日本毒性学会学術年会
第39回日本毒性学会学術年会
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学会賞
  • 眞鍋 淳
    セッションID: GA
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    医薬品の安全性評価に対するアプローチはその時代の科学的知見の発展と共に変遷すべきものであり、先端的な知見と技術を常に取り入れながら安全性評価を実施していく事は製薬企業の社会的な責務である。演者は1978年に三共株式会社(現第一三共株式会社)に入社後、海外留学のテーマであった肝小葉のheterogeneityの研究の延長として肝臓免疫染色によるP450アイソフォーム局在解析を毒性研究に導入し、P450アイソフォームタンパク質量および酵素活性情報を統合的に病理形態学的解析に組み入れる事によって、肝臓の毒性発現機序解明の基盤を築き進展させた。演者にとって、これは分子毒性学の医薬品安全性評価への活用の端緒となる経験の第一歩であった。
     弊社安全性研究所では歴史的に多種多様な疾患モデル動物を維持・管理してきたが、さらに遺伝子改変動物作製技術が飛躍的に発展した90年代後半からは、トランスジェニック動物およびノックアウトマウスの作製と毒性研究への活用を積極的に推進した。2002年のオルメサルタン承認申請では、ラット24ヵ月がん原性評価に加え、p53がん抑制遺伝子へテロ欠損マウスおよびヒトプロト型 c-Ha-ras遺伝子導入マウスを用いた26週間がん原性代替試験のデータを取得してがん原性に関する科学的評価をサポートした。これはがん原性代替試験を承認申請に適用したおそらく日本で初めての事例である。一方、1997年にトログリタゾン肝障害に関する緊急安全性情報が出された際には、患者の特異体質要因(病態、薬物代謝異常、抗酸化ストレス機能低下等)に着目し、糖尿病モデル動物やUGT酵素欠損ラット、およびSod2+/-マウスなどで肝障害の再現性を評価したほか、臨床Pharmacogenomics解析結果からトログリタゾン肝障害との関連 が疑われたGST T1/M1遺伝子のノックアウトマウスやグルタチオン枯渇モデル動物作製を通じて機序解明試験を実施した。さらには低GST活性イヌに関する研究や、反応性代謝物生成リスクの高い物質をスクリーンアウトするための肝細胞傷害性評価系構築などを推進したほか、FDAによるPPARアゴニストに関するヒトでの安全性懸念に対処するため、ILSI/HESIに設立されたPPARアゴニストのがん原性機序解明プロジェクトに参加してトログリタゾンに関する情報を提供し、状況把握および研究進展に寄与した。
     2000年からは網羅的遺伝子発現解析の非臨床安全性評価への活用(トキシコゲノミクス:TGx)に着手し、ラット肝臓における核内受容体刺激と網羅的P450遺伝子発現レベル解析、肝細胞障害の機序解析などを通じて、当時国内では黎明期にあったTGx解析技術に関する実用的な知見を日本毒性学会学術年会および学術論文において開示すると共に、グルタチオン枯渇型肝障害等の各種毒性関連パスウェイへの影響評価を可能とする遺伝子セット(TGxバイオマーカー)の同定の他、網羅的毒性関連パスウェイ活性化評価や遺伝子セットレベルのネットワーク解析手法などのバイオインフォマティクス活用を進め、現在ではTGxを薬剤性肝障害リスク評価の一項目として定着させている。また必要に応じてプロテオミクス/メタボロミクスデータを統合したシステム毒性学的解析を取り入れた研究も検討してきた。
     以上のように、分子毒性学、病態/遺伝子改変動物モデル、オミクス技術の活用を継続的に進めながら、医薬品の安全性評価に活用可能な科学的情報の質と量を高める努力を続けてきた。結果的に、毒性研究の科学的レベル向上にいくばくかの貢献が出来てきたならば、演者にとっては望外の喜びである。
奨励賞
  • 木村 朋紀
    セッションID: SA1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    カドミウム、水銀および6価クロム等の重金属は、生体に対して種々の毒性を示すことが知られている。その毒性発現機構に関しては、特殊な環境下の労働者において中毒症状が認められただけでなく、これら重金属による環境汚染が世界中の様々な地域に存在し、一般地域住民にも種々健康被害を引き起こしてきたことから、長年にわたって解析されてきた。特にわが国においては、水俣病やイタイイタイ病患者が深刻な健康被害を被ったという苦い経験から、重金属毒性に関する研究は活発に行われている。6価クロムに関しては、その強力な酸化作用から工業的に広く使用されてきた重金属であるが、毒性の強い重金属であり、発がん性を有していることが知られている。また、種々の遺伝子発現を修飾することも報告されている。しかしながら、6価クロムの分子レベルでの毒性発現機構については研究が進んでいないのが現状である。そこで我々は、6価クロムが転写レベルに影響を与える遺伝子のうち、発がんに対して抑制的な作用を有することが示されているメタロチオネイン(MT)遺伝子について、6価クロムによる発がんの一部がMT遺伝子の発現の抑制によるものであると考え、6価クロムの毒性発現へのMT発現抑制の関与とそのMT発現抑制機序について検討を行った。
     MTの転写は重金属応答性転写因子MTF-1に依存しており、我々は、免疫沈降法により亜鉛やカドミウムによるMT誘導時にはMTF-1と転写共役因子p300とが複合体を形成することを明らかにしてきた。また、p300との複合体形成に必須の領域を欠失したMTF-1を用いた解析とp300のノックダウンがMT誘導に与える影響の観察から、p300がMT誘導に必須の因子であることを示してきた。なお、p300は遺伝子プロモーター領域に存在するヒストンをアセチル化し、さらに、転写因子とRNAポリメラーゼIIを含む転写装置複合体との結合を仲介することで遺伝子発現を正に制御することが知られている。これら結果をもとに、MTF-1と6価クロムとの接点に焦点を絞り解析を行った。その結果、6価クロムはin vitroにおいてはp300のヒストンアセチル化活性を阻害しなかったが、p300の強制発現により6価クロムによるMT誘導阻害作用は減弱した。また、MTF-1によるMT遺伝子発現に伴ってMT遺伝子プロモーターの構造は劇的に変化するが、我々は、6価クロムはこの変化を阻害することを明らかにした。これらのことより、6価クロムは、MTF-1-p300複合体形成を阻害することで転写活性化にかかわる種々因子がMTプロモーターにリクルートされるステップを阻害し、その結果としてプロモーター構造変化を阻害し、さらにはMT誘導を抑制していると考えられる。また我々は、6価クロムによる発がんとMT発現抑制との関連性について検討を行った。哺乳動物細胞において、6価クロムによるがん化を軟寒天中でのコロニー形成能で評価したところ、低亜鉛含有培地で前培養することでMT発現を低下した細胞において、6価クロムによるコロニー形成数が増加することを見いだした。この結果は、6価クロムによるMTF-1阻害が、6価クロムによる発がんを増悪する可能性を示している。
     以上我々は、6価クロムによるMT発現抑制機序について、その詳細を明らかにした。さらに、6価クロムによるMT発現抑制が6価クロムによる発がんを増悪する可能性を示した。6価クロムは強力な酸化剤であり、その酸化作用およびDNA損傷作用を中心にその毒性発現機構が解析されてきた。本研究は、6価クロム毒性について、新たな作用機序の存在を示すものである。
  • 新開 泰弘
    セッションID: SA2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    ヒ素やカドミウム、鉛などに代表される有害金属は環境中にユビキタスに存在し、水や食品を介して生体に侵入することでヒトの健康を障害するリスクが懸念されている。一方、生体はそのような有害金属から身を守る感知・応答の適応システムを有していることが考えられるが、その分子機構はほとんど明らかにされていなかった。我々は有害金属の毒性に対する細胞応答の防御機構を明らかにするために、これらの毒性発現の標的となる肝細胞や血管内皮細胞を用いて検討を行い、以下のことを明らかにした。

    1. Keap1/Nrf2系の役割
     マウス初代肝細胞に無機ヒ素を曝露すると、転写因子Nrf2が活性化され、下流のγ-グルタミルシステインリガーゼやグルタチオン転移酵素、多剤耐性関連タンパク質などのヒ素の細胞外解毒排泄に関わる酵素群の発現が誘導された。これらの酵素群の発現誘導はNrf2の欠損により消失し、同条件下でヒ素の感受性は増加した。一方、Keap1の欠損による恒常的なNrf2の活性化により、ヒ素の感受性は低下したことから、Keap1/Nrf2系がヒ素に対する防御応答システムとして重要な役割を果たしていることを明らかにした。同様に、ウシ大動脈血管内皮細胞(BAEC)においても、Keap1/Nrf2系がカドミウムの毒性に対する防御応答システムとして機能していることを見出した。

    2. 小胞体ストレス応答系の役割
     鉛は細胞内のカルシウムの恒常性を攪乱することから、小胞体ストレスを惹起することが示唆されているが、それに対する防御応答機構は未解明であった。BAECに鉛を曝露すると、Unfolded protein response (UPR) 経路の1つであるIRE1およびJNKのリン酸化レベルが上昇した。同条件下において、小胞体シャペロンであるGlucose-regulated protein 78(GRP78)およびGRP94の顕著な発現誘導が観察された。そこでJNKの阻害剤SP600125またはAP-1の阻害剤クルクミンを前処理したところ、鉛によるGRP78およびGRP94の発現誘導はいずれも抑制された。更に、GRP78をRNA干渉にてノックダウンしたところ、鉛による細胞毒性が増強された。これらの結果より、鉛は血管内皮細胞において小胞体ストレスを惹起する一方で、細胞は鉛に対してIRE1/JNK/AP-1経路を活性化させてGRP78およびGRP94などの小胞体シャペロンを誘導し、当該金属の毒性に対して防御・応答することを明らかにした。

     以上のように、我々は有害金属に対する細胞応答メカニズムの一端を解明した。これらの知見は、有害金属のリスクを軽減するための効果的な生体防御戦略の構築に繋がることが期待される。
年会長招待講演
  • 遠山 千春
    セッションID: IL
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    身の回りの化学物質への曝露が引き起こす毒性の発現メカニズムはほとんど解明されていない。その中で、ダイオキシンは毒性発現に必須の受容体AhRが見出されている数少ない化学物質である。その毒性は、がん・生殖発生異常・免疫機能異常・高次脳機能異常など多岐にわたる。しかし、この多様な毒性現象にAhRが如何に関わっているかは、ほとんど解明されていない。そこで、ダイオキシンによる水腎症に着目して研究を行ってきた。水腎症とは腎盂・実質の拡張ならびに腎実質の破壊を伴う疾患であり、ヒトでも先天的・後天的に発症する。ほとんどの水腎症は尿管閉塞が原因であるとみなされていた。しかし、我々の研究の結果、ダイオキシンによるマウス新生仔の水腎症では尿管閉塞を伴わないこと、また、PGE2合成に関わる誘導型律速酵素COX-2活性を薬理学的に阻害することで発症が抑制されることが明らかになった。さらに、細胞質型フォスフォリパーゼA2a (cPLA2a)ならびに誘導型PGE2合成酵素mPGES-1がダイオキシンによる水腎症に必須であることを、遺伝子欠損マウスを用いて明らかにした。これらから、ダイオキシンによる水腎症発症には、尿管閉塞でなく、PGE2合成経路をダイオキシンが撹乱することで生じる腎機能異常が関与していることが明らかになった。また、cPLA2a欠損マウスを用いた実験により、アラキドン酸カスケードが水腎症発症のメカニズムに重要な役割を果たしていることが判明した。さらに、PGE2合成系の亢進、Na+、 K+ トランスポーターや水チャネルの減少、そして尿量増加を見出した。この尿量増加を、抗利尿ホルモン投与により抑制すると水腎症が生じないことが判明し、ダイオキシンによる尿量増加が水腎症発症の原因であることが明らかになった。今後、このダイオキシン曝露マウスのモデルによる検討を進めることで、Bartter症候群やその他の水腎症の病態の解明にも有用な知見が得られると思われる。
特別講演
  • Daniel ACOSTA, Jr.
