS細胞技術の利用法を目指して「Beyond CiPA」の動きが盛んである。中でも、Cardio Oncology分野の重要性が認識されたことを契機に、抗がん剤などの心毒性評価法がクローズアップされており、我々もイメージング技術を基にしてインビトロで心収縮障害を予測する方法の開発を進めている。

　そこで本シンポジウムでは、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いた新たな心毒性評価法を紹介し、今後の国際動向についてもあわせて議論したい。

　国立がん研究センターがん対策情報センターによると、日本人の2人に1人が生涯でがんに罹患するといわれている。しかしながら、不治の病と恐れられていたがんは、今や新薬の開発および多種多様な治療が選択でき、治療可能な疾患となっており、がんサバイバーは年々増加している。その一方で治療中、治療後に、副作用など様々な問題を抱えるがんサバイバーも増加しており、今まで顕在化していなかった抗がん剤による晩期性障害や、がん自身によって起こる心機能障害が問題となっている。抗がん剤や分子標的薬の中にも副作用として心毒性を生じるものがあり、このような副作用は抗がん剤治療の継続を制限するのみならず、患者のQOLを著しく低下させる。また、進行がん患者の約80％に出現し、がん死因の約20％を占めるとされるがん悪液質においても心機能障害を発症することが報告されている。当研究分野では、ヒト胃がん細胞株85As2をマウスに移植することで、摂食量低下、体重減少、筋肉量減少を伴う除脂肪量低下など、ヒトに類似した症状を呈するがん悪液質モデルマウスを確立した。これまでの研究において、同モデルはがん悪液質の進行とともに顕著な心重量の低下、ならびに心機能の低下が起こることを見出している。この85As2誘発がん悪液質モデルは、ヒトがん悪液質患者に類似した心機能低下の徴候を有していることから、がん悪液質における心機能低下のメカニズムの解析に適切なモデルであると考えている。本シンポジウムでは、同がん悪液質モデルマウスにおける心機能障害の病態生理の実験結果を報告する。さらに運動療法が慢性心不全の治療法として知られていることから、がん悪液質が誘発する心機能障害に対する治療への運動療法の応用可能性を検討することを目的とした、がん悪液質モデルマウスに対する運動負荷の効果についても合わせて報告する。

　多くの疾患の発症・病態・治療に性差があることが明らかとなってきており、生物医学研究では、早急な対応が求められている。性差の分子機構といえば、多くの場合、性ホルモン、特にエストロゲンやアンドロゲンによって説明されるものの、その分子機構には未だ多くの不明な点を残す。また、最近になって、細胞レベルであっても性染色体の違いによって､増殖効率や刺激応答性に違いがあるという報告がなされ、そのメカニズム解明にも注目が集まっている。このように、性差医学研究は、臨床から基礎研究に新たな拡がりをみせている。

　創薬研究分野では、2001年の米国連邦監査調査において、市場から撤退した薬剤の8割で、男性に比べ女性に対する有害事象発生率が有意に高いことが示された。この報告を契機に、薬物反応の個人差を決定づける因子として「性差」がクローズアップされ、現在ではすべての治験で性差が考慮される。2015年6月には、ヒトおよびほ乳類を用いた全ての研究計画において、性による結果の違いの可能性を議論することをNIHグラント申請の要件とする声明 (NOT-OD-15-103) が発出された。つまり、基礎医学研究においても性差を考慮すべきという強いメッセージである。2016年施行の際には、米国の各大学グラントオフィスは対応に追われたと聞く。

　我々は、不整脈疾患の発症率における男女差に着目した研究を行ってきた。薬剤の副作用として発症する致死性不整脈では、女性での発症率が高いことが特徴である。我々は、この発症性差には、NOを介した心筋細胞の性ホルモンシグナルが関与していることを示した。これらの結果を如何にして生体反応における解釈に反映させるか、我々が行っている独自の取り組みを紹介したい。

