T cell-mediated cancer immunotherapies, including chimeric antigen receptor (CAR) T cell-therapy and bispecific antibody that recruits cytotoxic T lymphocyte (CTL) to cancer cells, directly recognize surface antigens of cancer cells regardless of MHC restriction. Despite the remarkable efficacy against tumor malignancies in clinical, the CAR T cell-therapy is frequently accompanied with severe cytokine release syndrome (CRS), which is one of the draw backs of CAR T cell-immunotherapy. In preclinical study, the efficacy and safety of CAR T cell-therapy were used to be evaluated using the tumor bearing NOG models. We previously reported activation of infused CAR T cells and regression of tumor burden in tumor bearing NOG mice, in which the human cytokine release in serum was subtle. It is considered that a variety of human immune cells contribute to the CRS, so we evaluated the CRS in the NOG-EXL mice with human hematopoietic stem cell (HSC) transplantation and tumor engraftment. In the humanized NOG-EXL model, we found expansions of human T, B and myeloid cells, as well as human cytokine levels comparable to that in clinical, in mouse peripheral blood. We conclude that the humanized NOG-EXL mice with a variety of human immune cells are superior to the models currently used for projecting the propensity of CRS in the preclinical study of CAR T-immunotherapy.

Cytokine release (CRS) is the most common side effect during clinical CAR-T cell therapy, which includes excessive cascade release of various cytokines such as IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α, INF-γ, and GM-CSF, etc., and the CRS can result in high fever, hypotension, myalgia, coagulation disorder, dyspnea, organ failure and even death in patients. However, T-cell activation and proliferation were the only observations in commonly used immune-deficient mouse model with tumor-bearing in preclinical studies for CAR-T cell therapeutic products. Cytokine releases observed in mice mainly included IL-2 and INF-γ, and cytokine-induced toxicity was rarely observed. At the reported efficacy and safety study for CD22-specific CAR-T cells in NOG-Raji mouse model, CAR-T cells associated toxicities were observed including transient body weight loss and animal death. The results of plasma cytokine assays showed that abnormally elevated TNF-α level might be associated with the toxic reactions in mice. Treatment with anti-TNF-α monoclonal antibodies protected mice from weight loss and reduced animal mortality without affecting the anti-tumor effect of CAR-T cells. The above results demonstrated that elevation of TNF-α levels were the root cause of animal death, and also indicated that peripheral blood TNF-α levels may be a useful toxicity marker in future clinical use of the CAR-T cell product. Treatment of anti-TNF-α monoclonal antibodies may be an effective regimen for prevention and therapy of CRS during clinical application.

【背景】

Brigatinib (BRG) は肝機能障害関連事象が報告されており、一部重篤な事象も認められる。特異体質性肝機能障害の多くは免疫を介しており、薬物またはその反応性代謝物が引き金となることが知られている。BRGはピペラジン環を有しており、代謝過程で反応性代謝物であるイミニウム誘導体が生成する。しかし、BRGやその反応性代謝物が免疫を活性化するかは不明である。

今回、BRGやその反応性代謝物が免疫を活性化させるか評価する目的にTHP-1細胞を用いてインフラマソームの活性化について検討した。

【方法】

分化させたTHP-1細胞にBRG (0.3-3 μM) を添加し、24時間培養した。また、3次元培養したFLC-4細胞にBRG (0.3-3 μM) を添加し、7日間培養を行った。このFLC-4細胞の培養液上清を分化させたTHP-1細胞に添加し24時間培養した。シトクロムP450活性抑制目的に1-aminobenzotriazole (ABT, 1 mM)、caspase-1活性抑制目的にYVAD (1 μM) を使用した。IL-1β産生量はELISA法を、caspase-1活性はCaspase-Glo 1 Inflammasome Assayを用いて測定した。

【結果・考察】

分化したTHP-1細胞にBRGを添加して培養した結果、IL-1βの生成、caspase-1活性が増加した。また、FLC-4細胞にBRGを添加し培養後、その培養液上清を分化したTHP-1細胞に添加して培養した結果、IL-1βの生成とcaspase-1活性が増加した。しかし、IL-1βの生成とcaspase-1活性の増加はYVADで抑制された。

以上より、治療濃度内のBRGは直接THP-1細胞のインフラマソームを活性化させることが示された。したがって、本研究よりBRG誘発性副反応が発症する機序として免疫の活性化が関与していることが示唆された。

【背景・目的】トロバフロキサシン（trova）は重篤な肝障害を引き起こすためグローバル市場から撤退した医薬品であるが、その発生機序は不明である。 一方、我々は薬物あるいはその反応性代謝物が免疫細胞を活性化することで特異体質性の重篤副作用を起こすことを報告している。そこで、trovaまたはその反応性代謝物が免疫細胞を活性化するか検討するために、ヒト肝がん細胞（FLC-4細胞）およびヒト単球性白血病細胞（THP-1細胞）を用い、trovaまたはその反応性代謝物がインフラマソーム反応を活性化させるのかの検討を行った。【方法】3次元培養したFLC-4細胞にtrova 3.0、10、30 µMをそれぞれ添加し、7日間培養を行った。その後、THP-1細胞に培養液上清を添加し、IL-1β産生量およびcaspase-1活性を測定した。またABT（1 mM）はCYP活性を、Ac-YVAD-cmk（YVAD、1 µM）はcaspase-1活性を抑制するために使用した。【結果】THP-1細胞にtrovaを添加して培養した結果、control群と比較して培養液中IL-1β濃度および細胞中caspase-1活性に変化を認めなかった。しかしtrovaをFLC-4細胞に添加し培養後、その培養液上清をTHP-1細胞に添加して培養した結果、control群と比較して培養液中IL-1β濃度の有意な上昇が認められた。細胞中caspase-1活性についてはtrova 30 µMのみ有意な上昇が認められた。trova（30 µM）+ ABT群とtrova（30 µM）+ YVAD群では細胞中caspase-1活性の増加を認めなかった。【結論】trova自身がインフラマソーム活性化に影響せず、trovaの反応性代謝物がCYPにより産生されインフラマソームの活性化に関与している可能性が示唆された。

A relationship has been previously reported between exposure to aromatic amines, including 3,3'-dichloro-4,4'-diaminodiphenylmethane (MOCA), and the development of diseases such as bladder cancer. Skin absorption is believed to be one of the primary routes of exposure. Although hematological toxicity of MOCA through oral exposure has been reported in animals, detailed information on its toxicity (e.g., the origin of toxicity and possible biomarkers), particularly via percutaneous exposure, has not been fully elucidated. Therefore, we investigated whether MOCA has hematological toxicity following percutaneous administration in rats. To this end, young adult male rats were administered MOCA (0, 60, or 120 mg/kg/day) three times per week for four weeks (12 administrations in total). At the end of the treatment period, hematological indices of whole blood samples were measured using a multiparameter automated analyzer, and the major organs, including the target ones, were weighed. The 120 mg/kg/day group showed a significant increase in spleen and liver weights compared to the control group. Although kidney weights showed a slight increasing trend, it was not statistically significant. Hematological examination results showed elevated erythrocyte counts and hematocrit levels. Together with the increased spleen weight, these results suggest that MOCA is hematotoxic when administered percutaneously. As these hematological changes were already relatively prominent during the early stages of exposure, they may be a novel and valid indicator of MOCA exposure through the skin. Currently, we are analyzing RNA sequencing and the effects on hematopoietic cells derived from the femur to further investigate the underlying mechanism(s) of these hematological changes.

【背景】中枢神経系は血液脳関門(BBB)によって血液循環から隔たれた閉鎖空間であるが，髄腔内投与はBBBの影響を受けずに薬剤送達が可能な創薬研究に有用な技術である。我々は，ラットにおける腰椎穿刺による髄腔内投与法を確立するため，様々な投与条件での比較検討を実施した。【方法】雄のSDラット（7-8週齢）を使用して，イソフルラン麻酔下で第5~6腰椎間に針を穿刺し，テールフリック反射を確認後，10 mg/mLのイヌリンを50 μL/bodyの容量で投与した。投与30分後にイソフルラン麻酔下で大槽穿刺によりCSFを採取し，ELISA法にてイヌリン濃度を測定した。投与速度（bolusもしくはinfusion），投与時の体位（伏臥位，立位）について，比較を行った。また，同一動物に約一週間の休薬後，再度投与を実施し，イヌリン濃度のバラつきが個体に起因したものであるかを確認した。投与後の動物の一般状態も確認した。【結果】大槽CSF中イヌリン濃度の高値（300 µg/mL以上）を本検討における成功とみなした場合，成功となったのは，伏臥位での投与速度による比較ではbolusが6/9例，infusionでは2/12例，立位・bolus投与の成功率は10/20例であった。立位での同一動物への投与の成功率は，1回目が4/10例，2回目が8/10例であり，同一個体でもイヌリン濃度に大きく差がみられた。いずれの動物も投与後の一般状態に異常は見られなかった。以上の結果より，ラットにおける腰椎穿刺による髄腔内投与において，大槽CSF中薬物濃度は投与速度や投与時の体位の影響を受ける可能性が示唆された。また，現在，動物の週齢についても検討を実施中である。

ラット毒性試験における血液凝固因子活性測定では、ヒト用の試薬が用いられている。しかし、ヒトと同様の方法をそのまま動物に適用した場合、測定限界を超えるなど毒性評価に影響が出る可能性が考えられる。よって、血液凝固因子活性測定における直線性に関する検討は毒性を評価する上で意義があると考える。今回、第II、V、VII、VIII、IX、X、XI及びXII因子の測定について直線性のみられる測定範囲及び希釈倍率を検討した。 検討材料にはWistar系及びSD系ラットから得た3.8％クエン酸加血漿を用い、測定機器はACL Elite Pro（Instrumentation Laboratory）を使用した。 検討の結果、すべての因子について直線性のみられる測定範囲が得られた。これらの結果から、非絶食下のラットでは、第II、IX、X、XI及びXII因子は3～4倍程度、第V及びVIII因子は4～8倍程度、第VII因子は20倍程度の希釈倍率で測定を行うことが適切であると考えられた。また、絶食がビタミンK依存性凝固因子活性に与える影響を検討した結果、雄性SDラットでは絶食により活性が著しく低下した。このことから、絶食した雄性SDラットを用いる場合は、第II、IX及びX因子は1倍（希釈不要）、第VII因子は3倍程度に希釈倍率を下げることが望ましいことが示唆された。毒性試験では、凝固因子活性が低下し凝固時間が延長傾向を示す場合があることから、このような場合にも希釈倍率を下げることが望ましいと考えられる。 以上のことから、ヒトの血液凝固因子活性測定法を実験動物に適用する場合には、検体の希釈倍率を調整する必要があることが示唆された。今回の結果は、その希釈倍率の設定において一つの参考になるものと思われる。