    セッションID: SL1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    The future of toxicology will depend on how well cutting-edge technology is transferred and integrated to solve problems in toxicology. Toxicity testing is poised to take advantage of the revolutions in biology and biotechnology. In 2007, the National Research Council of the US National Academies published a report, entitled Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy, which advocates the use of these new technologies to transform toxicity testing from a system based on whole-animal testing to one founded mainly on in vitro methods that evaluate changes in biologic processes using cells, cell lines, or cellular components, preferably of human origin. This report concluded that a transformative paradigm shift was needed to confront the many issues faced in the toxicity testing of environmental chemicals, drugs, and cosmetics to which humans are exposed. Toxicity testing, as envisioned by this NAS report, involved the interplay of toxicity pathways, targeted testing, chemical characterization, dose-response and extrapolation modeling, population and exposure data, and risk assessment. This lecture will present key elements of this report, along with selected examples of studies and discussions in the scientific literature, which evaluate new approaches in toxicity testing.
  • Young-Joon SURH
    セッションID: SL2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    Living organisms are constantly subjected to diverse types of stress both external and internal sources. While excessive stress leads to necrotic or apoptotic death, moderate amounts of noxious stimuli may render the cells adaptive or tolerant to ongoing or subsequent insults. Such adaptive survival response normally accompanies de novo synthesis of proteins through activation of distinct stress-responsive signaling. One of the key signaling molecules involved in cellular adaptation or tolerance to a wide array of noxious stmuli is nuclear transcription factor erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2 (Nrf2). Our previous studies have revealed that Nrf2 plays a pivotal role in cellular stress response. Nrf2 is sequestered in the cytoplasm as an inactive complex with the inhibitory protein Keap1. Upon activation, Nrf2 binds to antioxidant responsive element (ARE) or electrophile responsive element (EpRE), leading to the coordinated up-regulation of down-stream target genes that boost cellular antioxidant/cytoprotective potential. Many chemopreventive natural products can induce ARE/EpRE-driven upregulation of antioxidant/phase-2 detoxifying enzymes or other cytoprotective proteins, thereby fortifying cellular defence against oxidative, nitrosative and inflammatory insults. Cysteine thiols present in Keap1 functions as a redox sensor in transcriptional regulation of a distinct set of stress responsive/cytoprotective proteins. Some chemopreventive/chemoprotective natural products can induce ARE/EpRE-driven upregulation of cytoprotective gene expression, thereby fortifying cellular defence against oxidative, nitrosative and inflammatory insults. Supported by the Global Core Research Center (GCRC) grant, National Research Foundation-MEST, Republic of Korea.
  • Masayuki YAMAMOTO, Keiko TAGUCHI, Takafumi SUZUKI, Hozumi MOTOHASHI
    セッションID: SL3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    Our bodies must counteract insults originating from the environment. Toxic chemicals (electrophiles) and reactive oxygen species (ROS) activate expression of detoxifying and antioxidant genes through antioxidant responsive element (ARE). Transcription factor Nrf2 is essential for the coordinated induction of cellular defense enzymes through ARE. This notion is best demonstrated in animal models, showing that Nrf2-null mice are sensitive to a wide variety of electrophiles and ROS. Keap1 is identified as a negative regulator of Nrf2. Electrophiles liberate Nrf2 from the repression by Keap1 and provoke nuclear accumulation of Nrf2. Keap1 possesses multiple reactive cysteine residues that covalently bound with electrophiles, indicating that Keap1 acts as a sensor for xenobiotic stresses and we refer this system to as the Cysteine Code. Mouse and zebrafish models demonstrate that multiple sensor functions reside within Keap1. The hinge and latch model proposed for the Keap1-Nrf2 system describes the regulation of nuclear accumulation of Nrf2 by a Cul3- Keap1 E3 ubiquitin ligase-dependent mechanism. We have verified this model through structure biology, mouse/zebrafish genetics and human cancer analyses. In human cancers, missense mutations have been identified in KEAP1 and NRF2 genes. These mutations disrupt the KEAP1-NRF2 complex and result in constitutive activation of NRF2. Elevated expression of NRF2 target genes confers advantages on cancer cells. Transgenic mouse models provide evidence that mutated form of Keap1 analogous to cancer genotypes lose the ability to repress Nrf2 in vivo. Thus, the Keap1-Nrf2 system opens a new avenue to the understanding of the signal transduction and regulatory processes underlying the stress response and cancer progression.
  • Frederick Peter GUENGERICH
    セッションID: SL4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    The discovery of cytochrome P450 (P450) was reported in 1962 by R. Sato and T. Omura (J. Biol. Chem. 237, 1375-1376). Since then, this enzyme system has come to be recognized as having a critical role in toxicology. P450s are involved in ~ 3/4 of human enzymatic transformations of drugs and ~ 2/3 of the bioactivation of carcinogens. Bioactivation, induction, and inhibition are important aspects of P450 in toxicology, especially with drugs and drug candidates. Notable examples of P450 involvement in drug toxicity include terfenadine and acetaminophen. The toxicity of the notorious teratogen thalidomide has been revisited in the context of P450 bioactivation. Knowledge of human P450 enzymes has figured prominently in current efforts in molecular epidemiology, pharmacogenomics, chemoprevention, and risk assessment. Current issues related to P450 are predictions of drug toxicity based upon in silico modeling and the role of covalent protein binding. A general need exists to produce more innovative methods of screening for drug toxicity, with the hope of replicating the success seen in predicting metabolism and pharmacokinetics to the areas of pre-clinical toxicity and especially adverse events in humans. In summary, the understanding of P450s has been a remarkable success story in understanding the metabolism and its consequences with drugs, steroids, and carcinogens.
教育講演
  • 横井 毅
    セッションID: EL1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    マイクロRNA(microRNA, miRNA)は、タンパク質をコードしない22塩基程度の一本鎖RNAで、標的となるmRNAの主に3’非翻訳領域に部分相補的に結合し、分解または翻訳を抑制することにより、タンパク質の発現を負に制御する。 miRNAは発生、分化、増殖、免疫、アポトーシス、ホメオスタシスなど全ての生命現象に関わっている。現在までにヒトでは約1500種類のmiRNAが同定され、その塩基配列には比較的種差が少ないことが特徴である。ヒト遺伝子産物の30 - 60%がmiRNAによる直接的な制御を受け、二次的な影響を含めるとほとんどの遺伝子産物がなんらかの調節を受けている。現在では100種類以上の疾患について、診断バイオマーカーになる可能性が報告されている。薬物動態関連において、in silico解析では、全てのP450がmiRNAによる調節を受けるとされており、実際に我々の研究グループでは、CYP1B1, CYP2E1, CYP24などに対する直接的な調節を見いだし、さらに関連する転写因子であるPXR, CAR, VDR, ARNTなどがmiRNAの影響を受け、さらに下流のtargetの発現調節に影響を及ぼすことを明らかにしている。
     トキシコゲノミクス研究と同様な考えに基づいて、miRNAの網羅的発現解析がmiRNAアレイの機器を活用して行われている。アセトアミノフェンや四塩化炭素、さらにTCDDやB[a]Pについての研究が目立っている。また、免疫学的因子が関与する炎症やエピジェネティックが関与する毒性発現機構を解明する研究も行われている。しかし、1つのmiRNAは多くのtargetに作用し、1つのtargetは多くのmiRNAに制御される可能性があるために、データの評価手法が重要である。
     2008年にmiRNAが血清中に安定的に存在することが報告されて以来、特に癌の研究分野において、非侵襲的な新規バイマーカーとして急速に研究が進展しつつある。尿、唾液、汗など全ての体液が検討対象とされる。我々の研究グループでは、ラットに急性や慢性の様々な肝障害モデルを作製し、病型診断バイオマーカーとしての評価研究を行っている。
     講演では毒性バイオマーカーとしてのmiRNAの研究の現況を幅広く紹介する。
  • 吉田 パスカル
    セッションID: EL2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    非臨床試験から臨床試験への外挿は永遠の課題である。だからこそ、毎年あちこちで外挿性の検討が行われている。しかし、市販後安全性から毒性試験・臨床試験を振り返った検討はあまりみられない。
     臨床試験と市販後の間にも壁が存在する。医薬品の安全性情報を提供する添付文書は臨床試験の成績等から作成するが、実際には開発時の非臨床・臨床試験では見られなかったような副作用が数多く市販後に発現する。
     昔からある副作用の分類でType AとType Bというものがあり、Type Aは医薬品の薬理作用から予測可能で、開発時から認められることが多い。副作用の全体の8割を占めると言われているが、一般に致死性は低い。これに対してType Bは薬理作用からの推測がむずかしく、致死性も高いと言われている。Type Bの副作用をいかに予測し、対応するかが医薬品のライフサイクルマネジメントのためにも重要な課題となっている。
     様々な動物種を用い、毒性所見、薬理作用から薬物動態まで多大なリソースを注ぎ込んで行う非臨床試験。これらを市販後安全性評価における考察に活用できないだろうか。今回、患者背景も治療状況はおろか、副作用の用語はもとより定義等も臨床試験とは異なる市販後安全性評価の現状を共有したい。申請をして承認を取ったら終わりではなく、製品が市場にある限り続く市販後安全性評価に対して、非臨床試験担当者としてどのような寄与が可能なのか。今回の講演が考える糸口となることを期待する。
     非臨床開発部門が市販後安全性確保の統括部門としても活動している弊社での事例についても紹介したい。
  • Christopher Si-Lung LAU
    セッションID: EL3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    The perfluoroalkyl acids (PFAAs) are a family of organic chemicals consisting of a perfluorinated carbon backbone (4-14 carbons in length) and an anionic head group (sulfonate, carboxylate or phosphonate). These compounds have excellent surface-tension reducing properties and have numerous industrial and consumer applications. However, they are chemically stable, persistent in the environment, ubiquitously distributed, and present in humans and wildlife. Two issues must be considered regarding PFAA toxicology: pharmacokinetics and potency of the chemicals. The rates of PFAA clearance and their body burden accumulation are dependent on carbon-chain length and animal species. In general, the serum half-life of PFAAs increases with chain length in both rodents and humans, but the estimates in humans are markedly higher than those in laboratory animals. Recent studies with laboratory animal models have indicated a number of toxic effects of PFAAs, including tumor induction, hepatotoxicity, developmental toxicity, immunotoxicity, neurotoxicity and endocrine disruption. The modes of PFAA actions are not well understood, but are thought to involve, in part, activation of nuclear receptor signals (such as peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα). Based on PPARα activation, potency of PFAAs increases with carbon-chain length, carboxylates are stronger than sulfonates, and mouse receptor is more reactive than human receptor. Adverse effects of perfluorophosphonates in mice resemble those described for sulfonates and carboxylates, although potency of this congener appears to be weaker than the other two counterparts. This abstract does not necessarily reflect US EPA policy.
  • Kyung-Min LIM, Seung-Min CHUNG, Ok-Nam BAE, Ji-Yoon NOH, Jin-Ho CHUNG
    セッションID: EL4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    Thrombosis continues to represent a major cause of death in spite of the advanced medicine and pharmacotherapy of the modern era. Excessive thrombosis can cause life-threatening thrombotic events including deep vein thrombosis, stroke, myocardial infarction and pulmonary embolism. What is worse, it can lead to the exacerbation of the existing cardiovascular diseases through the degranulation of secondary vaso-active mediators and the stimulation of vascular remodeling.