生涯を通して受ける様々な環境因子の複合的曝露（エクスポソーム）が疾患発症リスクを評価する新たな指標として注目を集めている。多くの環境化学物質は親電子性が高く、これらは共通して生体分子中の求核物質（タンパク質中のシステイン（Cys）パースルフィドをはじめとする活性イオウ種）と化学的に共有結合し、生体分子に機能修飾を与える。こうしたタンパク質機能修飾の蓄積が生体恒常性の変容を誘発し、個体機能低下を招くことが示唆されている。我々は、ミトコンドリアの品質管理を制御するGタンパク質dynamin-related protein 1 (Drp1)が高いレドックス活性を持つことに着目し、Drp1のレドックス活性がC末端に存在するシステイン（Cys624）残基によって制御されることを見出した。Cys624はミトコンドリアtRNA合成酵素（CARS2）活性依存的にポリイオウ化されることで、Drp1活性を負に調節すること、神経毒性を起こさない極低用量のメチル水銀曝露によりDrp1ポリイオウ鎖がイオウ枯渇することでDrp1依存的なミトコンドリア分裂が起こることをマウス心臓レベルで明らかにした。ミトコンドリア過剰分裂したマウス心臓に圧負荷を加えたところ、心臓の圧負荷に対する抵抗性が顕著に減弱し、突然死率と心不全重症度の顕著な増加が観察された。Drp1のCys624のポリイオウ鎖枯渇を模倣した変異体（Drp1(C624S)）を心筋細胞株に発現させたところ、ミトコンドリア分裂の亢進が認められ、逆にCys624のポリイオウ鎖構造を模倣した変異体（Drp1(C624W)）を発現させた細胞ではMeHg曝露によるミトコンドリア分裂が抑制された。以上の結果は、Drp1タンパク質のポリイオウ鎖が環境化学物質センサーとして機能し、ミトコンドリア品質低下を伴う心疾患発症を制御していることを強く示唆している。

医薬品開発において，安全性面で優れた化合物を見出すためのスクリーニング手法としてin vitroの評価系が用いられてきた．近年，初期スクリーニングのみならず，種差を含む毒性メカニズム解析等，創薬の幅広いステージで利用可能なin vitro評価系の構築が求められている．我々は開発中止の原因になりやすい肝毒性および心毒性を中心に，安全性に優れた化合物を選択するために種々のin vitro毒性評価系の有用性を検討している．そのうち，ヒト肝細胞を用いた胆汁酸トランスポート阻害リスクを評価するin vitroアッセイ系は，既知化合物を用いた評価試験において胆汁うっ滞性肝障害に対して良好な予測性を示した．本演題では，ラット 2 週間反復投与毒性試験において総ビリルビン（T-Bil）と直接ビリルビン（D-Bil）の上昇を伴う肝障害が認められたが，サル2 週間反復投与毒性試験においては肝障害が認められなかった社内化合物Xの事例を取り上げ，化合物Xのラット，サルあるいはヒト肝細胞を用いた胆汁酸トランスポート阻害試験の結果や検討中の課題について紹介する．

　医薬品の探索ステージでの安全性試験において，十分な安全域が確保できない用量から毒性変化が認められた場合，開発候補化合物の進退判断を的確に行うためには，その毒性の発現機序を明らかにし，ヒトと当該試験動物種との差異や臨床におけるリスク管理の要否を論理立てて説明する必要がある．

　このプロセスは，（1）毒性発現機序を明らかにすること，（2）ヒトや他動物種との種差を考察し検証することの2点を達成する必要があるため，種特異的な代謝物生成や薬物の高曝露等，薬物動態的な種差要因で説明が可能な場合，また，すでに種差が公知となっている一部の機序に該当する場合などを除き，ヒトへの外挿性を的確に判断することは一般的に難しい．当社では（1）については，病理組織学的検査や血液学・血液生化学的検査等の標準的な試験項目に加え，オミクス解析に代表される分子毒性学的な手法で原因となる生物学的機能・パスウェイを明確化する取り組みを行っている．また，（2）についてはin vitro細胞評価系やin silicoモデリング＆シミュレーション等の先端的な手法を用いた比較を検討しているが，いずれも課題が多いのが実情である．

　本演題では，毒性機序解析に基づく種差検討の考え方について整理するとともに，当社における代表的な解析事例について紹介したい．

　中枢毒性は様々な所見の総称であり、非げっ歯類で認められる嘔吐などの比較的軽微なものから、脳病理組織学的変化や痙攣から死亡に至る中枢毒性までその重篤性は様々である。中でも中枢移行性の高い医薬品開発では、中枢毒性は少なからず発現し、多くの場合その中枢毒性の所見の種類や重篤性、回復性をもとにスクリーニング評価の対象毒性として評価が進められている。特に脳病理組織学的変化は、動物種差やヒトへの外挿性に関する情報が乏しいがゆえに、広い安全域が得られない限り、化合物をドロップアウトさせるケースが多い。