【背景と目的】医薬候補品の身体依存性の非臨床評価は，一般的にげっ歯類に反復投与した後の休薬時における退薬症候を指標に行われる。代表的な身体依存形成薬物では，投与期間終了後に摂餌量の低下を伴う体重減少，振戦や反応性の亢進などの退薬症候が認められる。一方，自社におけるげっ歯類を用いた身体依存性評価において，一般状態や摂餌の変化を伴わず体重減少のみが観察されることがあり，身体依存性の評価を困難にするケースを経験した。それらの化合物では共通して一般毒性試験にて肝薬物代謝酵素誘導を示唆する所見が認められていたことから，我々は酵素誘導に起因した甲状腺機能の変化が体重減少に関与した可能性に着目し本検討を行った。

【方法】雌性SDラットに，肝薬物代謝酵素誘導能をもつことで知られる化合物：Ethoxyquin（ETH，Nrf2 activator）250 mg/kg，化合物X 300 mg/kg，またはClofibrate（CLO，PPARα agonist）300 mg/kgを通算13週間経口投与した後1週間休薬した。一般状態，体重，摂餌量，甲状腺刺激ホルモン（TSH），甲状腺ホルモン（T3），組織学的検査（肝，甲状腺，下垂体）により評価を行った。

【結果・考察】休薬時いずれの群においても一般状態や摂餌量に変化はなく，CLO群の体重変化は対照群と同等であったが，ETH群及び化合物X群では統計学的に有意な体重減少が認められた。病理組織学的評価では全ての群で肝細胞肥大が確認され，さらにETH群と化合物X群では甲状腺濾胞上皮の肥大や下垂体好塩基細胞の肥大も認められた。化合物X群では休薬中に体重が最も減少した個体において血漿中T3が増加していた。以上の結果から，反復投与後の休薬時に見られる一般状態や摂餌の変化を伴わない体重減少には，休薬直後も持続する甲状腺機能亢進が関与している可能性が示唆された。

Antisense oligonucleotides (ASOs) induced renal proximal tubule injury is one of the major reasons for drug candidate attrition. There is a need to develop robust in vitro screening assays to identify nephrotoxic ASOs before they reach clinical trials. The purpose of this study is to confirm an in vitro profile and set up screening assays using human primary renal proximal tubule epithelial cells (hRPTEC) that recapitulates the in vivo pre-clinical nephrotoxicity by ASOs.

Effect of ASOs on EGF dependent hRPTEC growth was evaluated to establish in vitro robust assays. A several in-house ASOs that showed in vivo nephrotoxicity in pre-clinical studies, dose dependently inhibited EGF induced hRPTEC growth for 9 days treatments. The data were analyzed for evaluation on relevant safety for in vitro and in vivo correlation. Some nephrotoxic potential ASOs were further investigated on primary human proximal tubule cell (PTC) monolayers using a panel of FDA-approved biomarkers (KIM-1, NGAL, clusterin). These ASOs were treated for 3 days in the absence and presence of Receptor Associated Protein (RAP), an inhibitor of the proposed mechanism of ASOs entry into the cells. RAP partially reduced induction of biomarker production by ASOs.

In summary, our studies suggested that in vitro EGF dependent hRPTEC growth and PTC monolayers models were useful tools for safety evaluation before in vivo pre-clinical nephrotoxicity assessment in early drug discovery process.

3価クロム（Cr）はサプリメントとして長期間摂取されることがあるが、その効果については見解が一致しておらず、長期間曝露の影響についての解明は進んでいない。我々は以前、HepG2細胞においてCrの24時間処置によってPPARγが増加し、エリスロポエチン（EPO）産生が促進すると共に、インシュリン抵抗性獲得が阻止されることを報告した。EPOには赤血球産生の促進以外に、細胞保護作用を始め様々な作用が報告されている。しかし、HepG2細胞が長期間Crに曝露された時、PPARγやEPO産生にどのような影響があるのかは不明である。そこで本研究は継代しながらCrを4週間以上処置したHepG2細胞において、PPARγやEPO産生への影響を解析した。Cr処置によって8週までPPARγ mRNA発現量は有意に高く維持された。一方PPARα mRNA発現量には変化がなかった。EPO mRNA発現量もCr処置8週まで有意に高く維持された。Cr処置4週目における低酸素状態やコバルト添加によるEPO産生刺激に対するEPO mRNA発現の増加量は無処置に比べて低下したものの、発現量自体は通常細胞を刺激した場合と差はなかった。また、PPARγの阻害はCr処置4週目でもEPO mRNA発現を抑制した。PPARγはEPO産生だけでなく様々な調節に関わっており、それらの因子はEPO産生にも影響すると予想される。リポポリサッカライド（LPS）投与や酸化ストレスとなるピオシアニン投与はEPO産生を促進するが、Cr処置細胞ではその作用が減弱した。これらの結果から、Crの長期間処置においてPPARγ産生の増加は持続し、それによるEPO産生の増加も維持することが示唆された。PPARγの作用の増強により、EPO産生も増強されたままであるが、LPSや酸化ストレスによるEPO産生増加の応答性は低下していることことが示唆された。

メイラード反応によって生じる糖化産物は加齢とともに体内に蓄積され、がんや糖尿病などの疾患の原因となる。我々は、グルコサミンや5-アミノレブリン酸の二量体から形成されるジヒドロピラジン類に着目した研究を続けており、その一つである3-hydro-2,2,5,6-tetramethylpyrazine (DHP-3) は、細胞毒性作用だけでなく、抗炎症作用も示すことを報告した [1-3]。本研究では、DHP-3と主要なメイラード反応産物であるNε-(carboxymethyl)-L-lysine (CML) およびacrylamide とを比較し、DHP-3による細胞障害の機構解明を目指した。

HeLa細胞を用いて細胞毒性を評価したところ、DHP-3では LC₅₀が532 μMと算出されたのに対し、acrylamideでは10 mM 付近でようやく毒性が認められた。一方、10 mM までの濃度では、CMLに毒性は認められなかった。次に、細胞内のreactive oxygen species (ROS) を解析したところ、ROS産生能はDHP-3 > acrylamide > CML の順であることが示唆された。さらに、レポーターアッセイおよびイムノブロットにより抗酸化ストレス経路の活性化を評価したところ、DHP-3でのみ一過的な活性化が認められた。

以上の結果から、DHP-3はメイラード反応産物の中でも特に高い酸化ストレスの誘導能を有し、それが高い細胞毒性の要因となることが示唆された。

[1] Esaki M. et al., J. Toxicol. Sci., 45(7):401-409 (2020)

[2] Miyauchi Y. et al., J. Toxicol. Sci., 46(11): 509-514 (2021)

[3] Sawai M. et al., J. Toxicol. Sci., 47(9): 381-387 (2022)

これまで主にタンパク質を標的としてきた創薬において，新規標的としてRNAが注目されている．RNA を標的とする治療戦略にはantisense oligonucleotide，siRNA，CRISPR遺伝子編集，およびスプライシングを修飾する低分子化合物 splicing modulatorなどのいくつかのmodalityが適応される．中でも，splicing modulatorはリード化合物の最適化の際に従来の低分子創薬で得られた知見が利用できるという点で魅力的であることから，各社により開発が進められている． Splicing modulatorには，スプライシングを変更させてシュードエクソンを含めてmRNAを発現させることで正常なタンパク質機能を代替させるものやmRNA不安定化により分解を誘導するもの，あるいは，ミススプライシングを調整して，正常なタンパク質を産生させるものがある．これまでrisdiplamやbranaplam等のsplicing modulatorが開発されてきた．一方で，これらの薬物や類縁化合物は，細胞周期停止を引き起こすことが報告されており，安全性での問題が懸念されている．そこで，我々はsplicing modulatorのリスク低減に向けた評価戦略の構築を試みた．本発表では複数のsplicing modulatorを用いて細胞周期及び分化への影響を評価することで細胞傷害性をプロファイルした結果とともに評価戦略を紹介する．

環境中でのマイクロプラスチックの増加が問題視されている。近年、直径0.1 µm程度のポリスチレン粒子を実験的に長期間マウスに暴露した際、腸管組織に蓄積することが報告された。腸管は外界からの異物暴露に対して、腸管バリア機能を有し、これは腸粘膜細胞のタイトジャンクション（TJ）が重要な役割を持つ。そのため、本研究ではヒト結腸癌由来細胞株Caco-2細胞を用いてポリスチレン粒子処置がTJに及ぼす影響について評価した。Caco-2細胞を長期間培養後に、直径0.1 µmの表面にアミノ基修飾のされた蛍光ポリスチレン粒子を24時間処置した。生存率をトリパンブルー染色で、細胞毒性をMTT法で、腸管バリア機能を経上皮電気抵抗(TEER)で評価した。また、抗ZO-1抗体を用いた免疫蛍光染色で、TJの形態を観察し、TJを構成する膜貫通タンパク質であるOccludin、Claudin 1のmRNA発現量をリアルタイムRT-PCR法で測定した。2 µg/mlから200 µg/mlの範囲において、ポリスチレン粒子処置による生存率の低下や細胞毒性は見られなかったが、200 µg/mlのポリスチレン粒子処置は、TEERの低下を引き起こしたことから、腸管バリア機能の低下が示唆された。ZO-1蛍光染色において、control群では細胞周囲にはっきりとした輪郭として観察されたTJが、ポリスチレン粒子処置群では、淡く途切れがちとなり、TJの形態の変化が見られたことからも、バリア機能の低下が支持された。ポリスチレン粒子処置により、Occludin、Claudin 1のmRNA発現量の低下が認められことから、TJを構成するタンパク質が減少し、細胞間隙が広がったと考えられた。以上の結果から、直径0.1 µmのポリスチレン粒子は、TJ関連遺伝子の発現減少を引き起こし、腸管バリア機能を低下させると考えられた。