    Recently, we and several research groups have discovered that xenobiotics can manifest prothrombotic effects and efforts are being directed into the elucidation of the underlying mechanisms. Especially, prothrombotic effects of heavy metals and ROS-generating chemicals, nanomaterials and neurotoxicants are being extensively investigated in an effort to clarify the link between pro-thrombosis and their well-established cardiovascular toxicities. Platelets had been the main tissue of interest due to their major roles in thrombosis through forming platelet aggregates. However, the focus is being migrated into the involvement of erythrocytes and coagulation systems and their interaction with platelets and other cardiovascular tissues.
    Exemplifying this, arsenicals which can induce platelet aggregation and thrombosis, also induces procoagulant activation in platelets, a series of events that culminate in phosphatidylserine exposure on outer membrane, the enhancement of thrombin generation and ultimately increased clot formation. It has been demonstrated that erythrocytes can also participate in the xenobiotic-induced thrombogenic activation through exhibiting phosphatidylserine exposure and resultant procoagulant activity. Interestingly, phosphatidylserine exposure is a key marker of apoptotic cells and it can increase cell-cell interaction and initiate phagocytosis by tissue macrophages, reflecting that the procoagulant activity induced by xenobiotic might be further related into other biological events like apoptosis and anemia.
    These studies indicate the urgent need to expand our current understanding of prothrombotic risks of xenobiotics as a narrow scoped platelet aggregation into a general alteration of cardiovascular tissues as a system. In this context, a timely and comprehensive review on this subject will be informative and inspiring to the participants of the 6th Congress of Asian Society of Toxicology.
  • Eslie DENNIS
    セッションID: EL5
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    The ability of biomarkers to improve treatment and reduce healthcare costs is potentially greater than in any other area of current medical research. However, understanding the characteristics of novel biomarkers and developing the robust evidentiary packages to support incorporating them into drug development and clinical practice is an enormous undertaking requiring significant resources and commitment from a wide range of stakeholders, including regulatory, industry and academic scientists. The Predictive Safety Testing Consortium is a unique public-private partnership formed by the Critical Path Institute to identify new and improved safety testing methods and submit them for formal regulatory qualification by the Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMA) and the Japanese Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). Nephrotoxicity is a serious problem for drug development and the sensitivity and specificity of accessible biomarkers of nephrotoxicity in current use (particularly BUN and serum creatinine) does not allow early detection of drug-induced kidney toxicity. This results in significant risk to patients and the termination of drug development for potentially innovative compounds for unmet medical needs because of the inability to monitor for early toxicity. In 2008, the PSTC obtained the first qualification of seven urinary renal preclinical safety biomarkers for use in rodent studies, and on a case-by case basis for the inclusion into clinical development. These included KIM-1, clusterin, TFF-3, albumin,β2-microglobulin, total protein and Cystatin C. The PSTC has continued to expand this qualification by increasing the number of biomarkers, assessing prodromal and reversibility characteristics and regional specificity for these biomarkers. In addition, these biomarkers are being examined in canine and primate models. Furthermore, the PSTC is collaborating with the FNIH Biomarkers Consortium on a large clinical program to define thresholds and characterize the performance of these new biomarkers in humans in order to enhance decision making in drug development, particularly for drug candidates that exhibit nephrotoxicity. This session will focus on the success of the preclinical renal safety biomarker qualification, the impact this qualification is making on drug development and the translational activities for the progressive qualification of novel renal safety biomarkers which are needed today.
シンポジウム
シンポジウム1
エピジェネティクスから捉えた毒作用発現
  • 五十嵐 勝秀
    セッションID: S1-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
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    化学物質の生体影響が、暴露後に時間を経て顕在化する現象を説明しうる仕組みとして、エピジェネティクスが注目されている。エピジェネティクスは、ゲノムDNAがヒストンに巻き付いて出来るヌクレオソームへの後天的な修飾による転写制御機構であるが、修飾の実体、修飾を制御するタンパク質、修飾を読み取り転写制御を実行するタンパク質など、基本機構が日々解明され続けている。更に、塩基配列レベルの解像度でゲノム全体のエピゲノム状態を解析する技術も利用可能になり、基礎研究の著しい進展を後押ししている。
     JSOT2011のシンポジウム1において、化学物質がエピジェネティクス制御に関わり生体影響を及ぼす現象を「エピジェネティック毒性」と定義し、今後の毒性研究における重要性を強調した。本シンポジウムでは、まず基礎研究の進展について、中島欽一先生、五十嵐和彦先生、滝沢琢己先生から各先生が繰り広げられている先進研究を紹介して頂き、エピジェネティック毒性の背景となるエピジェネティクス制御の理解を進める。次に、今井祐記先生、伏木信次先生から疾患や化学物質影響におけるエピジェネティック制御メカニズム研究について紹介を受け、エピジェネティック毒性研究の今後の進展について議論したい。本シンポジウムが契機となって、日本におけるエピジェネティック毒性研究が更なる発展を遂げることを期待する。
  • 武藤 哲司, 佐野坂 司, 伊藤 慧, 中島 欽一
    セッションID: S1-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    神経幹細胞は、ニューロン及びグリア細胞(アストロサイト及びオリゴデンドロサイト)への多分化能をもった細胞と定義されるが、始めから多分化能を持っている訳ではない。胎性中期にまずニューロンへの、その後胎生後期にグリア細胞への分化能を獲得して、最終的に多分化能を持った神経幹細胞として成熟する。我々は以前に、神経幹細胞のアストロサイト分化能獲得には、先に分化・産生されたニューロンが残存神経幹細胞のNotchシグナルを活性化し、それによって誘導されるアストロサイト特異的遺伝子の脱メチル化が重要であることを明らかにした。ところで、脳を含めた胎仔組織は低酸素状態に維持されていることが分かっている。今回我々は、低酸素状態が神経幹細胞のアストロサイト分化能獲得に重要であることを明らかにしたので報告したい。胎生中期神経幹細胞は通常培養条件下ではアストロサイト分化誘導サイトカインで刺激されても、アストロサイトへは分化しない。しかし低酸素条件下で培養した場合、早期なアストロサイト分化が観察された。この際、hypoxia inducible factor 1a(HIF1a)の安定性が増加し、Notch細胞内領域と複合体を形成することで、アストロサイト特異的遺伝子の脱メチル化に重要なNotchシグナルを増強させていることが分かった。また、妊娠マウスを高酸素条件下で飼育し胎仔脳内の酸素濃度を上昇させると、アストロサイト分化が遅延することも明らかになった。これらの結果は、未熟児などが呼吸補助のために高酸素チャンバーで保育されることと考え合わせると、酸素濃度変化によりニューロン・アストロサイト分化バランスが崩れ、成長後に精神神経疾患などを誘発する可能性を示唆しており、さらなる検討が必要であると思われる。
  • 五十嵐 和彦, 解良 洋平, 加藤 恭丈
    セッションID: S1-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    DNAやヒストンなどのメチル化反応は、他の多くの生体内メチル化反応と同様にS-adenosyl-L-methoinine (SAM)をメチル基供与体とする。SAMはメチオニンとATPを基質としてmethionine adenosyltransferase (MAT) により合成される。我々は、様々なストレスに応答して誘導されるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の転写制御機構から、MATのアイソザイムMATIIが転写因子MafKによりHO-1遺伝子制御領域へ動員され、周辺ヒストンのメチル化を促進することを見いだした。また、MATIIはprostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs2/Cox2)遺伝子の抑制に関わることも見いだした。Cox2もHO-1と同様に様々なストレスや炎症によって強く誘導される。このことから、局所的MATII動員は、ストレス応答におけるエピゲノム制御の基本原理の一つと予想される。興味深いことに、HO-1遺伝子の抑制はMATIIの酵素活性に依存し、また、MATII複合体にはヒストンメチル基転移酵素活性が含まれている。すなわち、クロマチン局所でSAM合成とヒストンメチル化反応が複合体形成により共役することが予想される。これにより、エネルギー的に効率の良いエピゲノムのメチル化が可能となるであろう。また、MATIIの核局在やクロマチン結合は核内SAM濃度を低く抑えることを可能とする。SAMは変異原性を有することから、生体はその毒性を回避する仕組みとしてこのような系を進化させてきた可能性もある。
  • 伊藤 賢治, 魚崎 祐一, 野口 東美, 滝沢 琢己