　しかしながら、中枢毒性は動物種間で異なる反応が見られることがあり、当該動物種特有の作用機序の存在が示唆される。毒性の種特有の作用機序を解明することは簡単ではないが、我々はそれに挑戦し続け、化合物の真の価値を判断する役割があると考える。

　今回、当社の初期安全性評価段階で認められた脳病理組織学的変化について種差とその作用機序に関する取り組み事例を紹介する。中枢毒性の初期評価における適切な動物種選択、種差検討の取り組みの必要性について問題提議したい。

抗体医薬品は、その標的分子への高い特異性を有する特徴からオフターゲットの毒性が少なく、臨床での副作用を予測しやすいと考えられるが、実際は多くの抗体医薬品の臨床試験において副作用が問題となっており、非臨床試験成績からのヒトへの外挿性は決して高いとは言えない。その理由としては、抗体の非臨床安全性試験に汎用されているカニクイザルとヒトには種差が存在し、臨床での副作用リスクを十分に把握できていないことが挙げられる。標的分子の発現部位、発現量、薬理/生理活性は必ずしもヒトとサルで同質・同等ではなく、抗体の標的分子に対する活性や結合性の強度にも種差がある。また、健常時には薬理作用を示さない抗体も多く存在する。このように従来の評価法を用いた安全性評価には限界があり、ヒト由来試料を用いた評価やTarget biologyの深掘りに基づく新たな評価系の利用が予測性の向上につながると考えられる。

本発表では、カニクイザルの反復投与毒性試験では毒性兆候がなかったにもかかわらず臨床試験において重篤な副作用（中枢神経毒性、肝毒性）が問題となった2種の抗体医薬品の事例を紹介する。従来の毒性評価法の課題や臨床副作用の予測性向上に向けた取り組みについて議論したい。

近年，医薬品業界で扱うモダリティは多様化している。モダリティという言葉が持つ意味は様々あるが，医薬品業界におけるモダリティとは，一般的には低分子医薬品や抗体医薬品，ペプチド医薬品，遺伝子治療医薬品といった疾患の治療手段のことを指す。2000年頃までの医薬品モダリティの主体は低分子医薬品であったが，2000年以降，タンパク質工学の進展を背景に抗体医薬品の開発が比率を増し，既に日米欧で70を超える抗体医薬品が承認されている。さらに近年では，核酸修飾技術の進展を背景とした核酸医薬品やCRISPR/Cas9を代表とするゲノム編集技術を応用した遺伝子治療医薬品など，新たなモダリティを用いた医薬品の開発もグローバルに進められている。一方，新モダリティ医薬品は，選択したモダリティ毎に特性と懸念される安全性リスクの内容は異なり，非臨床安全性評価における最適な試験パッケージや試験デザインを一般化することは難しい。本発表では，当局から発出されているガイドラインなどの情報を参照しながら，新モダリティ医薬品の非臨床安全性評価における動物種選択や毒性種差についての考え方の一例を紹介する。

新素材として多様な応用が期待されるセルロースナノファイバー（ＣＮＦ）の社会実装化を加速させるためには、ＣＮＦの安全性の評価が求められるが、その有害性試験手法が未確立である。ナノマテリアルの吸入影響に関する有害性評価として、げっ歯類を使った吸入暴露試験があるが、多大な費用と時間が必要となるため多くの被験材料について実施することは困難である。そのため、簡易な器具と少量の被験材料で実施可能であり、肺への投与量を厳密に設定できる気管内投与試験は、多様なＣＮＦの吸入毒性試験として有効な手法と考える。しかしながら、ＣＮＦを被験材料とした気管内投与試験の報告はこれまでなく、また、ＣＮＦはゲルとゾルの中間的な性質を持ち、粘度が時間経過やせん断応力とともに変化する（thixotropy）ことから、適切な気管内投与手法の確立が必要と考える。本発表では、現在以下の目的に従い実施中のＣＮＦの気管内投与手法の開発について紹介する。

（１）スラリー状のＣＮＦの物理化学的特性を損なわない状態で分散調製する技術を確立する。

（２）気管内投与後、ＣＮＦの粘性等により、げっ歯類に窒息や行動異常などが引き起こされ、気管内投与後の適切な有害性評価ができない場合が予想される。このため、ＣＮＦ試料を投与後、数日間のラットの状態を観察し、気管内投与が可能なＣＮＦ試料の濃度や投与条件を確立する。

（３）気管内投与後の肺各葉でのＣＮＦの抽出と分析を実施し、気管内投与後の肺に被験材料が一部に偏在せず、一様に分布することを検証する。

本発表は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ）の委託業務「非可食性植物由来化学品製造プロセス技術開発／ＣＮＦ安全性評価手法」の結果から得られたものである。