【目的】経口摂取されたポリスチレンの毒性発現について、マイクロプラスチックの範疇に含まれる直径0.1 µm程度の比較的大きなポリスチレン粒子が、腸管モデル細胞Caco-2細胞内に取り込まれることがわかってきた。取り込まれた粒子の一部はリソソーム腔内に集積することからエンドサイトーシスの関与が想定される。そこで本研究ではエンドサイトーシス調節に関与するNa⁺/H⁺ exchangers (NHE)のポリスチレン粒子取り込みへの影響について評価した。【方法】Caco-2細胞に200 µg/mlのアミノ基修飾のされた直径0.1 µmの蛍光ポリスチレンビーズを24時間処置した。リソソーム機能障害の指標であるリソソーム膜透過性亢進を蛍光タグGalectin-3発現プラスミド導入により観察した。【結果と考察】ポリスチレン粒子の処置により、リソソーム様オルガネラ腔内へ取り込まれ、リソソームの数とサイズの増加を誘導したことからswellingを起こしたと考えられた。NHE阻害剤Amilorideの100 µM処置によりポリスチレン粒子のリソソームへの取り込みが有意に減少した。またNHE-1をノックダウンした細胞においても、ポリスチレン粒子のリソソームへの取り込み量が有意に減少した。ポリスチレン粒子の処置により、僅かではあるがリソソーム腔内局在酵素cathepsin Dの減少、およびGalectin-3のリソソームへの集積が部分的に観察されたことから、リソソーム膜透過性亢進を伴うリソソーム機能障害が生じたことが示唆された。ポリスチレン粒子の処置により生じたリソソーム膜透過性亢進はAmiloride処置またはNHE-1ノックダウンにより抑制された。よってNHE-1がポリスチレン粒子の取り込みおよびリソソーム機能障害に関与することが示唆された。

貧血は鉄不足を始め様々な要因で起こり、慢性ヒ素中毒や敗血症においても症状の1つとして知られている。貧血を改善するためにはエリスロポエチン(EPO)産生が必須である。我々はEPO産生細胞である、HepG2細胞においてヒ素の24時間曝露では活性酸素種（ROS）産生が増加し、EPO産生が促進することを報告した。しかし、ヒ素の長期間曝露での影響は不明である。ヒ素は自然環境中に広く存在し、災害によって環境中のヒ素濃度が高くなることが報告されている。加えて、災害発生時にはトイレ環境の悪化などにより細菌感染も発生しやすくなり、貧血を起こす要因が重なる事態も起こりうる。細菌感染時のEPO産生には様々な報告があり、解明は進んでいない。そこでHepG2細胞においてリポ多糖(LPS)処置によるEPO産生がヒ素曝露下でどのような影響をうけるか解析した。HepG2細胞と3週間以上ヒ素曝露したHepG2細胞にLPSを処置し、2、4、24時間培養後、細胞を回収した。EPO ｍRNA発現量をリアルタイム RT-PCR法で測定した。ヒ素長期間曝露されたHepG2細胞は増殖速度は遅くなったが生存率に差はなかった。無処置のHepG2細胞においてヒ素長期間曝露はEPO ｍRNA発現量を増加させた。無処置HepG2細胞でLPS投与により、2、4、24時間のいずれもEPO ｍRNA発現量が増加した。一方、ヒ素長期間曝露されたHepG2細胞ではLPS投与により、2、4、24時間のいずれもEPOのｍRNA発現量は変化しなかった。 LPSもROS産生を促進することが報告されている。ヒ素の長期暴露によりヒ素によって産生するROSの除去効率が高くなり、LPS添加時のROS量の増加が抑えられたためEPO産生刺激が減少したと考えられた。ヒ素濃度の上昇と細菌感染が重なると、貧血発症がより重篤になる可能性がある。

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、脂肪肝(NAFL)から脂肪肝炎(NASH)や肝硬変に進行した状態を含む肝臓病の総称である。NAFLからNASHへの進行には酸化ストレスの関与が大きい。本研究では、マウスや培養細胞を用いたNAFLDモデルでミトコンドリア機能に必須なミトコンドリアキャリアファミリー(MCF)の発現や機能変化と酸化ストレスとの関係について検討した。超高脂肪(HFD群)または対照飼料(CND群)を12週間給餌したICRマウスをNAFLDモデル、遊離脂肪酸を曝露させたHepG2細胞をin vitro NAFLDモデルとして使用した。CND群に比べHFD群ではBMI及び肝トリグリセリド濃度が有意に増加し、耐糖能の低下が示された。SLC25属33遺伝子の肝mRNA発現変動を比較した結果、HFD群ではSlc25a17が増加し、Slc25a3(isoform B)及びSlc25a13が減少した。さらに、活性酸素種(ROS)除去を担う酵素活性に必要なCuを輸送するSLC25A3とROS発生との関係をHepG2細胞で追究した。野生型(wt)細胞に比べ、SLC25A3欠損させたHepG2/C1及びC3細胞ではミトコンドリア膜電位(MtMP)に変化はなかったがROSが増加した。ROSの増加はGSHジスルフィドレダクターゼ(GSX)及びGSHペルオキシダーゼ(GPX)1のmRNA発現減少と相関した。さらに、HepG2/C1細胞では酸化還元反応に重要なCu(I)の細胞内量の減少、分布の変動が示唆された。以上、脂肪肝によるSLC25A3発現・機能の低下は肝細胞の酸化還元サイクルを破綻させ、軽微だが慢性的なROS産生を促すことが示唆された。今後、NAFLDにおける酸化ストレス発生機序におけるSLC25A3(isoform B)の役割解明が必須である。

【背景】酸化ストレスは皮膚疾患や老化を引き起こす原因となっている。植物由来の精油は、多くの国と地域で伝統的に皮膚保護作用を有するものとして用いられてきた。そこで本研究では、沖縄県産植物由来の精油が、H₂O₂誘導酸化ストレス条件下で皮膚細胞のミトコンドリア機能および酸化防御機構に及ぼす影響について検討した。

【材料と方法】4種類の植物から、コールドプレス、低温真空蒸留または超臨界流体抽出法により7つの精油（A、B、C1、C2、D1、D2、D3）が得られた。精油の抗酸化活性は、DPPHラジカル消去アッセイを用いて検討した。細胞障害とミトコンドリア機能に対する精油の効果を評価するために、ヒトケラチノサイト（HaCaT）細胞に精油を添加し24時間培養した。洗浄後、H₂O₂（800 μM）を添加し、細胞数や乳酸脱水素酵素（LDH）活性について評価した。また、ミトコンドリア膜電位やスーパーオキシド産生量も測定した。

【結果】7つの精油の内、D2が最も強い抗酸化活性を示し、160倍希釈でも50% DPPH消去活性を示した。これらの精油は100 ppm以下ではHaCaTに対して細胞毒性を示さなかった。そして、精油BとD2は、H₂O₂によって誘導されたHaCaTからのLDHの遊離、活性酸素の増加、ミトコンドリア膜電位の低下を有意に改善した。

【考察】沖縄県産植物由来の精油はH₂O₂によって引き起こされる皮膚細胞の酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全に対し保護的な役割を果たすと考えられた。

Blue light is a part of the visible light spectrum that emitting high-energy than others. Today, people are of frequency to expose blue light from 3C devices, consequent to a growing incidence of a multitude illnesses, especially the retinopathy. Endothelial cells are abundant in retina tissues, where they not only nourished the retina sublayers, but also maintained the homeostasis by forming the inner blood-retinal barrier (BRB). However, with the prevalence exposure of blue light, the risks targeting to retinal endothelial cells are currently unknown. We found the density of vital endothelial cells decreased notably after 24-hour exposure (80, 160 and 240 lx). At low-illuminate condition with confined cytotoxicity, endothelial claudin-5 protein was rapidly degraded, coincided with the activation of a disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17). The apparently broken tight junctions and BRB leakage were noted. Pre-incubation with TAPI-2 (ADAM17 inhibitor) alleviated claudin-5 degradation induced by blue light. Moreover, endothelial cells with ADAM17-knockdown were less responded to blue light treatment, and had a higher claudin-5 protein level. Without blue light exposure, the ADAM17 is sequestered by GNAZ protein (a circadian-responsive, retina-enriched Gi protein alpha subunit), whereas ADAM17 escapes from GNAZ protein upon blue light irradiation. A hyper-activation of ADAM17 was affirmed while GNAZ protein knockdown, resulting the down-regulation of claudin-5 and the paracellular permeability in vitro and in vivo. These data support that blue light exposure might impair the inner BRB by accelerating claudin-5 degradation through the disturbance of GNAZ protein and the activation of ADAM17.

Retinal pigment epithelial cells (RPEC) which lined between the photoreceptors and the choroid, are essential for the maintenance of retina health and function. Retinal inflammation has been identified in a variety of ocular diseases. We demonstrated the expression level of aryl hydrocarbon receptor (AHR) dropped obviously in many conditions of retinopathy pathogenesis; for example, high glucose, light exposure, inflammation, and the presence of AHR agonists (e.g. smoking). We thought the loss of AHR protein might impair RPEC function toward inflammaging phenotype. We found a prolonged cell-doubling time, an increased cell cycle regulator p16^INK4a, and a typical senescence feature in RPEC AHR-KO. Also, the integrin β3 and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) strongly enhanced, as compared to that of RPEC wt, suggesting the occurrence of inflammaging. An enhancement of THP-1 monocyte adhesion was also affirmed in RPEC AHR-KO. Either the integrin β3 or the ICAM-1 reduced obviously upon the pre-incubation with pharmacological inhibitors to block/against αvβ3-integrin (RGDfk), FAK (PF573228), phospholipase C (U-73122), protein kinase D (CRT0066101), ERK (U0126) and NFkB (BAY-11-7082). These factors might contribute to inflammaging circuit. Next, a negative correlation between AHR and ICAM-1 was affirmed in the retina tissue of mice receiving blue light exposure. Retina tissue of AHR-KO mice (B6.129-Ahr^tm1Bra/J) also displayed ICAM-1 accumulation and an early dysfunction of electroretinogram. Taken together, our data support AHR defect might induce inflammaging of RPEC, and impair the physiological function of RPE.

This study investigated the effects of dietary exposure to cypermethrin (CYP) on immune cell populations and skin inflammatory responses. Both healthy and imiquimod (IMQ)-induced psoriatic C57BL/6J mice were used in this study. Mice were fed with either the AIN-93 diet or the diets containing 35 ppm CYP throughout the 28-day experimental period. The results indicated that, compared to the normal control group, dietary exposure to 35 ppm CYP in healthy mice significantly decreased circulating regulatory T cells (Tregs), and upregulated the gene expressions of C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1) and interleukin (IL)-17A in the skin. Erythema, scales and thickening of the skin were observed in mice with IMQ-induced psoriasis-like dermatitis. IMQ-induced psoriatic mice had higher blood neutrophil percentage, skin neutrophil infiltration and skin expression levels of IL-17A genes. Dietary exposure to CYP in psoriatic mice significantly decreased circulating Treg population, promoted neutrophil infiltration into the skin and enhanced skin expression levels of CXCL1 and IL-17A genes. Psoriatic mice exposed to CYP also had higher skin injury scores in the histology analysis. These findings suggest that 28-day dietary exposure to CYP in healthy and psoriatic mice lead to Treg suppression in blood and inflammatory genes upregulation in the skin, which may have unfavorable effects on skin health.