    セッションID: S1-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    細胞核の主要な構築物は核内にランダムに配置されているわけではなく、組織、遺伝子により異なっているなど、ある一定の規則性が認められることが指摘されてきた。特に近年、新しい解析技術が開発されたことにより、細胞核内におけるクロマチン配置に関する詳細かつグローバルな知見が、急速に蓄積されつつあり、エピジェネティクスに加えて遺伝情報制御の新たな機構として注目されている。我々は、これまで神経細胞の分化、成熟の過程および成熟ニューロンでの機能発現時における細胞核構造を解析してきた。遺伝子座の核内配置については、隣接する遺伝子座をクロスリンクした後マイクロアレイで探索するCircular chromosome conformation capture (4C)法や、新生RNAに対するfluorescence in situ hybridization (FISH)や遺伝子座に対するDNA FISH法を用いて、異なる遺伝子座同士の会合や核膜への局在などの観点から解析している。一方、クロマチンの核内配置に加えて、これを構成する因子の動的な振る舞いの変動もクロマチンの機能発現に重要であることが指摘されている。これに関しても我々は、fluorescence recovery after photobleach (FRAP)法や、塩抽出法にて、神経細胞におけるヒストンやクロマチン関連タンパク質の動態解析も試みている。本シンポジウムでは、細胞核構造の解析技術を紹介しつつ、その技術を用いた我々の最近の研究成果を提示するとともに、細胞核構造の解析の意義について考察したい。
  • 今井 祐記, 延 珉榮
    セッションID: S1-5
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    破骨細胞は、造血幹細胞由来マクロファージ系細胞が、RANKLの刺激により複数の細胞が融合する事で分化する多核巨細胞である。中でも、NFATc1(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1)は破骨細胞分化の主要転写因子であり、それ自身の発現はRANKLによる刺激により誘導される。
     近年、転写因子群による遺伝子ネットワーク再構築の一端がヌクレオソーム構造を規定するエピジェネティック制御によって調節されると考えられている。しかしながら、NFATc1転写制御機構をはじめ、破骨細胞の分化や成熟におけるエピジェネティック制御機構は未解明である。
     そこで、我々は、RAW264細胞を用いた生化学的な手法により、破骨細胞におけるNFATc1の新たな相互作用因子群を探索することで、エピジェネティック制御を介した破骨細胞の分化制御機構を解明することにした。
     RAW264細胞から核抽出液を調整し、抗NFATc1抗体カラムを用いたアフィニティー精製の後、質量分析により、複数のNFATc1相互作用因子群を同定した。中でも、機能未知因子である‘OCAN (Osteoclastogenic Co-Activator for NFATc1)’ に着目した。OCANは既知SWI/SNF クロマチンリモデラー複合体の構成因子であるBrg1及びBaf proteinsと同時に同定され、新たなSWI/SNF クロマチンリモデラー複合体の構成因子として機能する可能性が考えられた。OCANの過剰発現でNFATc1転写活性の増加が、ノックダウンにより破骨細胞特異的な遺伝子の発現減少を認めたことから、OCANはNFATc1の新規コアクチべーターであることが示唆された。以上により、これまで不明であった破骨細胞分化におけるエピジェネティック制御機構において、OCANが NFATc1標的遺伝子上へのクロマチン構造変換複合体のリクルートを担う新規のエピジェネティック制御因子であることが期待される(Youn MY et al. 未発表データ)。骨代謝領域におけるエピジェネティック制御機構が明らかになる事で、骨代謝の生理学的理解と同時に、骨粗鬆症や関節リウマチなどの骨吸収関連疾患の新規治療法開発の一助となることが期待される。
  • 伏木 信次, 矢追 毅, 伊東 恭子
    セッションID: S1-6
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    内分泌かく乱作用が指摘されながらも一旦は安全と評価されたビスフェノールA(BPA)は、2008年に国内外で胎児や小児への影響について再度懸念が表明されて以来、とりわけ脳神経系への影響が話題となっている。
    ヒトの尿、血清、羊水、胎盤、母乳などからBPAが検出され、なかでも胎齢15-18週では羊水中の濃度が母体血清よりも高いという報告がみられることから、私たちは、胎児期曝露が脳形成・発達にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすべく研究を開始した。
    妊娠マウスにBPA(20 µg/kg体重)を妊娠直後から連日皮下投与し、妊娠経過を追って、組織学的に解析した。その結果、大脳皮質の形成過程である妊娠12.5日から16.5日の間で、神経細胞の分化や細胞移動が、非投与対照群に比し有意に促進していた。この時期の神経細胞分化に関わる遺伝子の発現を調べると有意な変化を示し、発生をより促進する方向に働いていることがわかった。胎生期にBPAに曝露されたマウスの出生後の大脳皮質発達を調べたところ、生後3週ではⅣ層に配置されるべき神経細胞が上下の層に広がって分布するという細胞構築異常をみとめた。さらに視床と大脳皮質を結ぶ神経回路を調べたところ成熟脳でも神経線維の分布に異常がみられた。
    次に、妊娠初期からBPAを投与されたマウス胎仔終脳からDNAを回収し、RLGS法によるDNAメチル化解析を行い、BPA非投与対照群と比較したところ、スポット全体の1.9%に相当する48個が変動を示した。それら変動したスポットの中でBPA投与により低メチル化を示した遺伝子をクローニングし、その発現を調べたところ、BPA曝露群において遺伝子発現が亢進していた。以上の結果から、胎生期BPA曝露は脳におけるメチル化変動を惹起することが示され、このようなエピジェネティック変化が脳形成・発達に影響を及ぼす可能性が示唆された。
シンポジウム2
毒性オミクス
  • 菅野 純
    セッションID: S2-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    より高感度で迅速な毒性評価を実現する為に、定量RT-PCRやマイクロアレイなどの網羅的な遺伝子発現解析を、細胞1個あたりの個々のmRNAの絶対発現量(Percellome手法:特許4415079)を用いて実施するPercellome Projectを進めている。そこでは高精度かつ大規模なトキシコゲノミクスデータベースを生成しており、投与する化学物質の用量と投与後の時間経過を一括して3次元曲面にて評価する方法を採用している。これまでに、100種類超の化学物質についてのマウスにおける生体影響のトランスクリプトームをAffymetrix GeneChip MOE430 2を用いて高精度に測定し、データベース化(Percellomeデータベース)した。化学物質の毒性評価においては、所見の網羅性(見落としがない事)が要求され、その中では「有意な反応がない」ことも検出しなければならない。この要件を満たしつつマイクロアレイによる大量のデータを高精度かつ効率よく解析するために、独自のマイクロアレイデータ補正技術(特許出願済)や候補遺伝子抽出技術(RSort)、化学物質間での用量・時間を考慮した遺伝子発現反応比較解析ソフトウエア(Percellome Explorer)等を開発した。これらを利用した毒性評価の試験運用を既に開始しており、病理所見を中心とした動物実験では見いだせなかった情報を得つつある。他方、データ開示の準備を、その解析ツールと共に広く提供する準備を並行して進めており、情報データベース、Payao、Garuda等を介しての普及を目指している。また、このProjectのもう一つと特徴は、従来の「相対値測定」では困難であったところの、異なった組織・臓器間、更に異種動物間の比較解析が可能である点にある。本発表では、これらの解析の実際を紹介する。
  • Natalia POLOULIAKH, Hiroaki KITANO
    セッションID: S2-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    ‘Percellome’ database is providing a unique “per cell” readout in mRNA copy number on various organs of mice for more than 100 chemicals (NIHS). Such knowledge makes possible to use dataset without data pre-elimination and compare profiles across experiments. This opens a possibility for the mathematical representation of biological information in a manner treating a cell as an open system, with no molecule ignored.
    In collaboration with Kanno group we constructed A Geometric Clustering Tool (AGCT) and a comparative genomic analysis tool on human-mouse-rat (SHOE) which goal is to divide an expression profile by unsupervised learning mathematical technique in order to elucidate gene clusters and find transcription regulation network controlling genes. Analysis was held on two toxic congeners TCDD and TCDF, with 0.1 toxicity equivalency factor. They are known to cause birth defects, immunotoxicity and cancer through the activation of Ahr receptor pathway in mice, whilst Ahr receptor is a mediator in the course of growth, development and differentiation.
    Data of 20,000 probes per cell followed: replicates normalization, circadian effect subtraction, representation by PCA and/or spectral manifold, unsupervised clustering and sorting by validity. The analysis resulted in 498 (3,117 probes) and 369 (3,771 probes) sensible clusters for TCDD and TCDF, respectively, meeting the biological expectations. Clustering and transcription regulation results can be simulated on CellDesigner (SBI) and interactively annotated on Payao (Matsuoka, SBI).
    Since this year Percellome database is a member of The Garuda Alliance Common Platform, providing the research community with the consistent analysis workflow and biological databases.
  • 鈴木 治和
    セッションID: S2-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    我々は国際科学コンソーシアムFANTOMを組織し、哺乳動物のトランスクリプトーム解析を精力的に行っている。この原動力の一つは、独創的な手法であるCAGE法の開発にある。CAGE法とは、キャップのついた転写物の5’末端の短い配列をゲノムワイドにシーケンス解析する手法である。CAGE配列(タグ)のゲノム上へのマップにより、1ベースの精度でゲノム上の転写開始点を網羅的に同定でき、かつ、その位置からスタートする転写物の発現量(近位プロモーター活性)を実測することができる。最近行なわれたFANTOM4では、CAGE技術を次世代シーケンサーに応用したdeepCAGE法を用いて、細胞分化過程のプロモーターレベルでの転写制御ネットワーク解析に成功した。
     薬剤は必ず多くの転写物の発現(トランスクリプトーム)に影響を与えるため、その作用を転写制御ネットワークの変化で捉えることが可能である。しかしながら、薬剤作用に関する詳細なプロモーター解析および転写制御ネットワーク解析には困難があった。すなわち、1)最低百万単位のCAGEタグを集めなければ、特定細胞におけるプロモーター活性を詳細記述するのに十分でないこと、2)CAGEライブラリーの調製過程で、PCRを用いたタグ増幅ステップでバイアスが生じる問題があり、わずかなプロモーター活性の変化をも厳密に捉えることが困難であった。しかしながら、1)については上述したdeepCAGE法により、また、2)についてもPCRを用いないNon-amplified CAGEライブラリー調製法の開発に成功し、低レベルの発現から5桁以上の直線性を持つ、定量性が極めて高いデータが得られるようになった。
     本シンポジウムでは、我々の持つ転写制御ネットワーク解析手法を説明するとともに、上記した状況を受けて既にスタートしている、プロモートームおよび転写制御ネットワークによる薬剤作用の解析基盤構築について紹介したい。
  • 石川 智久
    セッションID: S2-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    近年、薬物トランスポーターの遺伝子多型または薬物相互作用によって薬物副作用が引き起こされるという臨床知見が蓄積しつつある。その問題を検討・解決すべく2012年3月12日~13日の2日間、米国にてInternational Transporter Consortium Workshop 2(ITCW2)を開催したので、その報告を行う。我々は2010年にMembrane Transporters in Drug Developmentと題してFDA白書をNature Review Drug Discoveryに発表した(1)。しかしながらトランスポーターの薬物相互作用の評価を創薬のどの段階に組み込むべきか?という問題が製薬企業にはある。白書に記述された全てのトランスポーターを全て評価するのは不可能に近い。そこで我々は創薬の初期段階に組み込めるように、化合物の構造に基づいて薬物相互作用するかどうかをin silico判断するQSAR解析方法を開発した。その応用として、胆汁排泄トランスポーターBSEP/ABCB11を阻害して肝内胆汁鬱滞を引き起こす薬・化合物の重要な構造的因子を同定する事に成功した(2)。また、薬物トランスポーターまたは薬物代謝酵素の遺伝子多型によって、薬物体内動態が大きく影響をうけて、一部の患者おいては重篤な副作用が起きる場合がある。その問題を解決すべく、我々は遺伝子多型を迅速に検出する方法を開発した。その基本原理と臨床応用例を紹介する(3)。
    (1) Giacomini KM, et al. Nature Review Drug Discovery, 9, 215-236, 2010.
    (2) Saito H, et al. AAPS J. 11(3), 581-589, 2009.
    (3) Aw W, et al. Clin. Pharmacol. Ther. 89, 617-620. 2011.
