Introduction: Reactive sulfur species (RSS), such as cysteine persulfide (CysSSH) and glutathione persulfide (GSSH), exhibit high antioxidative property, playing a crucial role in suppressing oxidative stress. The gastrointestinal tract serves as a major site for sulfur metabolism, with gut bacteria contributing to this process. However, it is unclear if commensal gut bacteria produce RSS. We hypothesized that RSS produced by gut bacteria influence the host's antioxidant capacity by contributing to the systemic RSS pool and also serve to protect the gut microbiota from oxidative stress.

Results: The systemic levels of RSS were lower in germ-free mice compared to SPF mice. Gut bacteria enzymatically produced CysSSH from cystine. The plasma RSS level was increased in mice given cystine, which was strongly suppressed by gut microbiota depletion. Single bacterial cultures showed high CysSSH production capacity in Lachnospiraceae and Ruminococcaceae families. Administration of cystine protected mice from concanavalin-A-induced oxidative liver injury in a gut-microbiota-dependent manner. Furthermore, RSS-donor increased RSS levels in the bacteria with low CysSSH production.

Discussion and Conclusion: We identified gut microbes that produce CysSSH from cystine, thereby influencing the systemic RSS level in the host. Our study proposes new mechanisms by which gut-microbiota-derived metabolites contribute to enhancing host antioxidant capacity. Additionally, RSS may enhance antioxidative capacity in bacteria, suggesting a novel gut bacterial interaction facilitated by RSS.

【目的】光線力学療法（PDT）は、腫瘍親和性光感受性物質とレーザー光照射による光化学反応を利用し、腫瘍細胞内に活性酸素種（ROS）を発生させ、腫瘍細胞を死滅させる治療法である。我々はこれまでに、光感受性物質としてタラポルフィンナトリウム（TS）を用いたPDT（TS-PDT）が、悪性度の高い脳腫瘍の一つであるグリオブラストーマ（GBM）に対して抗腫瘍効果を示すことを明らかにしてきた。最近、我々はレチノイドの一種であるレチノールが抗がん剤のGBMに対する抗腫瘍効果を高めることを見出した。本研究では、より効果の高いGBMへの治療法の開発を目指し、レチノールとTS-PDTの併用によるGBMに対する抗腫瘍効果を検討した。

【方法】ヒトGBM由来U251細胞またはT98G細胞をTSで2時間処理後、レチノールもしくはレチノイン酸で処理し、レーザー光（664 nm、1 J/cm2）を照射して、24時間後にCCK-8 assayにより細胞生存率を測定した。

【結果・考察】単独処理では細胞毒性を示さない濃度のレチノールで処理したU251細胞において、TS-PDTの殺細胞効果の増強が確認された。また、レチノールの活性代謝物であるレチノイン酸もTS-PDTのU251細胞に対する殺細胞効果を高めることが確認された。したがって、レチノイドがTS-PDTのGBMに対する抗腫瘍効果を増強すると考えられる。また、U251細胞より薬剤耐性の強いGBM細胞であるT98G細胞においてもレチノールおよびレチノイン酸はTS-PDTの殺細胞効果を増加させた。以上の結果から、レチノイドがヒトGBMに対するTS-PDTの抗腫瘍効果を増強する併用薬候補となり得ると考えられる。なお、レチノイドによる増強作用メカニズムについて検討を進めている。

【目的】長鎖アシルCoA合成酵素（ACSL）4は、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸をはじめとする高度不飽和脂肪酸（HUFA）を良い基質とするアシルCoA合成酵素であり、膜リン脂質中のHUFA含有量を調節することで鉄依存的な細胞死であるフェロトーシスに関与することが知られている。我々はACSL4欠損（KO）マウスを用いた検討で、パラコートやメトトレキサートによる肺毒性が軽減することを報告してきた。本研究では、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルを用いて、線維化の過程におけるACSL4の役割を解明することを目的とした。

【方法】マウスにブレオマイシン3 mg/kgを経気管支投与することで肺線維症モデルを作製し、一定時間後に血中酸素飽和度（SpO2）を測定し、さらに気管支肺胞洗浄液ならびに肺組織を得た。摘出した肺組織中の脂質過酸化物はLC-MS/MSを用いて定量し、mRNA発現量はリアルタイムPCRで測定を行った。肺組織中のヒドロキシプロリンを比色定量した。肺組織からパラフィン切片を作製し、マッソントリクローム染色や免疫組織化学染色による検出を行った。