【目的・背景】細菌感染症の治療では薬剤耐性菌発生防止のために適切な抗菌薬選択が重要である。グラム染色や培養検査が起炎菌を同定するために行われているが, 臨床の現場では迅速かつ簡便な検査法が求められている。そこで血液分析装置用動物対応ソフトウェアXN-V（シスメックス社製）の結果から、起炎菌の判別が可能か評価した。【方法】グラム陽性/陰性菌の一般的な細菌としてStaphylococcus aureus（Sa）とEscherichia coli（Ec）を選択し、1.0×10 ⁹ cfu/mLに調整した菌液をラット（Slc:SD、9週齢）に腹腔内投与を行い、投与後１日、３日、６日の経時変化を血液学的検査（XN-V測定、塗抹標本観察）および病理組織学的検査により評価した。【結果】Day1においてSaではリンパ球数がDay0より40％以上減少する一方、Ecは平均して10％未満の減少であった。さらにXN-VのWDFchスキャッタグラムにおいてSaはEcよりも高蛍光領域の好中球が認められ、その比率もEcよりも高かった。塗沫標本での形態評価においてもSaでは幼弱な好中球が多く観察されたが、Ecでは分葉核好中球が優位であった。病理組織学的検査では脾臓を中心に主に単核球浸潤による炎症反応が認められ、EcよりもSaの方が重症度が高かった。 これらの反応はSa,Ecともに経時的に減弱し、6日目にはほぼ投与前の状態まで回復していた。【考察】細菌感染の急性期において同数の細菌数を投与した場合でもSaとEoでの反応差異が認められ、これらはXN-Vでも検出できることが判明した。今後、感染ステージや菌種による反応を体系化することで、XN-Vの測定結果による起炎菌推定の可能性が示唆された。

【目的】Falcarindiol（FAL）はセリ科植物（ニンジン、セロリおよびミツバなど）に含まれる天然由来のジアセチレン化合物である。FALは様々な生物活性を有することが報告されている。当研究室ではFALにNrf2活性化を介した薬物代謝酵素誘導作用があることを過去に見出している。FALには抗炎症作用があることがよく知られているが、その作用機序の解明ならびにin vivoにおける抗炎症作用を検討した研究は少ない。本研究では培養細胞および病態マウスを用いて、in vitroおよびin vivoにおけるFALの抗炎症作用を検証し、作用機序としてFALの親電子性が抗炎症作用の発揮に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。

【方法】FALは市販のセリ科植物から抽出・単離した。マウスマクロファージ由来のJ774.1細胞にFALを処理し、各種炎症マーカーのmRNA発現をリアルタイムPCRにより測定した。C57BL/6Jマウスにdextran sulfate sodium（DSS）を投与し、潰瘍性大腸炎を誘発し、FALによる抑制効果を評価した。

【結果および考察】FALを前投与した後、DSSを投与し潰瘍性大腸炎を誘発したところ、対照群と比較して下痢や下血に関する病態スコアおよび臨床症状（体重減少）の改善が見られた。また、TBARSやNO産生レベルの上昇もFALの投与により有意に抑制された。FALを前処理したJ774.1細胞では、LPS刺激によって上昇した炎症マーカーの発現が有意に抑制された。NO産生量およびNF-κB発現もFALの前処理により抑制されたが、FALとシステインを結合した付加体で前処理すると抑制効果は失われた。以上の結果より、FALはin vitroおよびin vivoにおいて抗炎症作用を示し、FALの親電子性部位が抗炎症作用の発揮に重要であることを明らかにした。

There are human cases of the disorder in blood hematopoietic organs presumably related to polyhexamethyleneguanidine-phosphate (PHMG-p) exposure, but the evidence of the causal relationship between PHMG-p exposure and these diseases is not well known. To investigate the effects of PHMG-p exposure on blood cells, PHMG-p was intratracheally instilled in mice, and the specimens were collected. The cell proportions on BAL and blood were performed to determine the injury feature and to investigate the change in genes related to blood cell formation, we conducted RNA-seq and bioinformatics on the lung tissue. PHMG-p induced the infiltration of inflammatory cells, and most of the inflammatory cells were lymphocytes. In addition, there was a decrease in the proportion of lymphocytes in the blood caused by PHMG-p exposure. PHMG-p modulated the expression of genes related to blood cell differentiation, such as hematopoietic cell lineage and the JAK-STAT signaling pathway. There was a decrease in the genes related to the differentiation of hematopoietic stem cells (HSC) into common lymphoid progenitor (CLP) cells and an increase in the genes of HSC into common myeloid progenitor (CMP) cells. These changes appear to reinforce the differentiation of HSC into CMP rather than CLP. Collectively, we suggest that PHMG-p exposure is associated with a decrease in the number of lymphocytes in the blood via a decrease in the differentiation of HSC into CLP and an acceleration of lymphocyte infiltration from the blood into the damaged site.

Polyhexamethyleneguanidine-phosphate (PHMG-p) is a lung toxicant and can reach the whole body by inhalation. Inhalation exposure to PHMG-p causes effects on the lymphocyte percentage in the blood, but the effect on the ratio of T cell subtypes is not known. Therefore, we aimed to determine the change in ratio of the T cell subtype and T cell differentiation-related genes by PHMG-p exposure. PHMG-p was instilled intratracheally in mice, and the lungs, thymus, and blood were collected. We analyzed histology in the lung and thymus, the T cell subtype by flow cytometry in the blood, and gene expression in the thymus. In the lungs, PHMG-p induced varying degrees of damage, ranging from inflammatory cell infiltration to granulomatous inflammation/fibrosis. There was a decrease in lymphocyte number in the blood as well as a change in the T cell subtype ratio (CD4:CD8) in the group administering PHMG-p. In addition, there was observed in the alteration of T cell differentiation-related genes in the thymus. These results indicate that PHMG-p alters T cell subtypes in the blood by regulating T cell differentiation-related genes. Collectively, we suggest that the damage caused by PHMG-p is not limited only to the lungs and can affect the immune response of the whole body via the change in the T cell ratio, which is a key cell in the immune system.

Natural compounds, including herbal ingredients, have been developed as therapeutic agents for various diseases in drug discovery. However, the potential hepatotoxicity of these compounds can be a significant hurdle in developing drug candidates. In this study, we propose a pathway-sensing method using reporter cell lines to evaluate cellular stress caused by natural compounds. Key transcription factors, including AP-1, P53, Nrf2, and NF-κB, regulate cell proliferation, apoptosis, oxidative stress, and inflammation, respectively. We established HepG2 cell lines that produce GFP in response to the transcriptional activation of these factors through their TREs. Using pathway-sensing hepatocytes, we evaluated the mode of action of several natural compounds, such as flavonoids, polycyclic compounds, di-/ter-pyridines, and quinoids. We confirmed that the major mechanisms involved in hepatotoxicity were AP-1 (75%) > P53 (60%) > NFkB (35%) > Nrf2 (32.5%). We also found that several natural compounds, including apigenin, were potential hepatotoxic compounds causing cytotoxic effects mediated by AP-1 and P53 pathways. This method can classify the mode of action for natural compounds using pathway-sensing hepatocytes. Our findings suggest that this approach is suitable for screening potentially hepatotoxic natural compounds and provides valuable insights into the molecular mechanisms underlying cellular stress in the liver. This work received support from a grant (NRF-2016M3A9C4953144) from the Ministry of Science, ICT, and Future Planning, and a general research grant from the Korea Institute of Toxicology (KK-2303), and the KRIBB research initiative program (KGM5242322).

【目的】ミトコンドリア毒性および肝細胞内胆汁酸蓄積は薬物性肝障害(DILI)発症の主たる機序であり、両者は相互に連動して肝細胞ストレスを促進させ、細胞死あるいは免疫、炎症応答を誘導すると考えられている。胆汁酸はミトコンドリアの膜電位、呼吸鎖活性、膜構造、生合成を障害することが知られており、薬物によるミトコンドリア毒性感受性に対して直接的な影響を与える可能性がある。本研究では、ミトコンドリア膜構造の変化を指標としてin vitroミトコンドリア毒性評価を実施し、胆汁酸および薬物併用時の直接的な作用を明らかにすることを目的とした。

【方法】雄性C57BL/6マウスを実験に供した。肝単離ミトコンドリア画分を用いて、胆汁酸および薬物による膨潤を評価した。併せて、膨潤に伴ってミトコンドリアから放出されるダメージ関連分子パターンについて評価した。

【結果・考察】細胞障害性の強いデオキシコール酸（DCA）、ケノデオキシコール酸（CDCA）はいずれもミトコンドリア膨潤を誘発した。この膨潤はカルシウム非共存実験条件下では極めて弱く、膜透過性遷移孔依存的な膨潤阻害剤シクロスポリンの併用によって抑制された。また、DCAはstate3呼吸活性を阻害し、state3/state4比の低下が見られた。DCAとDILI誘発薬物の相互作用に関する実験では、胆汁酸トランスポーター(BSEP/ABCB11)阻害能を有するトログリタゾンによる膨潤を増強させること、ジクロフェナクについては膨潤の増強効果がより顕著であることがわかった。細胞障害性の弱いコール酸は単独では膨潤および呼吸活性に対する影響は見られず、DILI誘発薬物による膨潤に対しても明白な増強作用は見られなかった。以上より、胆汁酸は薬物によるミトコンドリア毒性を直接的に増強させることが示された。