シンポジウム3
生態毒性試験生物の基礎研究
  • 花里 孝幸
    セッションID: S3-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    湖沼プランクトンのミジンコを用いた生態毒性試験は、薬剤影響を個体レベルで評価している。そのため、その試験条件はミジンコが生活している自然環境と異なる。なぜなら、ミジンコたちは湖で個体群をつくり、また別種の生物と相互関係(競争や捕食・被食関係)を持ちながら共存している。そこで湖沼に有害化学物質が流入すると、その物質は、生物相互関係を介して複雑な影響をミジンコに与えると考えられる。その影響を解析するために行った実験結果を紹介する。
     水槽の中にプランクトン群集を作り、そこに殺虫剤カルバリルを投与して、群集の変化を調べた。すると、大型ミジンコが姿を消し、小型ミジンコが増えた。これは大型種ほど殺虫剤に弱いことを示している。ところが、この殺虫剤を用いた生態毒性試験の結果は、大型ミジンコの方が小型ミジンコよりも高い耐性を持っていることを示した。これは、個体群レベルと個体レベルの間で薬剤影響が異なることを示している。その理由として、ミジンコ個体群が殺虫剤の悪影響を受けて密度を減らした後の個体群の回復速度が小型ミジンコの方が高かったことが考えられる。
     次に水槽に作ったミジンコ類とワムシ類の群集を複数作り、その一部の水槽に捕食者のケンミジンコを入れ、全ての水槽に殺虫剤を投与した。すると、捕食者の存否に応じてワムシ個体群密度が大きく変化した。プランクトン群集への殺虫剤影響には、生物たちの相互作用が大きく関与していることが分かった。
     捕食者が水中に匂い物質を放出しており、それにミジンコが反応して喰われないように形態を変えることが明らかになった。この匂い物質と共に、微量な殺虫剤(毒性試験での無影響濃度)をミジンコにさらすと、ミジンコの防御形態がより大きくなり、このコストとして増殖速度が低下することを見いだした。湖における捕食者とミジンコのケミカルコミュニケーションを、微量な殺虫剤が撹乱したといえる。
  • 蒲生 忍
    セッションID: S3-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    ミミズは、環形動物貧毛綱に属する雌雄同体の土壌動物である。チャールズ・ダーウィンはその絶筆『ミミズと土』で、ミミズが植物の生育に適した肥沃な土壌の形成に大きな役割を果たしていることを示した。また、レィチェル・カーソンは社会的に大きな影響を与えた『沈黙の春』の中でダーウィンを引用しつつ、ミミズによる農薬の生体濃縮とコマドリの死を関連付けている。
     ミミズを環境指標として捉える場合、その生態の理解と種の同定は必須である。日本に広く分布するのは温暖な気候を好むフトミミズ属Megascolecidaeが主であり、冷涼な気候を好みヨーロッパ・北米に主に分布するツリミミズ属Lumbricidaeは少ない。フトミミズは主に初夏に地表に現れ産卵し、一年性で越冬する種は稀である。従って、カーソンの生体濃縮仮説は少なくともフトミミズでは成立しにくい。また、ミミズは一般に外形的な特徴に乏しい中で、フトミミズ属では雌雄の性孔や性徴、さらに体内の貯精嚢や腸盲嚢等の数や形態に多様性があり分類指標とされる。しかし、それぞれの指標の変異の幅が明確ではなく、国内の種数や分布の詳細は明らかではない。
     フトミミズが一般に飼育困難なのに対して、ツリミミズ属シマミミズEisenia foetida (Savigny, 1826) は繁殖力が強く室内での周年飼育が可能である。実験的利用に適しており、OECDやISOの国際規約で毒性評価の指標動物として取り上げられている。ミミズを環境指標として捉えるにしても実験動物として捉えるにしても、その生物としての理解に加えて、分子生物学的資源と情報を整備することが必須であり、近道である。我々は、フトミミズの生態と分布を明らかにするための簡便な分類法の確立を目指してミトコンドリアrDNAの塩基配列と形態的指標との相関を検討した。また、遺伝子検索の基盤としてシマミミズ精嚢からゲノムDNAを抽出しBACライブラリーを作成し、メタロチオネインを含め幾つかの遺伝子を単離した。我々のささやかな試みの一端を紹介したい。
  • 寺岡 宏樹
    セッションID: S3-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    ゼブラフィッシュは脊椎動物におけるショウジョウバエとして前世紀の終わり頃に注目を集めて以来、循環器系を含む臓器発生や発がん研究等の医学分野でも大きな役割を果たしてきた。一方、ゼブラフィッシュやメダカなどの小型魚類は、既に国内外における多くの毒性試験ガイドラインでモデル動物に指定されているが、そのハイスループット特性や動物倫理の観点からさらに重要性を増してきている。しかし、魚類全般を含めても、種々の化学物質の毒性発現機構がよく理解されている例は少なく、多くは十分な検討さえ行われていない。循環障害は発達初期魚類で最も問題になりやすい毒性であり、さらに二次的にも大きな影響を及ぼす。1960年代に米国五大湖のレークトラウトが激減したことが契機となり、ダイオキシン(2,4,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD))による発達魚類毒性が大々的に研究されてきた。なかでも、ダイオキシンによる心臓周囲浮腫などの循環障害が注目されてきたが、いまだに発現機構の解明にはほど遠い。我々は、発達初期ゼブラフィッシュにおいて、TCDDが中脳血流を一過性に減少させること、高速カメラを用いて心臓周囲浮腫を早期に定量できることを利用して循環障害の発現機構解明に取り組んできた。本シンポジウムでは我々のデータを中心に、メダカなども含めた他グループの発表もふまえて、発達初期魚類における循環障害の発現機構について解説する。
  • 田中 利男, 西村 有平, 島田 康人
    セッションID: S3-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    化審法の生態毒性試験において従来より魚類は頻用されてきたモデル生物であります。一方最近10年間で、動物愛護管理法などの関連から医学研究におけるゼブラフィッシュの活用が国際的に激増しており、その医学生物学的情報は著しい増加が認められます。さらに、ハーバードで2007年にゼブラフィッシュによりスクリーニングした医薬品が、昨年末には臨床開発に成功しており、世界中でゼブラフィッシュ創薬ベンチャーが多数創成されています。また、生態毒性試験や創薬スクリーニングにおいて、ゼブラフィッシュに加え、ミジンコ、ミミズ、鳥類、ほ乳類などが多用されており、これらの多彩な種における生態毒性メカニズムの総合的理解の基盤となるのがゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームなどのオミックス解析となります。ヒトとゼブラフィッシュのゲノムにおける相同性は、約7割とされていますが、我々は医薬品の安全性薬理学や病態モデルにおけるトランスクリプトームの類似性を、数多く明らかにしてきました。また、毒性や薬効のメカニズム解析において、ほ乳類と比較して容易に遺伝子介入(ノックダウン、過剰発現など)が可能であるだけではなく、脊椎動物であることから各臓器別毒性評価ができることが大きな特徴となります。以前はゼブラフィッシュでは不可能とされたゲノム改変技術が、ZFNやTALENsにより可能となりました。さらに我々は、各種の色素欠損ラインとトランスジェニックを交配させた独自のゼブラフィッシュを13種類(MieKomachi001-013)創成し、新規in vivoイメージングプローブを多数開発し、生体レベルで特定の細胞ライブイメージングのハイスループット化を実現しています。このように我々は、薬理ゲノミクスにおけるモデル生物としてのゼブラフィッシュを、10年以上研究してきましたので、この視点から生態毒性試験におけるゼブラフィッシュの役割について報告します。
  • 岩田 久人, Jin-Seon LEE, Thuruthippallil LEENA MOL, 久保田 彰, Eun-Young KIM
    セッションID: S3-5
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    野生鳥類を対象にした化学物質の生態リスクについては、試料の確保が困難である、作用機序に基づいた毒性試験法が発展途上である、感受性の情報がないなどの理由から、定量的に評価した例はほとんどない。
     ダイオキシン類の毒性に対する感受性は、実験動物種・系統間で大きく異なる。この感受性の種差を説明する一要因として、各生物種のアリルハイドロカーボン受容体(AHR)の構造的・機能的な差が挙げられている。したがって、ダイオキシン類の生物種特異的な毒性影響や感受性、さらに生態系でのリスクを評価するためには、AHRの遺伝情報や機能への理解が不可欠である。複数の鳥種を対象にした最近の研究では、ダイオキシン類による肝培養細胞でのシトクロムP450(CYP)1A誘導能(EC50)と受精卵への投与による胚の致死率に正の相関関係が認められている。これは、CYP1A誘導に敏感な種ほどダイオキシン類毒性が惹起されやすいことを意味する。しかしながら、鳥類ではAHR-CYP1Aシグナル伝達系の分子的・機能的特性はほとんど知られていない。
     我々は、ニワトリ・カワウ・アホウドリなどの野生鳥類を対象に、ダイオキシン類の生態リスクを曝露量と有害性(感受性)をベースにして定量的に解析することを試みた。その過程で、AHR-CYP1Aシグナル伝達系の分子的・機能的特性を明らかにした。さらに、ダイオキシン類曝露に対する種特異的感受性を解析するin vitro試験法を確立することで、生態リスク評価法のモデルケースを構築した。今後AHRの塩基・アミノ酸配列と化学物質との反応を関連付けることができれば、多様な生物種の潜在的な感受性を予測することが可能になるであろう。こうした手法は、多くのインビボ試験を排除することよって費用・時間を減らし、生態リスクの評価や化学物質管理の意思決定を迅速におこなうために必要である。
シンポジウム4
再生医療とその評価
  • 田畑 泰彦
    セッションID: S4-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    再生治療とは、細胞の増殖・分化能力(細胞力)に基づく自然治癒力を活用することによって、生体組織の再生修復を行う治療である。この再生治療(一般には再生医療と呼ばれる)の実現には、細胞移植と組織工学のアプローチがある。一般に、体内では、細胞が単独で生存、機能していることはなく、細胞はその周辺環境と相互作用しながら、その生物機能を発揮している。そこで、細胞力を活用した治療を考えるのであれば、細胞自身の機能とともに、細胞力を促す細胞周辺環境も重要である。これらが揃って初めて、細胞力を介した再生治療効果が期待できる。
     細胞の周辺環境を作り与える技術・方法論が組織工学である。細胞環境は細胞外マトリクス(細胞の家)とタンパク質(細胞の食べ物)からなる。例えば、バイオマテリアル(体内あるいは生体成分と触れて用いるマテリアル)を利用して、細胞の家や細胞の食べ物を細胞に運ぶドラッグデリバリーシステム(DDS)を作り、細胞力を高め再生治療を実現する。すでに、生体吸収性ハイドロゲルを用いて、体内で不安定なタンパク質を細胞に与え、細胞力を高めることが可能となっている。この組織工学技術により血管や皮膚、骨などの組織の再生治療が実現している。また、血管再生治療は移植細胞の生着率と治療効果を向上させている。
     再生治療の発展には、それを科学的に支える細胞研究や創薬研究(細胞力を高める細胞の食べ物の研究開発)の進歩が不可欠である。例えば、細胞周辺環境に近い性質をもつ培養基材は、幹細胞の増殖、分化機構の解明と制御の研究を加速し、移植細胞の調製にも必要である。また、細胞毒性の低い遺伝子導入バイオマテリアルによる細胞機能の改変、増強、制御技術は、細胞研究のみならず、創薬研究にも大きく貢献する。
     本講演では、再生治療と再生研究(細胞研究と創薬研究)とからなる再生医療領域をオーバービューするとともに、再生医療の今後の発展にはモノつくり技術が必要不可欠であることを強調したい。
  • 佐藤 陽治
    セッションID: S4-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    総合科学技術会議基本政策推進専門調査会(平成20年5月)『再生ロードマップ』によれば、「再生医療」は「損傷した臓器や組織を再生し、失われた人体機能を回復させる医療」と定義されている。すなわち、「再生」を目的とした医療の総称であり、その手段には大きく分けて、①薬剤等で自己再生能力を活性化する方法、②脱細胞組織や合成足場材料を用いる方法、③生きた細胞や組織を用いる方法、および④これらを組み合わせた方法がある。手段の違いによって医療上のリスクのプロファイルが異なるため、「再生医療の安全性」を考える場合には、目的へのアプローチの手段別に分けて考える必要がある。「①薬剤等で自己再生能力を活性化する方法」の安全性は医薬品(あるいは生物製剤)としての安全性の問題であり、「②脱細胞組織や合成足場材料を用いる方法」については医療機器としての問題となる。「③生きた細胞や組織を用いる方法」については、細胞・組織の加工の程度が最小限の場合、あるいは十分な経験がある方法による場合には移植医療(または輸血)と見なされるが、一定以上の加工(培養・活性化・分化誘導など)が施される場合には「細胞・組織加工製品」と呼ばれ、その主な作用様式が細胞・組織の薬理的・代謝的・免疫学的機能による場合には医薬品として、細胞・組織の物理的・構造的機能による場合には医療機器として安全性を考える必要がある。細胞・組織加工製品は多様性が高く、リスクの内容や重大性、品質評価・管理のポイントは、細胞の生物学的特性と由来、製造工程、非細胞成分、最終製品の態様および臨床における製品の具体的な使用方法などに大きく左右される。従って、細胞・組織加工製品の品質・安全性の確保は、多様なリスクファクターを考慮したリスクベースアプローチによってケースバイケースで考えることが原則となる。