　酸化チタンは白色顔料として工業的に生産されて約100年、塗料やインキ、プラスチック、紙、繊維、化粧品など幅広い用途で使用されている。1980年代よりナノサイズの粒子（一次粒子径が100 nm以下）の開発が進み、ナノ酸化チタン（TiO₂NP）の平成29年度国内製造量は6,059トン（日本酸化チタン工業会集計）に達する。TiO₂NPは従来の顔料グレードの酸化チタン（粒径200～300 nm）にくらべ、比表面積が増大し光触媒活性が強いことや、光吸収や散乱特性が変化することなどによる新たな特性が付与されている。毒性学的には、この新たな特性が、顔料グレードとは異なる影響を生体に及ぼす懸念が指摘されている。特に、職業曝露の面からは、TiO₂NPを製造する現場における吸入曝露が最も重要であると考えられた。

　WHOの国際がん研究機関は2010年に、酸化チタンの肺に対する発癌性を評価し、「ヒトに対して発がん性の可能性がある」とする2Bに分類している（IARC, 2010）。この際に評価された毒性データは、高濃度（250 mg/m³）の顔料グレード、及び、TiO₂NPの１群のみの長期吸入曝露試験（10 mg/m³）での肺発癌を根拠としている。厚生労働省としては、TiO₂NPの職業健康障害の予防の観点から複数用量を設定したフルスケールの発癌性試験を実施する事とし、日本バイオアッセイ研究センターにおいて、アナターゼ型TiO₂NP（30 nm）のラット全身吸入曝露長期発がん性試験（F344ラット、雌雄50匹／群、8 mg/m³、2 mg/m³、0.5 mg/m³）を実施中である。

　本シンポジウムでは、それに先立ち実施した用量設定試験（最高50 mg/m³、公比2計4群）における、Ⅱ型肺胞上皮の増殖性変化等の病理組織学的変化を報告し、既に当所で経験した粒子状物質（MWCNT、インジウム等）の吸入所見との対比を含め、その成立過程と発癌性との関係を考察する。（厚労省運営交付金事業による）

　現在でも胸膜悪性中皮腫の発生率は上昇しており、特にアスベストの生産・輸入に関する規制の緩い国ではその傾向が顕著である。我々はこれまでに、アスベストに類似したK₂0・6TiO fiber (TISMO）の毒性についての評価を行ってきた。TISMOの胸膜への影響を検索するため、できるだけ多くの被験物質を胸膜に暴露させることを目的に、開胸下に直接被験物質を胸腔内に投与する方法を用いた。

　A/Jマウスの左胸腔内に同成分でサイズや形状の異なる３つの微粒子（TiO₂ micro size particle、TiO₂ nano size particle、TISMO）を投与する実験を行った。実験開始21週目に針状のTISMO投与群のみ肺胸膜の肥厚が見られ、球状のTiO₂微粒子投与群は大きさに関係なく胸膜の変化は認められなかった。TISMOはアスベストに似た形状を有する針状粒子であり、胸膜悪性中皮腫の発生原因も危惧される。そこでTISMOの左胸腔内投与後、長期間（2年以上）飼育する実験を行った。その結果、肺胸膜の著明な肥厚を再確認し、さらに異型を伴う中皮細胞の出現が観察された。驚くべきことに、TISMO粒子は胸腔内投与にも関わらず、多臓器（肝、腎、脾臓、卵巣、心、骨髄、脳実質）で確認され、広範な播種が認められた。

　また、TISMOの経気道暴露を想定して、気管内投与による実験も行った。TISMOが誘発する肺実質内の炎症所見は軽度であり、人への吸入毒性が低いとされる炭酸カルシウム微粒子（チョークの粉）とほぼ同程度であった。このように、経気道的に侵入したTISMOは、気管支および肺実質内での炎症誘発作用は乏しいものの、胸膜に到達すると強い反応性変化を誘発することが判明した。