【目的】isothiazolinone抗菌薬はシャンプーやスプレー式家庭用消臭剤などの家庭用品などに用いられているが、アレルギー性接触皮膚炎などの健康被害が報告されている。本研究では、感覚神経のみならず皮膚や免疫細胞にも発現し、免疫応答や炎症反応に関与することが報告されているTRPV1に着目し、isothiazolinone系抗菌薬による活性化について評価した。【方法】in vitro評価：ヒトTRPV1を恒常的に発現するFlp-In 293細胞株を樹立し、細胞内Ca²⁺濃度の増加を指標として活性化を評価した。in silico 評価：PDBよりTRPV1の立体構造モデル（ID:3J5Q）をダウンロードした。Molecular Operating Environment（2022.02,MOLSIS Inc.）を用い、力場としてはAmber10：EHT、溶媒条件としてはR-Fieldを適用し、構造最適化後にドッキングシミュレーションを行い、分子間相互作用を検討した。【結果及び考察】in vitro 評価の結果、評価したisothiazolinone抗菌剤の中で2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one (OIT)が最も低い濃度でTRPV1を活性化することが明らかになった（EC50；50 µM）。OITについては、in silico評価の結果、TRPV1の典型的アゴニストであるcapsaicinの結合部位であるY511と相互作用する可能性が示された。室内環境対策として使用が増加しているノンホルマリン壁紙用接着剤からOITを含むisothiazolinone系抗菌薬が検出されている。OITは平成21年に発生した冷却パッドの使用に伴う重大製品事故の原因物質として特定されており、OITがTRPV1の活性化を介してこれら健康被害を引き起こす可能性が考えられる。

現在、種々の悪性腫瘍に対し植物成分由来の抗悪性腫瘍薬が広く用いられている。婦人科悪性腫瘍においては第一選択薬に抵抗性の腫瘍や再発腫瘍にはcamptothecin類（irinotecan, topotecan）が選択されることが多い。CamptothecinはDNAの超らせんを除去する働きをする酵素DNA topoisomerase Iを阻害して、細胞死を引き起こすことにより抗腫瘍効果を示す。しかし、camptothecinに耐性を持つ悪性腫瘍も存在する。今回、camptothecin耐性の悪性腫瘍に効力を発揮しうる生薬由来の黄連(Coptis Rhizome)に含まれるberberineという成分に着目した。我々の先行研究で生薬由来抽出物よりパルスフィールド電気泳動法を用いてDNA二重鎖切断を誘導する生薬成分を複数個同定している(Kawashima et al. Genes to Cells, 2017)。BerberineはDNA topoisomerase Ⅱを阻害することが報告されている。この研究においてcamptothecin耐性の腫瘍細胞に対するberberineの抗腫瘍効果の分子mechanismを解明することを目的とした。Camptothecin耐性変異をもつacute lymphoblastic leukemia 細胞の2株を使用した。Berberine、coptisine、 berberrubineによる細胞死を評価するためMTT assayを行った。Berberineにおいて、camptothecin耐性株の細胞死がDNA二重鎖切断活性を介して誘導されていることが示唆された。他の類似構造化合物であるcoptisine等においては明らかな細胞死は誘導されなかった。Camptothecin耐性の悪性腫瘍に対し、berberineは有効である可能性が示唆された。

Supersulfides play a role in redox homeostasis, but adaptive cell responses to excess sulfur stress are not well understood. To address this issue, we generated transgenic (Tg) mice overexpressing cystathionine gamma-lyase (CSE) to catalyze transformations of cystathionine to cysteine (CysSH) and of cystine (CysSSCys) to CysSH persulfide (CysSSH). CSE Tg mice treated with excess cystine exhibited clear sulfur stress, as manifested by atrophy of the organs. Contrary to expectations, CysSSH concentrations were comparable in a variety of tissues of wild-type (WT) and CSE Tg mice; however, plasma levels of CysSSH in CSE Tg mice were significantly higher than those in WT mice. This export of surplus intracellular CysSSH was also characterized in primary hepatocytes from CSE Tg mice. Exposure of primary hepatocytes to sodium tetrasulfide (Na₂S₄) as a sulfur stress generator resulted in enhancement and rapid decline of intracellular CysSSH levels, accompanied by a concentration-dependent release of CysSSH into the extracellular space. Interestingly, among all amino acids, CysSSCys was found to be essential for CysSSH export from primary mouse hepatocytes, HepG2 cells, and HEK293 cells during Na₂S₄ exposure, suggesting that cystine/glutamate transporter (SLC7A11) contributes, at least partially, to CysSSH export. We established HepG2 cell lines with knockout and overexpression of SLC7A11 and used them to confirm that SLC7A11 is a predominant antiporter of CysSSCys and CysSSH. Furthermore, we found that cellular proteins undergo polysulfidation in response to Na₂S₄-mediated sulfur stress, which results in a lower mitochondrial membrane potential and concentration-dependent Na₂S₄ cytotoxicity. These results suggest that there are CysSSCys-dependent antiporters that pump excess CysSSH from cells during sulfur stress.

【目的】プロテオグリカン（PGs）は細胞外マトリックスの構成成分であり、コアタンパク質にグリコサミノグリカン糖鎖が結合した構造を有する。様々な生体分子と結合することで、PGsは細胞内へのシグナル伝達を調節する。これまでに、活性酸素種に代表される求電子性物質によるPG分子種の発現調節は報告されてきたが、求核性物質による発現調節の報告は極めて少ない。超硫黄分子（supersulfide）は強い抗酸化作用を有する求核性物質であり、シグナル伝達やレドックス制御など生命現象への寄与が近年急速に明らかとなっている。本研究では、カテネーション数の異なる超硫黄ドナーであるNa₂S₃およびNa₂S₄を用いてPG分子種発現について解析した。【方法】実験にはコンフルエントに培養したヒト血管内皮細胞株EA.hy926細胞を用いた。Na₂S_４およびNa_２S_３（10または50 µM）を8, 24, 48時間処理し、定量的RT-PCR法で血管内皮細胞における代表的PG分子種であるperlecan, syndecan-1, syndecan-4, biglycanのmRNA発現を解析した。【結果および考察】Perlecanおよびsyndecan-1 mRNAはNa₂S₃処理下では48時間後、Na₂S₄処理下では8時間から48時間後にかけて濃度依存性に抑制された。Syndecan-4 mRNAはNa₂S₃処理下では顕著な変動が認められなかったが、Na₂S₄処理下では8時間から48時間後にかけて誘導が認められた。Biglycan mRNAはNa₂S₃とNa₂S₄のいずれの処理下においても顕著な変動が認められなかった。超硫黄分子におけるカテネーション数の大きさは求核反応性の強さと相関することが知られており、本研究を通じて超硫黄分子の求核反応性に対するPG分子種の発現調節機構が存在することが明らかとなった。

【目的】薬物誘発製横紋筋融解症は、HMG-CoA還元酵素阻害薬やフィブラート系薬などで引き起こされることが知られているが、その発生機序については十分に解明されていない。我々は、マウス筋芽細胞由来C2C12細胞でfenofibrate誘発細胞死の様式が、増殖期と分化後で異なることを見出した。そこで、我々は増殖期と分化後のC2C12細胞で発現量の異なる遺伝子がfenofibrate処置に対する感受性の違いに関与しているのではないかと考え、cDNAサブトラクション法によりC2C12細胞の増殖期特異的に発現する遺伝子の1つとしてB cell translocation gene(btg1)を同定した。本研究では、マウスbtg1をCHO-K1細胞に一過性に発現させ、fenofibrate誘発細胞毒性発現に対するbtg1発現の影響を調査することを目的とした。

【方法】PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit (Clontech)を用いて、増殖期特異的に発現している遺伝子のcDNAライブラリーを作製し、C2C12細胞の増殖期特異的発現遺伝子の一つとしてbtg1を同定した。マウスbtg1発現ベクターを作製し、CHO-K1細胞に一過性に発現させ、fenofibrate誘発細胞毒性への影響を測定した。

【結果と考察】ベクターのみを導入したCHO-K1細胞では、48時間の300 µmol/L fenofibrate処置により生細胞数が27％減少し、btg1の遺伝子導入でも生細胞数が28％減少した。また、btg1を遺伝子導入したCHO-K1細胞では、ベクターのみを導入した細胞と比較して、48時間の300 µmol/L fenofibrate処置により生細胞数が38％減少した。以上のことから、マウスbtg1の遺伝子発現は、fenofibrate誘発細胞毒性に対して相加的に作用することが示唆された。

【目的】HMG-CoA還元酵素阻害薬、フィブラート系薬などの投与により発症することがある薬物誘発性横紋筋融解症の発生機序については未だ充分に解明されていない。我々は、マウス筋芽細胞由来C2C12細胞でfenofibrate誘発細胞死の様式が増殖期と分化後で異なることを見出し、増殖期と分化後のC2C12細胞で発現量の異なる遺伝子がfenofibrate処置に対する感受性の違いに関与しているのではないかと考え、cDNAサブトラクション法によりC2C12細胞の分化後特異的に発現する遺伝子の1つとしてSushi repeat-containing protein X-linked 2 (srpx2)を同定した。本研究では、C2C12細胞におけるfenofibrate誘発細胞毒性に対するsrpx2遺伝子過剰発現の影響を解析することを目的とした。【方法】PCR-Select^™ cDNA Subtraction Kit (Clontech)を用いて、増殖期特異的に発現している遺伝子のcDNAライブラリーを作製し、C2C12細胞の分化後特異的発現遺伝子の一つとしてsrpx2を同定した。マウスsrpx2発現ベクターを作製し、リポフェクション法によりC2C12細胞に遺伝子導入し、fenofibrate誘発細胞毒性への影響を測定した。【結果と考察】分化後にsrpx2を遺伝子導入したC2C12細胞において、溶媒（DMSO）処置群と比較してfenofibrate処置群で生細胞数が有意に増加した。また、SRPX2タンパク質はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであり、細胞の接着、増殖、分化及び移動などの生理学的プロセスを調節することが知られている。以上のことから、マウスsrpx2の過剰発現は、fenofibrate誘発細胞毒性に対して細胞増殖促進的に作用することが示唆された。

「継世代エピジェネティクス遺伝：TEI」は原因物質に曝露されていない世代においても、遺伝子変異によらない何らかの毒性作用が認められる現象で、生殖細胞のエピジェネティックな修飾が世代を越えて伝達されていることに起因していると考えられている。TCDDなどのダイオキシン類は、ラットやマウスの哺乳類でTEIを誘発するとの多くの報告があり、ヒトにおいてもダイオキシン類のpolychlorinated dibenzofurans (PCDFs)による「カネミ油症」などでその可能性が議論されている。しかしその誘発機構に関してはよくわかっていない。一方、ダイオキシン類、B(a)Pなど多環芳香族炭化水素（PHA）などの毒性発現機序は、AhRの過剰な活性化が解毒代謝、免疫、細胞周期など様々な経路でかく乱を引き起こすことによるものと考えられ、さらに最近ではエピジェネティックな作用が関与しているとの知見が得られている。これまでに実験動物などで確認されたDioxins、PHAなどの内分泌かく乱物質によるTEIに関しては、特にゲノムインプリンティング関連遺伝子H19/IGF2との相関がそのひとつの候補として提唱されている。今回は、AhRとH19/IGF2の相互作用についてレビューし、特に「カネミ油症」におけるTEIの可能性について議論したい。