【結果・考察】ブレオマイシン投与後14日目以降では、WTマウスの肺でホスファチジルコリン（16:0/20:4）由来の過酸化体が増加したが、KOマウスではこの増加が有意に抑制されていた。同様に、投与後14日目にはWTマウスの肺組織で、線維症マーカーであるヒドロキシプロリンやα-SMA、ならびにE-カドヘリンやIGF-1のmRNA発現が増加していたが、KOマウスではこれらの発現は抑制されていた。さらにWTマウスではSpO2が投与後14日目から減少するが、KOマウスでは高値を維持していた。以上の結果から、ACSL4欠損によりブレオマイシン投与後の脂質過酸化物の生成は抑制され、この抑制により炎症反応や持続的な組織障害が軽減されたと考えられる。

The purpose of this study was to determine the effect of hydrogen water intake on exercise endurance in mice, with a focus on the antioxidant properties of hydrogen and its potential to improve metabolism.

In the study, 8-week-old male C57BL/6J wild-type mice were divided into two groups: one given distilled water and the other given hydrogen water. We used the treadmill all-out test to examine the physical endurance capacity of the mice. We also measured muscle damage indicators, oxidative stress markers, and innate immune response（NF-κB） in the tibialis anterior muscle using blood biochemical analysis and Western blotting techniques. In addition, AMPK activation, levels of the lipase ATGL, and expression of CPT1b, a key enzyme in β-oxidation, were analyzed.

The results showed that after 4 weeks, mice consuming hydrogen water had significantly improved endurance capacity compared to the control group. These mice also showed a reduction in markers of muscle damage, a decrease in oxidative stress, and a suppression of NF-κB. Importantly, the hydrogen group also showed reduced body fat percentage, activated AMPK, and lower levels of blood-free fatty acids with increases in CPT1b and ATGL levels.

These results suggest that long-term intake of hydrogen water could potentially improve exercise endurance by attenuating oxidative damage and inflammation in skeletal muscle through the antioxidant effects of hydrogen. In addition, the study highlights the role of hydrogen water in enhancing fatty acid utilization, which could contribute to improved lipid metabolism in exercise.

Cardiac remodeling involves compensatory alterations in heart mass, geometry, and function in response to hemodynamic stress or cardiac injury. Previous studies have attributed myocardial variations to the size of cardiomyocytes. Recently, supersulfide, a sulfur-catenated molecule, has emerged as a crucial regulator of cardiac robustness. Our earlier findings revealed a heightened presence of supersulfide in healthy mouse hearts, which undergoes catabolism to hydrogen sulfide (H2S) following myocardial infarction. Despite these observations, the precise role of supersulfide metabolism in governing cardiac cellular functions remains elusive. In this study, we use cardiomyocytes isolated from ventricular of neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs). We found that supersulfide, but not H2S, positively regulates the size of cardiomyocytes. qPCR results elucidated supersulfide anabolism related gene, Solute carrier family 7 member 11 (Slc7A11), may have involved in regulating size of cardiomyocytes. Slc7A11 gene knockdown efficiently induced cardiomyocyte atrophy. These findings suggest that supersulfide plays a key role in regulating cardiac cell remodeling induced by receptor stimulation. The anabolism and catabolism of supersulfide in cardiac cells could provide a new strategy for the treatment of pathological cardiac remodeling.

Calcium ions (Ca2+) and reactive oxygen species (ROS) serve as pivotal signaling molecules in diverse vascular processes, including contraction and proliferation. However, the precise mechanism through which ROS modulate Ca2+ signaling in vascular smooth muscle cells (VSMCs) remains largely unexplored. This study delved into the contribution of mitochondrial ROS to Ca2+ transients in the context of angiotensin II (Ang II) signaling. Ang II was observed to induce a predictable elevation in both Ca2+ levels and ROS generation in rat VSMCs. Notably, Ang II rapidly triggered mitochondrial fission, a process inhibited by both a Ca2+ chelator and intracellular Ca2+ depletion, indicating its dependency on Ca2+ signal. Ang II prompted the formation of mitochondrial ROS detected by mitoSOX and HyPer7-MLS. Treatment with mitochondrial ROS scavengers, such as mitoTEMPO and mitoQ, attenuated Ca2+ transients and mitochondrial fission, implicating mitochondrial ROS in these processes. Further exploration revealed that Ang II activated dynamin-related protein 1 (Drp1), leading to its translocation from the cytosol to the mitochondria, and inhibition of Drp1 with Mdivi-1 mitigated mitochondrial ROS production and Ca2+ elevation. Indeed, interventions targeting Drp1 or mitochondrial ROS attenuated vascular contraction and acute elevation of blood pressure induced by Ang II. In conclusion, mitochondrial ROS and Drp1 play crucial roles in Ang II-induced Ca2+ signaling in VSMCs, thereby modulating vascular contraction and blood pressure regulation.