  • 川上 浩司
    セッションID: S4-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    再生医療に用いられる細胞医薬品は、通常は人(自己あるいは同種)由来の細胞を修飾して使用されるため、まずは細胞の採取と感染のコントロールが重要となる。米国FDAは2001年から、細胞組織利用製品の施設登録、細胞組織利用製品をリストアップするための統合システムの作成、危険因子のスクリーニングと感染症検査結果に基づいたドナー組織、細胞などの適格性確認の基準の規定などを進めてきた。2005年5月にcurrent Good Tissue Practice (cGTP)ガイドラインの最終案を施行し、米国内の細胞組織利用製品の製造業者に対し、感染症の感染や感染拡大を予防するための採取、処理、保存、ラベリング、パッケージング、搬送のための規定と、記録管理の手順などを制定した。本講では、細胞医薬品のCMCについて概要を解説する。
シンポジウム5
子どもの毒性学
  • 菅野 純
    セッションID: S5-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    2008年6月の第35回日本トキシコロジー学会(現日本毒性学会)年会に於いて、遠藤仁先生、関根孝司先生のご尽力により、子どもの毒性学をテーマとして、5つのシンポジウムと2つの特別講演等を実施し、多くの小児科臨床の先生を含む関係研究者のご参画を頂いた。当時の案内の概要は『暴露された時点では殆ど無症状だが時間が経つと症状が現れる遅発性毒性が先進国の子どもには重要であろう。最近のシグナル毒性研究は現状の暴露レベルでの遅発性毒性の可能性を示唆しているからである。その一つの標的はその完成にシグナルを利用している脳で、シグナルが外界から乱されると微細構築や機能に影響が出ることが想定される。この場合、神経細胞を直接殺す強力な神経毒や、高濃度暴露の必要がない。他の標的も含め、成長後に遅発性毒性として顕在化する事を考慮した子どもの毒性学の構築が急がれる、、、』。関根孝司先生と共に2009年の年会では前年のフォローアップと注意欠如多動性障害に関連した「子どもの毒性学シンポジウム」を、2011年は、関連テーマとして黒岩幸雄先生、吉田武美先生のご尽力で「遅発性の情動認知毒性-コリンエステラーゼ阻害物質による遅発性の中枢神経毒性」シンポジウムを実施した。
     本年会は再び関根孝司先生に「発達障害、多動性障害、Asper障害などの「精神(神経)発達の異常」の切り口からのシンポジウムを企画頂いた。この様な発達障害は、ようやく問題意識が多くの小児科医で共有される様になった段階で、病態や原因について多くが未解明であり、この分野の毒性学的報告が少ないとのことであるが、現段階で臨床的に重要な問題の提起をして頂くことは、毒性学者にとって大きな刺激になるものと期待される。この機会に臨床的ニーズと基礎研究的シーズの噛み合わせと、真のレギュラトリーサイエンスとしての子どもの毒性学の基盤がより強固なものとなることが期待される。
  • 関根 孝司
    セッションID: S5-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    近年、医療の急速な進歩に伴い、疾病構造が大きく変化している。特に小児領域では、「発達障害」が問題が大きな問題となっている。発達障害とは、乳幼児期に正常な精神発達が妨げられ、様々な「精神的・神経学的障害」を呈する疾患である。米国小児科学会も、「今後重要となる小疾患」の一つに「発達障害」を取り上げている。
    発達障害の臨床像は、自閉性障害、注意欠陥多動性障害(ADHD)、Asperger障害など多彩であり、その発症には遺伝的要因の関与も示唆されている。しかし、いまだその病因の本体は明らかにされていない。そもそも発達障害について考えるには、「小児の正常発達」について理解しなければならないが、「乳幼児の脳神経系の正常発達のメカニズムの科学的解析」についてはほとんど手つかずの状態である。
    本シンポジウムでは発達障害について臨床的観点からoverviewした後に、「発達障害の実態」、「子どもの正常発達の科学的解析」について現状と今後についてご講演いただき、その後に、毒性学的観点から「発達障害、中枢毒性」についてtopicsをお話いただく。これらの講演を通じて、「発達障害」が今後、毒性学的観点からご研究いただければ幸である。
  • 橋本 俊顕
    セッションID: S5-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    発達障害は発達期の脳機能の異常により生じる非進行性の様々な病的状態であるが狭義には認知・行動面の偏りのため日常生活に困難をきたす状態を言い、中心的なものに自閉症スペクトラム障害、注意欠陥/多動性障害、学習障害などがある。本講演では周囲を巻き込んでトラブルを生じやすい自閉症スペクトラム障害(ASD)、注意欠陥/多動性障害(AD/HD)を中心にその病態の知見について述べる。
    1.自閉症スペクトラム障害について
    自閉症スペクトラム障害はDSM-IV-TRによる広汎性発達障害のうち自閉性障害、アスペルガ−障害、特定不能の広汎性発達障害が該当する。社会性およびコミュニケーションの障害、こだわり行動の3徴候がある。近年、ASDの頻度は増加傾向であり有病率は少なくとも1~2%となっている。男女比は3-4:1で男性に多い。遺伝率は90%以上である。現在まで候補遺伝子として20種類以上の遺伝子が同定されている。画像診断で前頭葉内側・前頭前野・辺縁系を含む社会性脳の機能障害、遠隔脳部位間情報伝達・同期生の障害が想定されている。
    2.注意欠陥/多動性障害について
    AD/HDは衝動性、多動性、不注意の症状を呈する障害であり、3つのサブタイプに分類される。多動性の症状は多くは成長と共に減少するが不注意の症状は継続することも多く、近年、成人のAD/HDも少なくないことが明らかとなってきた。頻度は5-6%で男児に多い。発症の背景に遺伝学的要因が濃厚である。皮質-線条体-視床-皮質回路の異常により実行機能、報酬系機能の障害があると考えられている。神経化学的には上記の回路に投射する腹側被蓋野、黒質から出るドパミン神経系の機能異常(低下)があり、この神経系機能の調整に作用する薬剤により症状が改善する。画像的および遺伝学的にASDと共通した基盤があると考えられる。
  • 多賀 厳太郎
    セッションID: S5-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    胎児期から乳児期にかけて、ヒトの脳の構造と機能が発達する仕組みについての知見は極めて限られている。特に、一般の胎児・乳児を研究することには制約があり、非侵襲の脳機能イメージング手法が近年になって開発されて初めて、定型発達の実態が捉えられるようになってきた。例えば、磁気共鳴画像(MRI)を用いて、脳回・脳溝や主要な神経繊維束等、乳児の脳のマクロな構造形成の過程が非侵襲に調べられるようになった。また、近赤外分光法(NIRS)を用いた脳活動のイメージング手法が開拓され、乳児の視覚・聴覚・言語・認知等の機能に関わる脳の領域の発達過程の一部も明らかにされた。さらに、乳児の睡眠時の脳の自発活動をNIRSやfMRIで計測することで、脳の機能領域間のネットワークの形成過程もわかってきた。これらの研究は、脳の基本的な構造の特徴は、新生児の時期までにおおむね形成されているが、機能的な脳活動やネットワークの性質は生後数ヶ月間に行動の変化とともに劇的に変化することを示している。
     しかし、こうした脳のマクロなレベルでの発達が、神経伝達物質系の発達や脳内への物質の取り込み・輸送のような分子レベルの機構とどのように関連しているかについて、乳児で非侵襲的に調べる手法は限られている。薬物や環境ホルモンのような外因性の物質が、母親を通じて、あるいは、直接乳児に摂取された場合に、脳の発達に及ぼす毒性や行動発達への影響について多くの知見が蓄積されているが、それらの機構を理解するためには、定型発達において、内因性の脳内物質の変化がマクロなレベルの脳の構造や機能の発達とどのように関連しているかを明らかにすることが不可欠であると考えられる。
  • 種村 健太郎, 古川 佑介, 大塚 まき, 五十嵐 勝秀, 相崎 健一, 北嶋 聡, 佐藤 英明, 菅野 純
    セッションID: S5-5
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    個体の胎生期-幼若期の脳は、その発生-発達段階にある。その期間に、遺伝子という設計図を元にして、脳の基本構造が出来ると共に、神経活動(主に神経伝達物質とその受容体を介した神経シグナル)による微調整がなされ、脳が完成に向かう。すなわち、脳は「活動」しつつ、その「形態・機能」を完成させていく。従って、この時期の神経作動性化学物質の暴露による神経シグナルのかく乱は、一時的な神経症状を呈するだけに留まらず、脳構造や神経回路の形成過程に影響を及ぼす危険を高める。そして、こうした影響が不可逆的に固定されたまま成長した結果、成熟後に遅発性行動異常等の脳高次機能障害として顕在化することが危惧される。しかしながら、従来の神経毒性評価手法は成熟動物への化学物質投与による急性~亜急性の、痙攣、麻痺といった末梢神経毒性を主対象としており、遅発性の中枢神経機能に対する影響評価への対応は、比較的に立ち遅れてきた。こうした問題に対して、我々は、マウスを用いて、①神経作動性化学物質の胎生期~幼若期暴露、②複数の行動解析試験を組み合わせたバッテリー式の情動-認知行動解析による行動異常の検出、及び③行動異常に対応する神経科学的物証の収集、により遅発性の中枢神経毒性検出系の構築を進めてきた。
     本シンポジウムでは、モデル化学物質として、イボテン酸(イボテングダケ等の毒キノコとされる一部のテングタケ属に含まれる)を用いた解析として、幼若期(生後2週齢)における単回強制経口投与による、成熟期(生後12~13週齢時)の不安関連行動の逸脱、学習記憶異常、情報処理不全といった異常行動と、それと対応する海馬の形態所見、及び遺伝子発現プロファイルについて紹介する。さらに、遅発中枢影響としての異常発現のメカニズム解明を目的とした、イボテン酸投与後の遺伝子発現変動解析結果についても議論したい。
  • 清水 教一
    セッションID: S5-6
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    【緒言】
     金属の中には,必須微量元素として生体の存在に必要なものがある.しかし,それらが過剰に蓄積した場合には様々な毒性を生じる.この「金属の蓄積症」は大きく2種類に分類される.1つは過剰摂取・暴露による中毒である.公害病や職業病などに多くみられる.カドミウム中毒である「イタイイタイ病」,メチル水銀中毒の「水俣病」あるいは鉛管工がかかる「鉛中毒」などである.その他に,水銀の蓄積が自閉症の原因ではないかと一時話題になったことも比較的記憶に新しい.もう1つは,金属の代謝あるいは排泄に障害があり,そのためある物質が体内に蓄積する疾患である.本稿において筆者は,金属代謝の異常症として,銅が蓄積するWilson病と鉄が蓄積する無セルロプラスミン血症を中心に,生体に対する金属毒性について解説する.
    【Wilson病】
     常染色体劣性遺伝形式をとる先天性銅代謝異常症の代表的疾患である.肝細胞内での銅代謝障害が病態の中心である.これにより,肝臓中に銅が蓄積し肝障害を生じる.また,血液中に過剰に流出した銅は,体内の種々の臓器に蓄積し,それらの臓器障害を引き起こす.肝硬変,錐体外路症状およびKayser-Fleischer角膜輪が三主徴である.その他,溶血,腎障害,精神障害などが起こりうる.治療は,銅キレート薬の内服と低銅食によって行う.
    【無セルロプラスミン血症】
     セルロプラスミン蛋白の障害により,中枢神経,肝臓などの鉄が蓄積する常染色体劣性遺伝性疾患である.セルロプラスミンのフェロオキダーゼ活性が消失しているため,二価鉄から三価鉄への酸化が障害され鉄が過剰蓄積する.40-50歳以降に,構音障害,ジストニア,痴呆などの多彩な神経・精神症状および網膜変性などにて発症する.血清鉄の低下,貧血もみられる.本症に対する根本的な治療法は確立されていないが,鉄のキレート薬にて症状の改善を認めたとの報告がある.