胎児期の環境因子曝露による精子のDNAメチル化変化が子孫の健康に影響を及ぼすことが示唆されているが、具体的な影響伝搬経路は明らかにされていない。私たちは先に、胎児期に無機ヒ素曝露を受けた雄マウス（C3H/HeN系統、ヒ素群F1）の仔であるヒ素群F2雄で肝腫瘍が増加することをみいだした。またヒ素群F1精子で腫瘍への関連が報告されているレトロトランスポゾンの領域で低メチル化DNAが有意に増加することをみつけ、その特徴の一部がF2の胚にもみられることを観察した。本研究ではさらに、ヒ素群F1精子の遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化変化がF2胚のプロモーター領域でも再現されるかを検討した。対照群またはヒ素群F1雄（C3H/HeN）をB6系統雌と交配し、妊娠7.5日にF2胚を採取し、雄の胚のDNAについてRRBS法でDNAメチル化解析を行った。プロモーター周辺で対照群と比較してヒ素群でメチル化が有意に低下したサイト（hypo differentially methylated cytosine、hypoDMC）または上昇したサイト（hyperDMC）を抽出し、F1精子のDNAメチル化と比較した。その結果、F1精子とF2胚で、同じ位置に共通に存在するhypoまたはhyperDMCは数がごく限られていたが、DMCが同一の遺伝子のプロモーター内に存在する例が複数見つかった。さらにF2胚で新たにプロモーターに出現するDMCが多数みつかった。以上より、ヒ素群F2胚プロモーターでのDNAメチル化変化はF1精子でのメチル化変化が直接再現されるのではなく、領域のメチル化形成に関わるなんらかの因子の変化によりもたらされることが示唆された。これらのプロモーターのDNAメチル化変化は胚の遺伝子発現変化を誘導する可能性が考えられた。

現在、妊婦がメチル水銀 (MeHg) が生物濃縮された魚介類を摂取することによる、胎児への影響が懸念されている。本研究では、神経分化期MeHg曝露が神経突起伸長などの表現型に影響を及ぼす関連遺伝子のエピゲノム解析を行った。ヒト胎児脳由来不死化細胞 (LUHMES細胞) を用いて神経分化誘導を行い、神経分化2～8日目までMeHg (0.1, 1 nM) を6日間曝露した。分化8日目において神経突起伸長、分化4、10、16日目において、神経スパイク頻度を測定した。分化8日目において、遺伝子発現量、タンパク発現量およびDNAメチル化やヒストン修飾などのエピゲノム解析を行った。 MeHg (1 nM) 曝露群において、神経突起伸長と神経スパイク頻度は有意に減少した。MeHg (1 nM) 群に注目し、神経突起伸長やシナプス形成に関わる遺伝子として、NR4A1を検討した結果、MeHg (1 nM) 曝露によって遺伝子発現量、タンパク発現量ともに有意に減少した。次に、NR4A1の遺伝子プロモーター領域のエピジェネティクス変化を検討したところ、上流 -0.4 ～ -0.5 kbのCREB結合配列 (CRE) におけるDNAメチル化レベルがMeHg曝露により上昇した。さらに、ヒストン修飾も検討したところ、MeHg曝露により、ヒストンH3リジン14のアセチル化およびヒストンH3リジン9のアセチル化レベルの減少が確認された。さらに、これらのプロモーター領域のCREBおよびCBPの結合量もMeHgによる減少が確認された。LUHMES細胞において低濃度MeHgによる神経突起伸長抑制に関連する遺伝子として、NR4A1を見出した。さらに、MeHg曝露によるNR4A1遺伝子発現量減少には、遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化の上昇、ヒストンアセチル化減少などの、転写抑制に働くエピゲノム変化が関与することが示唆された。

【背景】細胞サーマルシフトアッセイ（CETSA）は標的タンパク質に対する化合物の結合を生細胞で評価する手法として開発されたが，本手法のプロテオーム解析への応用（CETSAプロテオミクス）は標的分子への結合に加えて下流の生化学的変化も解析可能とする。本研究では，CETSAプロテオミクス法で，サイクリン依存性キナーゼ4および6（CDK4/6）阻害剤としてその特性が明らかにされているパルボシクリブ（PAL）を用い，毒作用に関連した細胞（骨髄および消化管）におけるPALの標的分子に対する結合および下流タンパク質に及ぼす影響を分析した。 PALの臨床・非臨床における毒作用：血液毒性（骨髄抑制は細胞老化を伴わない細胞周期停止に起因し，回復性を示す），消化管毒性（血液毒性より程度は低い），乳がん細胞での細胞老化誘導（20Sプロテアソームの熱安定性上昇と関連） 【結果】CETSAプロテオミクスによる解析で，骨髄および消化管細胞でCDK4/6に対するPALの高い選択性が示され，骨髄細胞ではPALの血液毒性と一致し，また，これを裏付けるタンパク質間相互作用の変化が捉えられた。高い選択性とオフターゲットを示唆するパスウェイ変化の欠如から，PALの血液毒性はオンターゲット阻害に基づくことが示唆された。実際に，CDK4/6のダブルノックダウンにより骨髄細胞の細胞生存率が低下したのに対し消化管細胞では影響がみられなかった。またPALは骨髄細胞の20Sプロテアソームの熱安定性に影響を及ぼさず，このことは骨髄細胞でPALが細胞老化を誘導しないことを裏付けるとともに好中球減少症の休薬による回復性を支持した。 【結論】PALの標的結合および下流タンパク質への影響の評価においてCETSAプロテオミクスの信頼性が確認され，これにより本手法は新規化合物の特性を解析する有用な手法となり得ると考えられた。

痙攣は医薬品開発に多大な影響を及ぼす毒性所見のひとつであるが、未だ適切なバイオマーカーは見出されていない。以前の研究においてサルの心拍変動と機械学習によって算出した指標がGABA_A受容体拮抗薬誘発痙攣のバイオマーカーとなり、痙攣発生用量より低い用量で痙攣ポテンシャルを予測できるという可能性を示した。今回は本法によって他の機序の薬物誘発性痙攣の予測も可能であるのかを確認した。さらに自律神経系に影響を与える非痙攣薬についても同様に検討し、偽陽性の有無についても検証した。テレメトリー埋植雄性カニクイザルに痙攣薬（4-AP、カイニン酸、ラノラジン及びブプロピオン）を複数用量投与し、心電図を連続記録した。薬物投与前期間のデータを学習データとし、異常検出手法のひとつである多変量統計的プロセス管理により投与後の心拍変動を解析した。その結果、4-APでは痙攣用量より低い用量から指標（Q統計量）の上昇が認められ、カイニン酸及びラノラジンでは痙攣用量において指標の上昇が認められた。一方でブプロピオンでは本試験の最高用量（痙攣量の約1/3）まで指標の変化は認められなかった。また、非痙攣薬（アトロピン、アテノロール及びクロニジン）を投与したサルにおいて同様に解析した結果、いずれの薬剤においても明確な指標の変化がみられた。今回設定した指標の上昇は自律神経の活動状態と関連する既存の心拍変動指標（HF及びLF/HF）の変化を伴っていたもしくは先行していたことも踏まえると、本指標は痙攣そのものを直接的に検出しているというよりは自律神経系の変化を鋭敏にとらえるものであると考えられる。本法は偽陽性を生じさせる可能性はあるものの、開発候補医薬品の薬理プロファイルからその適用を慎重に判断すれば、薬物誘発性痙攣の有用な予測手法となり得ると考えられる。

痙攣は医薬品開発に多大な影響を及ぼす毒性所見のひとつであるが，痙攣発現を予測する理想的なバイオマーカーは未だ見出されていない。そこで我々は，痙攣の予兆を示すバイオマーカーとして脳波あるいは心拍変動に着目し，臨床試験で痙攣を誘発した化合物X（非選択的ナトリウムチャネルブロッカー）を用いて，サルにおける痙攣予測の可能性を2つの実験で検討した。実験1（脳波の検討）：テレメトリー埋植カニクイザル3例に痙攣がみられるまで漸増で経口投与（0，10，30，100 mg/kg）後，脳波を記録し，スペクトル解析及び棘波（スパイク）カウントを行った。実験2（心拍変動の検討）：テレメトリー埋植カニクイザル4例に4用量（0，3，10，30 mg/kg）をラテン方格法で経口投与し，心電図を記録した。実験2では，薬物投与前期間のデータを学習データとし、異常検出手法のひとつである多変量統計的プロセス管理により投与後の心拍変動を解析し，正常範囲（投与前データ）からの逸脱度を解析することで痙攣予兆の検出を試みた。実験1では2例で痙攣（30あるいは100 mg/kg）が発生したが，その2例では痙攣量より低い用量において痙攣の予兆と思われる脳波の変化は認められなかった。一方，実験2では痙攣自体は起きなかったものの，2例において，“指標”（Q統計量）が用量依存的に増加した。このような非痙攣誘発用量における“指標”の上昇は，以前報告したGABA_A受容体拮抗薬を用いたサルの痙攣予測の検討結果と類似しており（第48回日本毒性学会），この“指標”が痙攣予兆を示すバイオマーカーになり得ると思われた。以上より，サルにおける痙攣予測では，脳波よりも，心拍変動解析と多変量統計的プロセス管理を組み合わせた機械学習手法が有用である可能性が示唆された。

【目的】一般毒性試験において臨床検査は重要な役割を担っている。自社では、臨床検査において血液学検査、血液生化学検査、骨髄検査、尿検査、サイトカイン測定等を実施しているが、miRNA測定が新たな臨床検査評価手技となり得るか、その有用性を評価した。

【方法】実験は既報^※を参考に実施した。雄性SDラットに、イソプロテレノールを0.15、1.5及び15 mg/kgを単回腹腔内投与し、溶媒対照群には生理食塩液を同様に投与した（n=12／群）。投与1、2、6、及び24時間後にイソフルラン麻酔下で腹大動脈より採血し（n=3／時点）、血液学検査、血液生化学検査、心筋トロポニン測定及び血漿中miRNA（miR-1、miR-133等）測定を実施した。また、心臓病理組織学的検査を実施した。※：井口拓馬ら、P-69、第43回日本毒性学会学術年会