Long-term exposure to inorganic arsenic causes not only skin symptoms but also various toxicities, such as anemia. However, the impacts of low levels of inorganic arsenic have not yet been elucidated. We reported that exposure to low levels of arsenate, a pentavalent arsenic, affected the production of erythropoietin (EPO) in HepG2 cells. This study investigates the impact of low-level long-term arsenate exposure on EPO production both in vitro and in vivo. In vitro experiments involved subculturing HepG2 cells for three weeks and treating them with arsenate at levels ranging from 1–10 µM. Compared to untreated cells, EPO production and responsiveness to EPO production stimuli were reduced. In the in vivo experiments, mice were exposed to arsenate at a dose of 60 nmol of arsenate per day for two months. Compared to untreated mice, treated mice showed decreased EPO mRNA levels, although there were no differences in body weight or hematocrit. The stimulating impact of EPO production on liver and kidney cortical cells recovered from mice was significantly reduced in arsenate-treated mice. In HepG2 cells treated with arsenate, while ROS production increased, the response to remove oxidative stress was also enhanced, suggesting that the promotion of EPO production by ROS production was attenuated. There is a possibility that long-term low-level arsenate exposure may not generally be harmful, but it might cause anemia and other health problems by preventing the body from producing enough EPO.

【Background】

Linezolid (LZD) can cause thrombocytopenia associated with high LZD plasma concentrations due to renal dysfunction, etc. This study aimed to clarify whether the rate of achieving LZD concentrations that avoid the toxicodynamic target, that is, the safety target achievement rate, can predict the onset of thrombocytopenia.

【Methods】

Subjects were adult patients hospitalized at Shimane University Hospital, who received LZD treatment. Based on predicted two PK parameters (Parameters A and B) for each patient, the safety target achievement rate (LZD trough concentration of less than 8 μg/mL, at which the risk of thrombocytopenia is low) was calculated. Univariate, multivariate and receiver operating characteristic (ROC) analyses were performed to assess the relationship between patient characteristics including the safety target achievement rate and the onset of thrombocytopenia.

【Results and Discussion】

Patients (n = 77) aged 72 ± 11 years old and weighing 56.7 ± 10.9 kg, with a creatinine clearance of 60.5 ± 47.2 mL/min, were analyzed. A multivariate analysis of several factors stratified with the cutoff values obtained by ROC analysis revealed that the duration of LZD therapy and the safety target achievement rate were significant factors (Parameter A and B: odds ratios for the duration of LZD therapy were 7.436 and 4.712; odds ratios for the safety target achievement rate were 0.060 and 0.167, respectively).

【Conclusion】

The risk of LZD-induced thrombocytopenia, which increased with the duration of LZD therapy, may be predicted using the safety target achievement rate.

【目的】

　抗生物質バンコマイシン（VCM）は院内感染治療の切り札の一つであるが、急性腎障害を頻発するという臨床上の大きな問題がある。しかしその詳細な発症機構は十分に解明されていない。一方、時刻を考慮した薬剤の投与はしばしば副作用を軽減する (時間薬理学)。これは概日時計機構に制御される多くの生理機能に概日リズムが認められるためである。VCM誘発性腎障害と概日時計機構の関連は未解明であるため、時間薬理学を基盤とした解析が副作用軽減とその機構解明につながると可能性がある。そこで本研究では、VCM誘発性腎障害に及ぼす概日時計機構の影響について解析を行った。