　以上より、TISMOの胸膜への影響、および呼吸器系から体内に侵入したTISMOが多臓器に分布するリスクが明らかとなった。

　架橋型アクリル酸系水溶性高分子化合物（以下、ポリマー）の包装作業に従事した労働者6名が肺繊維化、間質性肺炎、肺気腫、気胸等を発症した事から、2017年4月に、同種事案の防止のため、厚生労働省労働基準局安全衛生部からプレスリリース（1,2）があった。6名は曝露開始から２年前後の短期間に発症し、年齢は20代～40代であった。このポリマーは、アクリル酸を直鎖重合し、更に網目状に架橋した巨大分子で、一次粒子はナノ粒子の定義に該当すると考えられる。外観は白い微細粉末である。肺に対する毒性文献情報は確認されていない。吸湿吸水性が高く難分解性で、消化管から吸収されず経口毒性は殆ど無いとされる。

　ここでは、当該ポリマーの肺毒性の成立過程と発生機序の解明を目的とした研究のうち、ラット及びマウスの肺曝露実験の中間報告を行う。曝露経路は、ポリマーが惹起する生体反応の概略を把握する目的での気管内投与（IT）、ヒトで生じた肺病変の成立過程と発生機序と定量的用量作用関係を明らかにする目的でのTaquann直噴全身曝露吸入（WB）の二通りを採用した。IT検体（1.5g/L）は懸濁し光顕下で細菌大の粒子を認めた。単回IT（ラット100～300μｇ/匹、マウス15～45μｇ/匹）の直後より（分布に偏り大）ポリマー貪食マクロファージ（PLMφ）の崩壊像と共に肺胞内に強い炎症細胞浸潤を認め、1週に最大となり4週に向けて減弱した。それに交代して肺胞内PLMφ集簇巣形成、Ⅱ型肺胞上皮の増加（TTF1、Tm4sf1 陽性反応性過形成）の出現を認めた。以上、ポリマーの肺胞内半減期は長く組織反応を伴う炎症の遷延を認めた。IT反復26週観察、及び、全身曝露吸入の結果を合わせて報告する。

1.https://www.mhlw.go.jp/file/04-Houdouhappyou-11305000-Roudoukijunkyokuanzeneiseibu-Kagakubushitsutaisakuka/0000163637.pdf

2.同/0000163635.pdf

Multiple factors have been associated with the honey bee colony losses in the past 25 years. Accumulating evidence indicates that at sublethal doses, neonicotinoids cause honey bee brain dysfunction and reduce immunocompetence, leading to impaired navigation and olfactory learning and memory, and susceptibility to pathogens. Moreover, such pesticides disturb the reproductive system of queen bees, i.e., the number of eggs and viability of sperm stored in the spermatheca of queen bees, thereby reducing the numbers of adult bees and broods. Pesticide exposure during the larval development stages prolongs larval development and shortens adult longevity. In addition, the density of synaptic units in the calyces of mushroom bodies in the heads decreases; this effect has been further associated with the abnormal olfactory learning ability of adult honey bees exposed to sublethal doses of imidacloprid during the larval stage. Therefore, numerous physiological aspects of honey bees might be altered after exposure to pesticides at sublethal doses, regardless of the developmental stage. We evaluated the impact of the most widely used neonicotinoids—imidacloprid—on different developmental stages of honey bees by profiling the transcriptomes of worker bees with imidacloprid during only the larval stage. Our results confirm that even intaking 1 ppb imidacloprid during only the larval stage would be enough to severely impact a bee’s gene expression. The existence of many differentially expressed genes may reflect or result in honey bee disorder.

　ネオニコチノイド（NNs）は、現在世界で最も使用されている殺虫剤の一つである。特に日本では、果物や野菜における残留基準値が諸外国と比べ高く設定され、かつ複数種が使用されるため、全体的にNNsの摂取量が多いと考えられる。

　そこで本研究では、日本人におけるNNs曝露実態を明らかにする事を目的に、新生児、幼児を含む延べ数百人から尿を採取し、尿中に含まれる7種のNNs（アセタミプリド、イミダクロプリド、チアメトキサム、チアクロプリド、ニテンピラム、クロチアニジン、ジノテフラン）及び代謝物（N-デスメチルアセタミプリド）をLC/MS/MSで定量した。更に、得られた尿中データより、推定摂取量を算出し、一日摂取許容量（ADI）と比較した。

　分析の結果、日本人の尿から何らかのNNsが検出され、特に、N-デスメチルアセタミプリド（90％）、クロチアニジン（50％）、ジノテフラン（50％）の検出頻度が高かった。一方、尿中濃度から推定した各NNs摂取量は、10～50 µg/dayであり、ADIに比べアセタミプリドで最大1％程度、他のNNsは1％未満であった。更に本研究では、生後48時間以内の新生児の尿も分析した。その尿中濃度は‹LOD～0.7 ng/mLと極めて低かったが、分析した57サンプルのうち14サンプルから検出された。