【結果及び考察】血液学検査及び血液生化学検査では、0.15 mg/kg群で投与6時間後、1.5及び15 mg/kg群で投与1～6時間後に心筋障害に関連するパラメータ変動が認められた。心筋トロポニン及びmiRNAに関しては、0.15 mg/kg以上の群で投与1時間後から変動が認められた。心筋トロポニン及びmiRNA共に投与2時間後に最も変動が大きかったが、miRNAは心筋トロポニンよりも早い時点で変動が消失した。心臓病理組織学的検査では、投与6～24時間後に左心室における炎症反応が用量依存的に認められた。以上、本試験条件下では、miRNAは病理組織学的変化よりも早期に変動が認められ、通常の臨床検査項目との比較において、検出感度は同等であった。miRNAは少量サンプルで解析が可能なため、薬物の影響を経時的かつ網羅的に捉えることができる。通常の臨床検査項目と組み合わせることにより、幅広い毒性検出が可能性となると考えられた。

【背景と目的】我々はDNA損傷マーカーであるγ-H2AXの免疫染色により、ラット膀胱発がん物質を短期間で検出し得ることを報告した。本手法の腎臓への応用を目指し、種々の腎発がん物質をラットに28日間投与し、γ-H2AX形成を指標とした検出感度を検証した。また、短期試験（高用量）では腎傷害を誘発するが長期のがん原性試験（低用量）では陰性であった物質を用いて、28日間投与におけるγ-H2AX形成の差異を検討した。

【方法】6週齢の雄F344ラットに、腎発がん物質として0.8%酢酸鉛(II)三水和物、0.24% disperse orange、0.2% monuron、0.25%ニトロフラントイン、5%フェノールフタレインおよび4%ケルセチンを28日間混餌投与した。またカルボキシン（CBX）を、腎傷害を示す短期試験の最大耐量として0.2%、および2年間がん原性試験で用いられた0.04%の用量で28日間混餌投与した。腎臓の病理組織学的検索およびγ-H2AX免疫染色を実施し、皮質および髄質外帯外層それぞれの尿細管におけるγ-H2AX陽性上皮細胞の割合を測定した。

【結果と考察】6種の腎発がん物質を投与したラットの尿細管上皮細胞におけるγ-H2AX陽性率は、皮質ではすべての投与群で、髄質外帯外層ではケルセチンを除く5物質で、対照群と比較して有意に増加した。CBX投与群では、高用量（0.2%）では好塩基性尿細管等の病理組織学的所見の発生頻度増加とともに、髄質外帯外層におけるγ-H2AX陽性率の有意な増加が認められた。一方低用量（0.04%）では、腎臓の病理所見は軽微でγ-H2AX形成の増加はみられなかった。以上より、γ-H2AX免疫染色により腎発がん物質を短期間かつ高感度で検出可能であることが示された。またCBXの結果から、本手法は用量による腎傷害性および発がん性の差異を適切に反映すると考えられた。

血液中を循環するエクソソームに含まれるマイクロRNA（exomiR）は，疾患によって固有の発現パターンを持ち，安定性に優れることから，低侵襲性バイオマーカーとして期待されている．exomiRの発現解析において，安定なリファレンス遺伝子（RG）の選択は，誤った結果を避ける上で重要である．従来法により単離されたエクソソームは精製度が低く，エクソソーム外のRGからエクソソーム内固有のRGを選択するのが困難であった．加えて，ますます検体数が増加するexomiR研究において，RGのスクリーニングの効率化が求められる．そこで本研究では，高純度のエクソソーム単離法を用いたexomiR発現解析系における，RGの本スクリーニング前に少数の検体を対象としたRGのプレスクリーニングのプロセスについて検討した． 10例の正常ヒト血清を用いて，ホスファチジルセリン‐アフィニティ法に基づき単離したエクソソームから，磁性ビーズ法によりRNAを単離し，従来の測定法で汎用されている6つのRGの発現をRT-qPCR法により解析した．RGの発現安定性は，geNormアルゴリズムにより評価した． 6つのRG候補のうちU6 および miR-1228の発現は，カットオフ値を超える低発現を示した為，RG候補から除外した．なお両遺伝子は全血清中に強い発現が認められ，エクソソーム外の存在が示唆された．次に，4つのRG候補の発現安定性を評価したところ，Let-7aが最も高い安定性を示した．一方で，Spike-in RNAであるUniSp6の発現安定性はカットオフ値を超えたため，RG候補から除外した．従って，RG候補が半数に絞り込まれた． プレスクリーニングのプロセスは，多数のRG候補の中からexomiRとしての発現安定性に優れた少数のRG候補を絞り込むことが可能で，RGの本スクリーニングの効率化を図る上で有効であると考えられた．

心拍変動（HRV）の周波数解析は，自律神経系（ANS）の交感神経と迷走神経の活動を推定するために広く使用されている。この周波数解析では，種に適した低周波（LF）及び高周波（HF）帯域幅を使用する必要があるが，サルにおいて標準となる帯域幅が存在しないため，サルのANS活動の報告間比較を困難にする。本研究の目的は，サルの研究で使用されている2つの異なる周波数帯域幅設定を用いて，RR間隔からHRV解析を実行し，得られた結果を比較して，各設定の特性を理解することとした。アトロピン（ATR，1 mg/kg），アテノロール（ATE，1 mg/kg），クロニジン（CLO，0.1 mg/kg）又は対照として生理食塩水を4匹のテレメトリー埋込サルにラテン方格法で静注し，投与後24時間データを取得した。HRVの周波数解析は，Champerouxら（C設定，LF帯0.04-0.10Hz，HF帯0.10-0.5Hz）とShivyら（S設定，LF帯0.01-0.2Hz，HF帯0.2-0.8Hz）の設定で行った。対照群のトータルパワー（TP）及びHF値は，2つの設定でほぼ同じ値が得られたが，LF値はC設定と比べてS設定が4倍高く，それゆえLF/HF比も同様に高かった。ATRにより昇圧と著しい頻脈，CLOにより著しい徐脈と降圧，ATEにより徐脈のみが誘発され，それらの期待された変化は少なくとも投与後4時間以上持続した。いずれの設定においても，ATRはLFとHF値を有意に減少させ，LF/HF比を有意に増加させた。CLOはLFとLF/HF比を著しく減少させた。一方，ATEはいずれのパラメーターに対しても明白な影響を及ぼさなかった。2つの設定間でLF値とTPの比率は大きく異なるが，薬物による各パラメーターの変動パターンならびに統計学的検定結果はほぼ同様であることを確認した。

【背景・目的】腎障害を検出する血中バイオマーカー（BM）として、血清尿素窒素（SUN）や血清クレアチニン（SCre）が利用されている。しかし、これらは腎機能が過度に低下しないと変化せず、検出感度が低い。近年、血中のSDMAがより早期に変化するBMとして注目されており、獣医学領域ではネコの腎不全診断マーカーとして利用されている。一方、毒性学領域では腎毒性薬物に誘発された急性腎不全モデル動物でSDMAの有用性が検証されていることが多い。そこで本検討では、SDMAの更なる有用性を検証する目的で、報告のない慢性腎不全モデルを用いて検討を行った。

【方法】慢性腎不全モデルとして、ラットに0.075%又は0.25%アデニンを4週間混餌投与し、投与1週目より毎週経時的に血中腎障害BM（SDMA、SUN及びSCre）の測定及び剖検・病理組織学的検査を実施した。

【結果】0.075%群では、いずれの評価項目にも変化が認められなかった。0.25%群では、腎臓の肉眼所見として投与1及び2週目に散在性の白斑が、投与4週目では腫大と暗褐色化が認められた。病理組織学的検査では、投与1週目より尿細管の障害像が認められた。血中腎障害BMは、いずれも投与2週目より上昇した。

【考察】慢性腎不全モデルにおいて、最も早く毒性を検出できた評価項目は腎臓の肉眼所見及び病理組織所見であり、SDMAの上昇はSUN及びSCreの変化と同時期から認められた。本検討により、病理組織学的に尿細管障害像が認められるにも関わらず、測定した血中腎BMのいずれでも検出できない時期があることが明らかとなった。SDMAによる毒性検出タイミングは病理組織学的変化より1週間遅れたが、測定に必要なサンプル量は微量であり、TK測定試料の利用も可能で低侵襲的・経時的に腎障害を捉えることができるという点で有用な血中BMであると考えられる。

遺伝子治療ベクターは、機能的な目的遺伝子を標的細胞に導入するように設計されているが、生体内分布プロファイル、複製能力、および宿主ゲノムへの組み込み能などのベクターの特性に応じて、宿主ゲノムへの組み込みを引き起こす場合がある。ICH見解「生殖細胞への遺伝子治療用ベクターの意図しない組み込みのリスクに対応するための基本的な考え方」では、細胞の核に移行し、組み込み能力（組み込み機構）を持つベクターは，意図しないゲノム組み込みのリスクが高いという考え方が示されている。これまでに、ゲノム組み込みを分析するいくつかの方法（ligation-mediated PCR, linear amplification-mediated PCRなど）が開発されているが、評価に求められる検出感度や具体的な評価方法まではガイドラインに明記されていない。 本研究では、アダプターのライゲーション効率が良いことで高い検出感度が期待できる RAISING増幅とNGS 解析を用いて、レンチウイルスで GFP を導入したMIA PaCa-2 細胞株におけるゲノム挿入部位を調べた。さらに、デジタルPCRを用いたドロップオフアッセイ法によってゲノム組み込みの頻度を評価した。我々の結果は、RAISING/NGS 解析によってゲノム挿入部位を検出できること，そしてドロップオフアッセイ法によりその組み込み頻度を0.01%の高感度で検出できることを示した。これらの組み合わせた評価方法は、遺伝子治療製品の意図しないゲノム組み込みイベントを評価するための有用なツールとなり得る。