シンポジウム6
神経行動毒性試験の標準化と新たな指標開発の展開
  • 宮川 宗之
    セッションID: S6-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    化学物質が神経系に及ぼす影響を実験動物やヒトの行動を指標に用いて評価しようという試みは広く行われており、OECDのテストガイドラインでも種々の行動試験が紹介されている。「詳細な行動観察」や「活動性の測定」などは一般毒性試験の一部として(神経毒性をスクリーニングする目的で)実施されており、スクリーニングで影響が認められた場合は詳細な神経毒性の評価が必要と考えられている。神経毒性、発達神経毒性、生殖毒性に関するテストガイドラインでは、神経系の「機能的変化」を把握することも必要とされることから、OECDは神経毒性と生殖毒性試験に関するガイダンス文書を用意し、オペラント条件づけの応用等、様々な認知機能影響の検査課題を解説している。
     しかしながら、認知や情動に係わる試験では数種類の迷路学習のみが汎用されている現状があり、オペラントチャンバーを用いた認知機能の評価は滅多に実施されず、情動性の評価ではオープンフィールド試験と高架式十字迷路課題以外が利用されることは殆どない。医薬品の安全性試験では、一定の範囲で有害性が認められないことが確認されていれば目的は達成されるかもしれないが、例えば環境保健分野では子どもの知能や衝動性等の情動面の発達障害が問題となることもあり、社会的に問題となった化学物質については、ヒトにおける影響を適切に反映し得るかどうかといった点に配慮しつつ、神経系高次機能に対する影響を動物実験によって詳細に評価することも求められる。
     上記の観点からOECDのガイダンス文書で紹介されている行動試験について概観するとともに、認知機能や情動性の評価における問題点を指摘し、機能的変化に関わるデータをどの様に毒性情報として利用するかについて基本的な考えを述べる。行動分析や行動薬理で使用されてきた手法のみならず、行動遺伝学やエソロジーを背景とした試験法導入の必要性にも言及したい。
  • 若菜 茂晴
    セッションID: S6-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    ゲノム科学は構造解析から機能解明へ展開し、マウスにおいてはゲノム機能解明の手段としてENUミュータジェネシスを皮切りに大規模突然変異マウスの作製プロジェクトが開始された。すなわち、欧米を中心に全遺伝子の機能欠損(ノックアウトマウス)作製プロジェクト(KOMP、EuCOMM)が推進され、マウス全遺伝子のES細胞の樹立はほぼ完了し、今後はマウス個体作製とその表現型レベルでの網羅的な解析の国際的な連携プロジェクトが展開されようとしている。我々は、理研GSC ENUマウスミュータジェネシスプロジェクトの成果を受けて、理研バイオリソースセンターにて「日本マウスクリニック」(http://mouseclinic.brc.riken.jp/ )を設立し、網羅的な表現型解析プラットフォームとその実験プロトコルの整備(SOP)、正確なデータ記述法と統計解析システムの開発等より広範囲で詳細なマウス表現型解析システムを構築した。そして国内外の研究者が開発した遺伝子改変マウスを中心に網羅的な表現型解析を実施し、ヒト疾患モデルとしてのアノテーション、さらに、セマンティックWeb技術に基づくマウス表現型情報を扱うための技術基盤開発などを行っている。本シンポジウムでは日本マウスクリニックのシステムの紹介と、昨年開始された国際マウス表現型解析プロジェクトIMPC (International Mouse Phenotyping Consortium)について説明し、マウス表現型解析の国際標準化の潮流について概説する。
  • 掛山 正心, 遠山 千春
    セッションID: S6-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    実験動物における行動表現型は、ヒトへの外挿を志向する毒性学全般において重要な指標である。我々はその中でも、「認知・行動毒性」として、外的環境と自己の関係性を把握し、適切な判断を下し、自己を制御する高次脳機能に対する影響に注目して研究に取り組んでいる。本講演ではダイオキシンの低用量発達期曝露による影響表現型(以下では、TCDD曝露ラット/マウスと示す)とともに試験法を紹介し、指標の重要性を論じたい。第一に、状況判断や自己制御を含めた学習機能である。スキーマ依存性学習(Flavor Map)試験は、食べ物の匂いをもとにした前頭葉依存性の課題である。TCDD曝露ラットは、単純な記憶課題では影響のない低レベルの曝露であっても、この課題を習得できなかった。全自動行動試験装置IntelliCageにおける行動柔軟性課題は、自らが作り出した行動パターンを状況に応じて変更できるかどうかを調べるものだが、TCDD曝露マウスではこれが低下していた。第二に、天敵の匂いに対する反応である。TCDD曝露マウスは天敵の匂いに対して強いストレス反応を示した。そして第三に、仲間との関係性すなわち社会性行動試験である。化学物質曝露影響として今後注目すべき自閉症やうつ病などの心の問題は、すべて社会性の中で表出する問題である。しかし従来の行動毒性試験は一個体のみを対象とすることが多く、社会性を扱うことが難しかった。我々はIntelliCage装置を用いることで12~16匹のマウスを集団生活させ、社会性を評価する試験を開発した。TCDD曝露マウスは、いわば「ひっこみじあんになる」という社会的劣位性を示し、無駄な行動を繰りかえす固執的行動を示した。これらの行動指標は、ヒトの自閉症やADHD、うつ病患者の一部で見られるものと類似している。行動毒性試験の新たな指標として、認知・行動毒性をさらに発展させてゆくことが重要だと思われる。
  • 篠原 一之
    セッションID: S6-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    最近、自閉症や注意欠陥障害などの発達障害が増加していることや、疾患とは診断されない、衝動的暴力、ひきこもり等の思春期問題行動が増加していることから、対人関係の問題と化学物質の関連性が指摘されている。
     しかし、対人関係能力の定量的評価法が確立されていないため、それら対人関係の病態・病因は明らかにされていない。つまり、これまでの対人関係能力の評価は、医師の問診・行動観察による診断や心理アンケートによる調査であり、定性的評価の域を出ず、定量的評価が行われてこなかったのである。
     そこで、我々はPCベースの思春期以降の対人関係能力評価法を確立し、検証を行ってきた。①情動認知能力評価課題(モーフィングテクニックを用いて情動表出強度を変え、表情や音声から相手の情動を読み取る能力を測定)を用いて、思春期生徒の表情と音声による情動認知能力とダイオキシン受容体(AhR)遺伝子多型が相関していることを明らかにした。また同じ課題を用いて、自閉症群と健常群を比較したところ、自閉症群は音声による情動認知能力は低下するが、表情による情動認知能力はあまり低下してないことも示した。その他、②衝動性評価課題、③不安、孤独感、ネガティブ感情評価課題を用いて、それら項目と化学物質の影響を受けうるホルモンの濃度との相関等を見いだしている。
     一方、化学物質の脳への毒性作用は、胎児期に起こると考えられているので、直接的に「化学物質の母体血中濃度や新生児体血中濃度」と「児の対人関係行動」の相関を調べるためには、乳幼児の対人関係能力を調べなければならない。我々は、乳幼児期の対人関係行動の定量評価を行うための手法(④共感性、⑤衝動性)を開発し(PC上のプログラムを用い、画像や音に対する乳児の反応を記録)、現在、コホート集団における母と子のPCB類濃度と乳児期の対人関係行動能力との因果関係について検討している。
シンポジウム7
日本における農薬等の急性曝露評価の必要性
  • 小野 敦
    セッションID: S7-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    我が国における農薬のヒト健康影響評価は、慢性曝露を対象としており、ヒトが一生涯にわたり毎日摂取しても健康に影響しない基準値として一日許容摂取量(Acceptable Daily Intake: ADI)が設定されている。近年、海外では農薬などを短期間に大量摂取したために中毒となる症例が発生した事例等を発端として、慢性曝露のみでなく急性曝露影響を評価し、その指標として急性参照用量(Acute Reference Dose: ARfD)を設定する取り組みが始められている。WHO/FAO合同農薬残留専門家会議(JMPR)では、1999年より急性曝露評価を開始するとともに、2002年には、ARfDを、「24時間以内に摂取してもヒト健康に影響を及ぼさない量」と定義している。我が国においては、過去に農薬混入等の中毒事例に関連した参考値としてARfDが設定された例を除いて急性曝露影響の評価は実施されていないが、ヒトが農薬等を事故的に短期間曝露した場合に起こりうる健康影響について評価を行い、ARfDを整備することは、食の安全のために重要である。しかしながら、実際のARfD設定においては、従来の安全性試験における急性毒性試験は致死のみをエンドポイントとしている、一方、その他の各種毒性試験は慢性影響の評価を目的としているため急性期影響の評価指標は限られており、さらに発現した毒性が急性影響であるという科学的根拠を示すための専門的知識が要求されることから不確定な要素が残されており、海外においても考え方がまだ十分に確立されていない。そこで我々は、公開されている農薬評価書等をもとに約200農薬についてARfDの設定を試みた。本講演では、急性曝露影響の必要性とともに我々の検討結果をもとに既存情報からのARfD設定の可能性と課題について概説する。
  • 代田 眞理子
    セッションID: S7-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    急性参照用量は、農薬等の短期間の摂取による健康影響評価の指標として設定される。胎児および出生児の形態あるいは機能の発達分化の多くは、厳密な時間的スケージュールの下で物理的、生化学的あるいは内分泌学的制御を受けて進行していることから、生殖発生毒性試験で認められた影響は、それが反復投与試験であっても急性影響の可能性を考慮する必要がある。実際、FAO/WHO Joint Meetings on Pesticide and Residues (JMPR)でも、比較的多くの剤で生殖発生毒性試験の成績を根拠に急性参照用量が設定されている。
     生殖発生毒性試験で認められる毒性影響は、1)親動物に対する影響、2)母動物に対する毒性を介した胚・胎児/出生児への影響、3)胚・胎児/出生児に対する直接影響、に大別できる。本シンポジウムでは、妊娠動物に農薬を単回投与した際の急性影響を例示するとともに、これら3つの観点から急性参照用量の設定についてについて述べたい。
     生殖発生毒性試験の成績から急性参照用量の設定を考慮する際には、胚・胎児/出生児の形態あるいは機能の発達分化に対する影響を考察するとともにライフステージによって変化する生理状態と作用機序との関係を考慮して進めることがより適切な設定へのひとつの道筋になるものと考えられる。
  • 松本 清司
    セッションID: S7-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    急性参照用量(ARfD)は、既知の情報を基に24時間以内に摂取しても健康に何ら影響しない食品および飲料水中に残留する農薬の量をいう。農薬のARfD設定における重要なターゲットは、血液毒性、免疫毒性、神経毒性、初期に認める肝・腎毒性並びに内分泌及び生殖発生に対する影響とされている。食品安全委員会の農薬評価書等について約200の農薬を調べたところ、貧血は23%で見られ、赤血球系パラメターの軽度変化を含めると39%で血液系への影響が報告されている。ARfDの設定においては、標的臓器における暴露初期に認められる毒性所見が重要であることから、ここでは主に血液毒性について述べる。
     ARfDの設定に関連する血液毒性の指標として、メトヘモグロビン(MetHb)及び溶血性貧血があげられている。MetHbは活性酸素イオン等の酸化により形成されるが、同時に生体は還元系による回復能をもつ。この還元能には種差がみられる。化合物の動態によっては、MetHbの形成と回復が暴露後速やかに起こる場合がある。溶血性貧血は、赤血球の機械的損傷、免疫介在性貧血、細胞膜の酸化的損傷(ハインツ小体を含む)などの原因で起きる。ハインツ小体はMetHb上昇の2日以降に認める場合が多い。ハインツ小体の出現及び溶血性貧血に随伴する網状赤血球増多および骨髄造血能亢進は、いずれもARfD設定の指標になると考えられるが、単回暴露後の血液指標は経時的変化を示す場合が多い。これらARfDの設定に関与する諸点については、農薬等の化学物質の短期暴露後の血液学的影響を例示し、問題点等を含めて考察したい。
     ARfDの設定にあたっては、あらゆるデータを収集し、作用メカニズムを理解した上で進めること、血液学的には必要に応じて反復投与試験等の初期段階で採血して毒性情報が得られれば、より信頼性の高いARfD値を導くことが可能と考えられた。
  • 山田 友紀子
    セッションID: S7-4
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    WTOのSPS協定において、食品安全に関わる国際規格基準作成機関と位置づけられているCodex委員会の下部組織の一つに残留農薬部会がある。この部会の主要な任務は、食品中の最大残留農薬基準の設定と、そのためのサンプリング・分析法を決定すること等である。食品が基準に整合しているかを決定するためには、サンプルを抽出し分析する。多くの場合、コンポジットサンプルを分析するが、コンポジットを構成するユニットの残留農薬濃度は一定ではないため、コンポジットサンプルの分析結果を超える濃度で残留農薬を含むユニットも存在する可能性がある。このことは、コンポジットサンプルが基準に整合していても、基準を超える残留農薬濃度の食品を摂取する可能性があること、その農薬が急性毒性を持つ場合、健康影響を検討する必要があることなどを示唆し、Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides (JMPR)による急性参照用量の設定および短期経口曝露評価につながった。急性参照用量は、JMPRが多くの農薬に設定しているが、Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives(JECFA)もいくつかの動物薬(注射部位に関連)およびDONなどの汚染物質について設定している。短期経口曝露評価の検討は、1995年に開催されたJoint FAO/WHO Consultation on Predicting Dietary Intake of Pesticide Residuesに始まる。いくつかのConsultationと多くの改善を経て、現在の短期経口曝露評価方法が使われている。最悪の摂取シナリオを想定しており、各々の食品について、1ユニットの重さ、摂取調査における97.5パーセンタイル摂取値(摂食者のみの97.5パーセンタイル)、摂食者の平均体重、基準に基づく規制下における最大残留濃度等を用いて算定され、各々の基準が妥当なものかどうかの指標とされている。ユニットの重さが25 g未満の場合、ユニットの重さが25 g以上かつ97.5パーセンタイル摂取値以上または以下、バルクまたはブレンドの場合の4つにケース分けされている。
シンポジウム8
慢性毒性試験結果からの発がん性予測
  • 久田 茂, 澤田 繁樹, 工藤 哲, 和藤 英司, 熊澤 俊彦, 森山 賢二, 三島 雅之, 笠原 義典, 鬼頭 耀子, 井上 健司, 青木 ...