　本研究の結果、多くの日本人は胎児を含めNNsの曝露を受けていることが明らかにされた。NNsの慢性低濃度曝露の健康影響については、胎児移行のメカニズムや神経発達を含む毒性に不明な点が多いが、最近の報告においてNNsは現在のNOAELの1/10程度の曝露でも実験動物に対し不安などの情動認知行動に影響を与える事が示されている。

　NNsの毒性について、再度リスク評価を実施した上で、継続的なモニタリングを行う必要がある。

農薬は病害虫やカビに作用して殺虫および殺菌効果を示すため哺乳類の生体内にも一定量取り込まれると作用をもたらす。人々は食物に残留した農薬を非意図的に摂取する可能性があるため、人々の健康保護を最優先に国内外で農薬は厳しく管理されてきた。農薬を含む化学物質のリスク評価はCodex委員会のリスクアナリシスの作業原則に基づき実施されている。この作業原則とは、リスク評価の一要素である毒性評価は長期及び短期曝露に対し人々の健康へ影響を及ぼさない量である参照値の設定を目的とし、もう一つの要素である曝露評価では長期及び短期曝露による食品を介した人々の残留農薬の摂取量を推定する。そして最終的に人々の健康に対する参照値と人々の摂取量を比較して、残留農薬のリスクを判断するというものである。毒性評価では参照値の設定に到る過程でハザードである農薬の毒性学的特性が把握される。有機リン剤やピレスロイド剤のように農薬の毒性と殺虫作用の機序が類似する剤もあるが、殺虫機序として神経への影響を有しても毒性試験では高用量投与で神経毒性が発現又は発現が認められない等、異なる場合も多い。毒性評価では発がん性の有無等に関心が寄せられがちであるが、大切なことは人へ外挿される毒性なのか、大量投与で実験動物に生じた毒性が食品を介した残留農薬の摂取により人でも起きうる可能性があるのか、という点をいつも頭に置きながら残留農薬のリスクを評価することである。最近では毒性評価も従来のハザードベースから、摂取量との比較や植物体での代謝物の評価等「現実に人々が摂取する量や状況」、すなわち曝露評価に軸足をおいた残留農薬のリスク評価へと多くの評価機関がシフトしつつある。該当する研究も多い。本シンポジウムでは食品を介した残留農薬のリスク評価の復習だけでなく、代謝物の評価や摂取量等、最近のリスク評価の話題についてもご紹介したい。

Today’s food systems are -to large extent- anchored in chemically-intensified farming operations, and the unguided use of synthetic pesticides has become the norm in many agricultural systems. Aside from undermining ecosystem functioning, triggering biocide resistance and lowering on-farm economic profitability, this overreliance on agrochemicals carries tangible risks for human health. For example, in certain European countries, nearly 100% of citrus fruit is tainted with pesticide residues. In this talk, I will illuminate the largely untapped potential of biological control - i.e., the tactical use of beneficial pest-killing organisms for crop protection – to remediate pesticide misuse and thus eliminate its associated food safety hazards. Drawing upon the case of cassava mealybug (Phenacoccus manihoti; Hemiptera) in tropical Asia, I illustrate myriad benefits of biological control. In late 2008, the above mealybug invaded Thailand, where it inflicted a 27% drop in cassava production and triggered extensive use of pesticides. Mealybug outbreaks were permanently resolved through the introduction of a minute parasitic wasp Anagyrus lopezi (Hymenoptera). In my talk, I reveal how A. lopezi effectively suppressed P. manihoti at a continent-wide scale, delivering pest control services worth US$200-700/ha and virtually abolishing farmers’ need for pesticides. Our work underlines how biological control presents a safe, desirable alternative to synthetic pesticides and can help meet food production needs while benefiting the global economy, the environment and farmers’ pockets.