【背景】髄腔内投与は核酸薬などの投与経路として選択されることが多く、我々は臨床で使用されているスパイナル針及び髄腔内カテーテル挿入による投与を検討した。更に、髄腔内投与操作時に得られた脳脊髄液（CSF）で生化学的検査を行い、その評価を行った。【材料及び方法】年齢4～7歳齢のカニクイザル雄4頭を使用した。 スパイナル針による投与は週1回投与とし、計4回実施した。投与方法はイソフルランにより麻酔を維持し、腰椎穿刺で実施した。スパイナル針は25Gのスピノカンまたはペンカンを使用し、生理食塩液1 mLを緩徐に投与した。また、腰椎穿刺時に得られたCSFを採取し、生化学値を測定した。 髄腔内カテーテル挿入の検討は、同4頭を使用し、麻酔下で腰椎から外径3.5fr.のカテーテルを挿入した。末端にインジェクションプラグを装着し皮下に埋め込んだ。CSF採取時はこのプラグを皮膚から穿刺し、髄腔内に留置されたカテーテルよりCSFを採取した。髄腔内カテーテル埋め込み動物は術後約2週間維持した後、剖検した。【結果】髄腔内投与の成功率は、ペリカンよりスピノカンの方が高かった。一部の動物では腰椎穿刺時に脳脊髄液の逆流が認められないことがあった。髄腔内カテーテル埋め込み動物では、皮下ポート部から投与やCSF採取が可能であったが、CSF採取ができない場合もあった。 脳脊髄液の生化学検査値は、基本、既報値と同様であった。スパイナル針穿刺及び髄腔内カテーテル挿入のいずれでもCPKやASTが高値を示すことがあった。CPKの高値を示す動物は髄腔内投与に時間を要した場合が多く、脊髄や周辺組織に接触したことにより高値を示した可能性が考えられ、投与手技確認や薬物影響のマーカーとなる可能性が考えられた。 以上、今回、サルへの髄腔内投与の複数の方法を検証し、CSFの生化学検査を取り入ることで投与手技や評価の幅を広げる可能性を示した。

背景：慢性期に現れる候補化合物の心毒性を非臨床試験の段階で予測することは、臨床試験の失敗リスクを下げるために重要である。非臨床におけるIn vitroでの候補化合物の心毒性評価にはヒトiPS細胞由来心筋細胞（hiPSC-CMs）を利用できると期待されている。そこで今回、数時間の急性試験では心毒性が出ないDoxorubicin（Dox）をhiPSC-CMsに5日間暴露し、収縮性への慢性的な影響を評価した。 方法：心筋モデルは、hiPSC-CMsから作製した細胞シートをゲルに貼り付けてできる心筋シート組織を用いた。細胞は東京女子医科大学で分化誘導されたhiPSC-CMsを用いた。収縮力の測定は、ロードセルを用いて収縮力を直接かつ連続的に測定可能な日本光電製の測定システムを用いた。1Hzの電気刺激により拍動頻度を制御した心筋に対し、Doxを0.03、0.1、0.3、1 µMの濃度で暴露しながら5日間連続で収縮力を測定した。収縮性への影響を評価するため、得られた収縮波形から収縮期、弛緩期の各パラメータの変化率を解析した。 結果：Doxを暴露して24時間以降から、濃度依存的な収縮力の減少や不整脈の発生が確認された。Dox 1 µM群では、暴露開始6時間～18時間にかけて一時的に収縮力が増加し、その後は急激に減少した。また、Dox 0.1 µM群では収縮力の減少が表れていない早期の段階から、弛緩期における収縮力の変化率が上昇する様子が確認された。 結論：本研究では、Doxを5日間暴露した組織の収縮力を連続的に測定することで、収縮力が低下する前に現れる一過性の収縮力増加現象や、弛緩機能に関するパラメータ値が増加するといった複雑な応答が確認された。これらの結果は、Doxの心毒性プロセスにおいて複数の毒性メカニズムが働いていることを示唆していると考えられ、今後、臨床データと関連付けたさらなる研究が必要である。

【目的】下水処理水の安全評価を行う場合、短期的影響に加え長期的な慢性影響を配慮する必要がある。WET試験における藻類を用いた影響試験では、3日間の培養期間で増殖速度を指標とする手法が用いられるが、慢性的な影響を把握するためには、増殖速度に加え、形態や遺伝子レベルで多世代への影響を確認することが重要であると考えられる。本研究では実下水処理水を用いてムレミカヅキモを2か月間繰り返し培養し、下水処理水の慢性的な影響評価を行った。

【実験方法】試験には（国研）国環研から分譲されたムレミカヅキモ（NIES-35株）を用いた。A下水処理場から採取した終沈流出処理水を0、5、80%濃度としてMilli-Q水で希釈し、C培地を基本とした試験溶液を作製した。ムレミカヅキモを各試験溶液に添加し、25℃、1,500 Lux、100 rpm条件下で1週間培養後、各培養液を同処理水濃度の新しい試験溶液に添加し、この工程を10回繰り返した。

【結果と考察】ムレミカヅキモの比増殖速度は、処理水濃度間で差は見られなかった。一方細胞数は培養を繰り返すことにより5%処理水で増加したが、80%処理水で大きな変動は見られなかった。細胞の大きさは、5％処理水で繰り返し培養しても0％処理水と比べてほとんど変わらなかったが、80%処理水では培養回数6回目から細胞が肥大し、培養8回目では細胞面積が2.1倍を示した。AFLP法では、0％処理水は継代回数に関わらず同一クラスターに分類されたが、80%処理水では、独立したクラスターに分類され、継代により遺伝子変異の可能性が推察された。金属分析の結果、使用した処理水には他の金属に比べてZnが高く検出された（平均47.7 mg/L）。既存の報告から、処理水中に含まれるZn が要因の一つである可能性が示唆された。＊本研究は公益財団法人クリタ水・環境科学振興財団の助成を受けて行った。

　ヒト骨髄細胞の顆粒球系と赤芽球系の分化・成熟過程における主要な鑑別点の標準化を目的として、2021年6月に血球形態標準化ワーキンググループ（日本検査血液学会、日本臨床衛生検査技師会）から形態的特徴に基づいた分類基準が発表された。一方、非臨床試験では、げっ歯類や大動物など多様な実験動物が使用されており、骨髄細胞の分化・成熟過程における形態的特徴も動物種によって異なると考えられる。しかし、動物種ごとの骨髄細胞の分類において、主要な鑑別点が存在しないため、各施設や観察者の経験に依るところが多く、施設間差の原因となり、さらに技術習得も時間を要する。

　そこで、本研究ではヒト骨髄細胞の分類基準をサルやミニブタに適用できるかを検討した。また、各動物種の骨髄細胞の顆粒球系と赤芽球系について、ヒトとの相違点を確認した。

　サル及びミニブタからウェッジ法で作製した骨髄塗抹標本を観察し、上記のヒトの顆粒球系及び赤芽球系細胞の分類基準と比較した。ヒト顆粒球系細胞の分類基準では、骨髄球の主要な鑑別点として類円形の核、また後骨髄球として核の陥凹を挙げているが、サルでは大型の前骨髄球や比較的幼若な骨髄球でも核の陥凹が認められたため、この基準を適用するのは困難であると思われた。よって、後骨髄球は、骨髄球より陥凹が進んだ、馬蹄形の核と細胞質の色調から判断するのが適切と思われる。その他のサル骨髄芽球のType 1と2の分類については、ヒトの基準を適用できると考えられた。一方、ミニブタの顆粒球系の成熟過程における核の形態的特徴では、サルの前骨髄球や骨髄球のような陥凹は見られなかったことから、ヒトに類似していた。

　赤芽球系の分類における鑑別点については、ヒトとの差は見られなかったことから、ヒトの基準でサル、ミニブタに適用できると考えられた。

【目的】気管内投与は，経気道投与による各種物質の毒性評価における有用な投与手法であると考えられる．しかし，気管内投与による反復投与毒性試験に関する報告は少ないことから，本研究では，背景データの取得を目的として，2種類の吸入麻酔下で2種類の媒体を反復気管内投与し，各種データを取得した．

【方法】1群6匹の雄性SD系ラットを用い，セボフルランによる吸入麻酔後，注射用水（DW）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を気管内投与する群に加え，気管内投与を行わない群を設けた．また，イソフルランについても同様の3群を設けた．さらに，吸入麻酔および気管内投与を実施しない無処置群を設けた．投与は，1日1回，週5日，4週間，吸入麻酔後にPBSまたはDWを気管内に滴下した．投与期間終了後，血液学的検査，血液生化学的検査，気管支肺胞洗浄液（BALF）の生化学的検査および細胞カウント，器官重量測定および肺の病理組織学的検査を実施した．

【結果】血液学的検査，血液生化学的検査，BALFの生化学的検査および器官重量では，明らかな変化は認められなかった．BALFの検査では，セボフルラン麻酔下の投与群において総細胞数が増加する傾向が認められた．病理組織学的検査の結果，セボフルランまたはイソフルランの麻酔により，肺の血管および気管支周囲への好酸球浸潤が認められ，この変化は，DWまたはPBSの気管内投与により増強した．DW投与群において組織変化の程度が最も強く，肺胞の炎症巣も認められた．また，各麻酔下のDW投与群各2例が投与直後に死亡した．

【結論】ラットを用いた気管内投与による反復投与毒性試験に対し，本研究において得られた結果は有用な背景データを提供するものと結論した．

【緒言】臨床試験における被験者のリスクマネジメントは、非臨床毒性試験成績が重要な役割を果たしている。したがって、非臨床毒性試験の結果および考察が直接被験者リスクにつながっている。非臨床毒性試験による臨床副作用の予測性を検証し、毒性試験による予測性を向上させることは、被験者リスクの最小化のために極めて重要な課題である。本発表では、2022年に承認された新規低分子抗がん剤（ダリナパルシン、バレメトスタット、ピミテスピブ）を調査対象として、臨床副作用に対する非臨床毒性試験の予測性に関する調査を行ったので、その結果を報告する。

【方法】低分子抗がん剤（ダリナパルシン（Dar）、バレメトスタット（Val）、ピミテスピブ（Pim））の申請資料概要を用いて、被験薬に起因する有害事象（以下、副作用）を抽出し、同様の所見が非臨床毒性試験で認められているかを調査した。調査対象のDar、Val、Pimは、2022年承認の新薬のうち、低分子抗がん剤であった3剤すべてを選択した。

【結果及び考察】今回調査した3剤ともに、臨床試験で多くの副作用が認められた。副作用のうち消化器症状は、3剤ともに毒性試験で同様の所見が認められ、予測性が高かった。薬剤の薬理作用に起因すると考えられる血球減少は、Val及びPimで予測できていた。Darはヒ素関連化合物でみられる行動異常が毒性試験でも認められ、行動の副作用を予測することができていた。一方、重篤な副作用であるDarによる血球減少、Pimによる眼の異常については、毒性試験で同様な所見を捉えることができず、毒性試験による予測性の重要な課題と考えられた。今後さらに解析を進めて、詳細な報告を行う予定である。