    セッションID: S8-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    米国研究製薬工業協会(PhRMA)は過去30年間に試験が実施された182医薬品について、がん原性試験、ラット慢性毒性試験及び遺伝毒性試験等のデータを加盟企業から収集して解析した。その結果、遺伝毒性、ホルモン作用(内分泌系器官やホルモン濃度の変化)、ラット慢性毒性試験における肥大/過形成あるいは前がん病変のいずれも陰性であれば(NEGCARCRat基準)、ラットがん原性が陰性である比率が82%と高く、この基準を満たすがラットがん原性が陽性の14化合物(False Negative、FN)ではこれらの結果のヒトへの外挿性が低いとされた。さらに、日本製薬工業協会は64化合物、米国食品医薬品局は51化合物について同一の調査を実施し、PhRMAと同様の結果が得られた。一方、NEGCARCRat基準の問題として、第一に肥大/増殖性病変を部位に係わらず腫瘍発生予測の指標とするwhole-body approachが挙げられる。しかし、発がん標的組織に肥大/過形成が見られなかったケースでも、遺伝毒性のみ陽性の化合物を除いて、薬理あるいは毒性作用により腫瘍発生機序の説明が可能であり、whole body approachの必要性はなかった。また、既知の非遺伝毒性発がん機序により、多くの場合に発がん標的組織において過形成等の組織変化が誘発されると考えられる。第2の問題は偽陰性(FN)化合物の存在であるが、薬理作用に起因する発がんを考慮するとFN化合物の数が減少することから、残されたFN化合物の毒性学的意義が重要になる。第3の問題はNEGCARCRat基準では遺伝毒性コアバッテリー試験の一つ以上が陽性の場合にがん原性試験を必要とする点が、遺伝毒性の総合的評価と矛盾することである。ICH S1がん原性試験ガイドライン改定の専門家作業部会ではさらなるデータ解析を行い、薬理作用及びNEG CARC Rat基準等によるがん原性陽性及び陰性の総合的な予測及び実施価値のないがん原性試験を省略する基準等について議論される。
  • 西川 秋佳, 野中 瑞穂, 小川 久美子
    セッションID: S8-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    発がん性は最重篤な毒性の一つであり、現行の医薬品試験法ガイドラインでは1種のげっ歯類を用いる長期がん原性試が必須となっている。しかし、最近の調査では、慢性毒性試験で過形成、肥大等のがん関連病変がなく、遺伝毒性陰性で、ホルモン活性のない医薬品はラット2年間試験で発がん性を示さない可能性が高いとの成績がある。一方、薬理作用から発がん性を凡そ予測できるとする解析結果もある。このような特定の要件を満たせば、ラット2年間試験を省略できるとする理念に基づき、ICHS1の改定をめざす動きが正式に始まりそうである。ラット2年間試験を省略する場合には、安全性を担保するための追加試験なども具体的に検討する必要があり、発がん性試験の要件に関するS1Aだけでなく、試験方法に関するS1Bの改定も必要となるため、改定するガイドラインはS1となる可能性が高い。6月の福岡での専門家会合で下記の点について議論すべきとされている。(1) 薬理作用の情報を発がん性の予測に活用する方策及びそれを確認するための追加の解析方法、(2) 毒性学的判定基準(慢性毒性試験で発がん関連病変なし、遺伝毒性陰性及びホルモン作用なし)や薬理学的なoff-targetの判定基準を発がん性の予測に活用する方策、(3) ラット2年間試験を省略する場合、安全性を担保するために必要とされる追加の情報、(4) げっ歯類の慢性毒性試験では検出されず、ラット2年間試験のみで検出される非腫瘍性病変のヒトへの外挿性評価及びそれが影響する試験法の運用、(5) 医薬品開発の過程においてがん原性試験成績が重要視されるタイミングに関する製薬企業と規制当局間での調整、(6) 新たながん原性試験の方策が決定された場合、プロスペクティブな評価の必要性。シンポジウムでは、福岡会合での進捗を報告するとともに、当面の課題と克服すべき点について議論したい。
  • 三森 国敏
    セッションID: S8-3
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    新しい医薬品のがん原性試験ガイドラインがICHで1997年に策定され、ラットの2年間がん原性試験に加えて遺伝子改変(Tg)マウスを用いた短期がん原性試験からもがん原性が評価できるようになった。一方、そのガイドラインの策定から約15年が経過し、Tgマウスの欠点も明らかとなり、また、2年間のがん原性試験においても種々の問題が派生してきている。例えば、rasH2マウスやp53 ヘテロ欠損マウスは遺伝毒性発がん物質に感受性が高いが、一部のin vitro遺伝毒性試験で陽性で、Tgマウスでの短期がん原性試験で陰性の場合、長期がん原性試験が必ずしも陰性となる保証はないとの指摘がなされている。また、従来の遺伝毒性試験が陰性で、長期がん原性試験が陽性であった医薬品の場合は、ビッグブルーマウスの遺伝子突然変異試験のように、in vivo遺伝毒性試験を追加してその作用が遺伝毒性によって生じたものかを明確にせざるを得ない場合もある。一方、追加in vivo遺伝毒性試験で陰性であった場合は、その発癌促進作用の機序解明が必要となるが、必ずしもその機序を解明するための動物モデルが開発されておらず、さらなる機序解明ができない場合もある。最近gptデルタラットが開発され、一つの試験系で同一臓器での遺伝子変異と発がんとの関連性を明確にすることができる。この試験系では、従来のような遺伝毒性とがん原性試験を別々に実施することはなくなり、今後の遺伝毒性発がん物質を検出できる試験系として有用であると思われる。
     反復投与毒性試験から発がんの懸念がない場合は、ラットの長期がん原性試験を省略できるとの新しいガイドラインがICHから提案されているが、上記のように、がん原性を評価する試験系においても種々の問題点が派生してきており、医薬品開発の迅速化を求めるために本来のリスク評価が疎かになるようなことは絶対に避けるべきである。
シンポジウム9
薬物性肝障害―最新知見を基に
  • 寺西 宗広
    セッションID: S9-1
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    肝臓はもっとも毒性標的となる可能性の高い器官の一つであり、肝毒性は医薬品の開発中止、黒枠警告、販売中止に至る主要な原因の一つである。このような肝毒性への懸念から、米欧当局より肝毒性に関するガイダンス・ガイドラインが出されている。肝毒性はどの研究開発段階でも発現し得るが、肝毒性のポテンシャルを可能な限り早期に評価し、安全域、回復性、モニタリングマーカー、種差、類薬比較、リスク・ベネフィット分析等を通じて、go/no-goを決定することが重要である。しかし、被験者数の限界もあり、市販後に初めて検出されるような特異体質性薬物毒性(IDT)は、通常の毒性試験では予測が困難で、臨床試験段階で少数例に発現したとしても薬物との関連性を認識するのが困難である。一方で、IDTで警告、販売中止に至るケースが多いため、IDTを回避する方法を見出すことは患者、医療者、当局、製薬企業のいずれにとっても重要であり、試行錯誤的な模索検討が続いている。化学的に反応性の高い薬物(反応性代謝物)は肝細胞内のタンパク、核酸に共有結合し細胞の機能障害、ストレス、細胞死、免疫反応を惹起しIDTを発現する可能性が考えられている。 このIDT発現機序の詳細は不明ではあるが、GSHトラッピングアッセイ、CYP阻害アッセイ、共有結合量測定等を段階的に実施し、反応性代謝物の生成を低く抑えたり、投与用量自身を低く抑えたりすることはIDT回避のための賢明な戦略と考えられる。肝毒性を鋭敏に検出するためmiRNAなど新規バイオマーカーやオミクスの活用も検討されているが、バリデーションされている必要があり、依然ALT、AST、T.BIL、ALP等従来の臨床検査パラメータ、病理組織学的検査を基に総合的に検討することが肝毒性検出には重要である。その一方で特定のタイプのIDTに関与するヒト遺伝子多型の知見も徐々にではあるが得られるようになってきて、IDT回避のツールとなる可能性に期待が高まってきている。
  • 横井 毅
    セッションID: S9-2
    発行日: 2012年
    公開日: 2012/11/24
    会議録・要旨集 フリー
    薬物性肝障害発現には個人差が大きく、大規模臨床試験、または市販後に初めて検出されることがあり、患者保護と企業経営上の問題を大きくしている。この問題を解決する為には、ヒトにおける予期せぬ肝障害を予測する動物モデルの確立が急務である。動物モデルを駆使して、副作用発症メカニズムを解明して、初めてin vitroの試験系の構築と評価、そしてヒトへの外挿が可能になると考えられる。
     我々は免疫学的な因子に注目して研究を進めてきた。正常成獣マウスへの薬の投与法を工夫し、肝障害モデルを作製することにから研究を進め、ハロタンにはTh17細胞が関与することを明らかにした。その後、ジクロキサシリン、フルタミドやメチマゾールによる肝障害発症にはTh2細胞が関与しており、さらに、α-ナフチルイソチオシアネート、ジクロフェナクやフルクロキサシリンによる肝障害にはTh17細胞が関与することを明らかにした。こうした検討結果は、いずれも単回経口投与による急性毒性モデルである。
     鎮痙薬であるカルバマゼピン(CBZ)は、非常に稀に肝障害を惹起し、アレルギーや炎症を伴う臨床報告もある。我々はCBZを正常成獣マウスに経口連続投与する方法を工夫して、重篤な肝障害発症モデルを確立した。CYP阻害薬を併用投与すると肝障害が増悪し、血中濃度の測定から、3位水酸化CBZ代謝物の関与が強く示唆された。さらに、発症機構を解析した結果、S100A8/A9を介したTLR4の関与が考えられ、各種抗体を用いたin vivo中和試験は、肝障害を充分に抑制した。さらに、Th17細胞が肝障害の増悪に主たる役割を担っていることを明らかにした。このような肝障害モデルマウスの作製と発症機序解明研究は、臨床における特異体質性薬物性肝障害の回避に繋がる情報を提供できると考えられる。
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