　近年、欧米を中心にネオニコチノイド系農薬によるハナバチ類など野生生物に対する悪影響が次々と報告され、我が国でも、本系統剤の生態リスク管理のあり方が政策課題として議論されてきた。特に我が国では、水田を生息地とするアキアカネ等のトンボ類が近年急速にその姿を消している原因がネオニコチノイド系農薬やフィプロニルによるものではないかと懸念されている。

　これら新型殺虫剤も、農薬取締法による生態リスク評価を受けて使用が認可されているが、その評価はOECD（経済協力開発機構）において策定された世界統一基準の試験法に基づいて行われており、原則、生態リスクは、藻類、ミジンコ類、魚類の３種類の水生生物に対する急性毒性値によってのみ評価されてきた。

　国立環境研究所では、水田メソコズム試験を行うことで、実際の水田環境では、これらの浸透移行性殺虫剤は法律上の基準値以下の濃度でも生物群集に大きなダメージを与え、水田生態系最上位捕食者のトンボ生息数に大きく影響することを明らかにしている。さらに日本各地の野外水田環境における農薬濃度とトンボ発生数の関係についても調査を行ない、地域から全国スケールに至る農薬影響評価を検討している。

　一方、ハチ類に対する影響評価として、国立環境研究所では、野生のニホンミツバチやマルハナバチを対象種として調査を進めており、花粉・花蜜を介した影響評価試験を行うとともに、野外環境下での花粉・花蜜の残留農薬濃度を計測し、暴露リスクの評価を進めている。

　現在、環境省ではこれら一連の研究成果をうけて、生態リスク評価の高度化を進めており、すでにミジンコに加えてユスリカ幼虫を節足動物の毒性試験生物に加えるとともに、ミツバチの毒性試験ガイドラインの整備を進めている。本講演では、我が国における農薬の生態リスク評価に関する最新情報を紹介するとともに今後の課題について議論する。

GPR40 is highly and dominantly expressed in pancreatic beta cells and is activated by medium- to long-chain free fatty acids (FFAs) to potentiate glucose stimulated insulin secretion. Fasiglifam was a novel, oral, and selective small molecule agonist of GPR40 under development as a once-daily treatment for type 2 diabetes. Unfortunately, a development program was terminated late in phase III clinical trials due to liver safety concerns. Three important serious liver injury cases were identified among around 9100 patients treated with Fasiglifam; one case was adjudicated to be a clear Hy’s Law case [ALT or AST > 3 x ULN (upper limit of normal) and total bilirubin > 2 x ULN] and the two remaining cases were considered to closely approximate Hy’s Law cases. Fasiglifam-related liver toxicity was also observed in repeat-dose dog toxicity studies. It was characterized by elevation of plasma AST, ALT, ALP, and /or bilirubin and portal/periportal granulomatous inflammation with crystal formation in histopathology. This toxicity was observed in a 4-week study at 1000 mg/kg/day. The toxicity measures were greater than those observed at 150 and 80 mg/kg/day in 13- and 39-week studies, respectively, indicating that the toxicity was both dose- and duration-dependent. We analyzed the composition of foreign body materials observed in dog liver and identified Fasiglifam and Fasiglifam glucuronide. Although elevations of serum bilirubin and ALT were observed in repeat-dose rat studies, no histopathological changes indicative of liver injury were observed in any rat studies even at the lethal dose of 2000 mg/kg/day. In this symposium, the mechanisms for liver toxicity of Fasiglifam in dogs, safety margins in plasma and bile, human relevancy and discussion with FDA and PMDA would be introduced.

Fasiglifam (TAK-875), a GPR40 agonist, which was under development as a type 2 diabetes agent, voluntarily discontinued the development just before NDA in Japan and the US. The cause of discontinuation was the concern of side effects on human liver, which were recognized as Drug Induced Liver Injury (DILI). In fact, various groups have studied the cause of DILI induction by Fasiglifam; however, due to the complexity of its development mechanism, the extrapolation and predictability from animals to humans have not been sufficiently elucidated.

DILI in humans by fasiglifam was not a phenomenon unexpectedly clarified in the clinical trial, but the influence on liver effect of dogs had been confirmed from the early development stage. In fact, FDA asked for a view on the extrapolation of dog hepatotoxicity to humans, and they requested a prospective for human safety after the initiation of Phase 3.

The results of various nonclinical studies eliminated the concern of extrapolation to humans related to the dog hepatotoxicity and the initiation of Phase 3 trial was approved by FDA.

In this symposium, I would like to share the results of nonclinical DMPK studies that wiped out the concerns about human extrapolation on hepatotoxicity in dogs, and consider whether the judgment was appropriate. Also, I would like to consider the relationship between dog hepatotoxicity and adverse effects of human liver in the Phase 3 trial which actually decided to discontinue the development voluntarily.

医薬品の生殖発生毒性試験法ガイドラインの全面改訂作業がICH（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceutical for Human Use）の専門家作業部会において進んでいる。今回の改定は約20年ぶりとなるが、注目されるのは発生毒性評価に動物実験代替法（以下代替法）を使用するアプローチの容認が予定されていることである。発生毒性試験代替法の開発の歴史は長く，その間に洗練され，いくつかの代表的なin vitro，ex vivo，あるいは非哺乳類を用いる試験系が広く認知され，一般化学物質や医薬品候補化合物のハザード評価あるいはメカニズム解析を主な目的として利用されている。しかしながら，医薬品の非臨床安全性評価にはハザード評価を超えてリスク評価にまで応える必要があるはずである。現状の発生毒性試験代替法がリスク評価を可能とする領域まで到達しているのだろうか，そうでなければ医薬品のリスク評価に対応するために補完する方策は考慮されているのであろうか。本シンポジウムでは，S5(R3)で述べられる規制当局に受け入れられるための考慮点をベースに，発生毒性試験代替法の代表的な試験系に関する最先端の情報を得たうえで，医薬品の発生毒性試験代替法としての各試験系の課題と早急に着手すべきことを考えてみたい。さらに，代替法のデータからヒトリスク評価を考えるチャレンジングなテーマにまで迫りたい。

マウスES細胞を利用したEST（Embryonic Stem Cell Test）は、被験物質の影響をES細胞の心筋分化過程における拍動阻害により評価することを特徴とする、培養細胞のみを用いたin vitro 発生毒性試験として知られている（Spielmann et al., 1997）。我々は、簡便かつ短期間で化学物質の発生毒性を予測する新規ESTの開発を目的に研究を開始し、まずES細胞から心筋への分化過程において、発生毒性物質との関連が示唆される複数のマーカー遺伝子を同定した。また、マーカー遺伝子の中から、心臓の形態形成など分化に重要な機能を有するHand1（heart and neural crest derivatives expressed 1）遺伝子に着目し、心筋分化過程におけるHand1遺伝子の発現量をルシフェラーゼ活性で簡便にモニター可能な組換えマウスES細胞を用いたHand1-ESTを開発した（Suzuki et al., 2011）。

さらに、我々は、予測精度向上を目的にさらなる改良を加え、医薬品や化学品等の複数化合物のデータを用いて検証を行い、新しい予測モデル式を含むHand1-Luc ESTを開発した（Le Coz et al., 2014）。Hand1-Luc ESTは96ウェルプレート中で分化誘導し、被験物質の影響をルシフェラーゼの測定で評価するスクリーニングに適した簡便な方法である。本発表では複数化合物の検証結果とともに、Hand1-Luc ESTの予測能やOECDテストガイドライン化を目的とした国際バリデーション試験結果および最近の活動状況についても報告したい。

本研究の一部は、NEDO、経済産業省、日本化学工業協会が推進する日本化学協会LRI（Long-range Research Initiative）により支援されました。

動物愛護の観点からなるべく実験動物を使用しない方法に置き換え（Replacement），使用動物数を削減し（Reduction），実験動物に与える苦痛を少なくする（Refinement）という3R の原則が求められています。動物実験代替法としてのin vitro 試験は動物愛護に寄与し，多数の被験物質をハイスループットに評価でき，感度が高い，再現性が良いといった利点が認められます。しかしながらin vitro試験法の限界が認められ、in vivo動物実験が不可欠な分野が多くあることが明らかとなりました。この課題に対応するモデル動物としてのゼブラフィッシュが、脊椎動物として哺乳類やヒトとのゲノム相同性が高いこと、多産性や飼育管理が容易であり、体外受精であり臓器形成が驚くべき速さで完成することなど多くの優越性が認められ、まず国際的にも発生毒性試験に使用されております。そこで代替法としてのゼブラフィッシュによる発生毒性試験の特色、特にヒトへの外挿性における特徴について報告します。まずヒト疾患関連遺伝子におけるゲノム相同性は８２％あり、最近急激に発展しているCRISPRsなどのゲノム編集が最もよく応用されているモデル生物の一つであります。その結果、発生毒性機構のハイスループットな解析が可能となり、今後のヒトにおける発生毒性学の中心的な基盤情報を提供しています。特に、最近報告された(Science2018;360:6392)正常発生プロセスにおけるゼブラフィッシュ全単一細胞トランスクリプトームの包括的研究が、今後のゼブラフィッシュ発生毒性試験のヒトへの外挿性を強化すると思われます。すなわち、ヒトとゼブラフィッシュの発生毒性におけるフェノームの類似性だけではなく、トランスクリプトームにおける相同性により、ゼブラフィッシュ発生毒性試験は、次世代の研究プロトコルへ発展しております。