【方法】

　片方の腎臓を摘出したマウス（UNx）およびマウスの腹腔マクロファージ様細胞株であるRAW264.7細胞を用いて各種解析を行った。

【結果・考察】

　明期である9:00または暗期である21:00にVCMを尾静脈投与したUNxマウスの腎臓病態を評価した。その結果、9:00投与時のみ腎障害が認められた。この原因を探索するため、VCM投与後の腎臓を対象にオミクス解析を実施したところ、骨髄性白血球の関与が示唆された。そこで、腎臓に浸潤した好中球およびマクロファージの細胞数をフローサイトメトリー法により測定した結果、マクロファージ (Mφ)の細胞数にのみ投与時刻依存的な差異が認められた。さらに、クロドロン酸リポソームを用いてMφを特異的に死滅させた際の腎臓病態を評価した結果、腎障害が抑制された。そこでMφの概日時計機構に着目し、デキサメタゾンによる時計遺伝子の同調 (DEX shock)を行ったRAW264.7細胞を用いた検討を行った。その結果、VCM曝露による炎症性サイトカイ発現誘導はDEX shock後の経過時間によって有意に異なっていた。本研究の成果は、概日リズムを考慮したVCMによる治療の最適化および単球/マクロファージを標的としたVCM腎障害治療法につながることが期待される。

【背景】Benzimidazole（nitazene）類は、近年、違法薬物市場に現れ濫用事例が急増している合成オピオイドのサブクラスである。我々は種々の危険ドラッグの行動毒性試験を行う過程で、マウスにおけるbenzimidazole類の毒性を確認してきたが、それらの作用機序や、薬物動態、特に脳内局在は不明であった。本研究では、本邦で2022年に麻薬指定されたmetonitazene（MNZ）のマウス脳内局在を明らかにすることを目的とした。【方法】8週齢のC57BL/6J雄性マウスにMNZを10 mg/kgで単回腹腔内投与後、0、5、15、60、90、240および480分の時点で剖検した（N=3/時点）。血液と脳の一部はLC-MS/MS分析に供し、同じ脳サンプルの矢状断の凍結切片をDESI-MSIにより解析した。【結果・考察】MNZの濃度は血中では投与後5分で、脳内では15分で、それぞれ最も高くなり(血中1.13 µg/mL、脳内2.63 µg/g)、その後速やかに減少し、480分では不検出となった。DESI-MSIのMS/MS測定の結果、MNZのプロダクトイオン（m/z 100.11）は5分時点から脳内で観察され、15分で強度はピークに達し、240分まで確認された。シグナルは脳全域に分布したが、脳幹（中脳・橋・延髄）で特に強いシグナルが、次いで視床・視床下部に強いシグナルが見られた。μ-オピオイド受容体は脳内に広く分布するが、今回、シグナルが強く認められた部位は、鎮痛作用や呼吸抑制あるいは薬物依存の形成に重要な領域である。今回と同程度あるいは低用量で実施したマウス行動観察試験や条件付け場所嗜好性試験において、実際にこうした作用が認められており、MNZによる神経症状の発現は、μ-オピオイド受容体を介することが強く示唆された。

腎臓は薬物の排泄に関わっており、近位尿細管では特徴的な薬物の分泌・再吸収が行われているが、尿細管細胞内では薬物濃度が上昇しやすく、毒性を発現しやすい。シスプラチンによる腎毒性やピオグリタゾンによる浮腫には性差の存在が知られているがその詳細な形成機構は不明である。多くの薬剤はトランスポーターにより、分泌・再吸収されるが、トランスポーターなどの膜タンパク質は取り扱いが難しく、タンパク質発現量を網羅的に測定することは困難である。そこで、共同研究者が確立した膜タンパク質に特化した膜プロテオミクスを用いることで、腎臓における薬物副作用の性差形成機構の解明を目指した。

性差は性ホルモン・性染色体の影響を受けることから、これらの影響を区別できる性転換マウス(FCG)マウスを用いた。FCGマウスの腎臓から近位尿細管刷子縁膜小胞を精製し、尿素処理を行なった後、nano LC-MS/MS(Q-Exactive)を用いて膜プロテオミクスし、合計で約5,000種類のタンパク質プロファイルを取得した。また、RNA抽出を行い、マイクロアレイ測定をすることで遺伝子の転写プロファイルを取得し、両プロファイルから性ホルモン、性染色体由来の性差形成分子を同定した。性差のあったSLCトランスポーター、ABCトランスポーターを中心に薬物輸送との関係を調べたところ、シスプラチンの輸送に関わる性差のあったトランスポーターを2つ発見した。この2つのトランスポーターには性染色体由来・性腺由来の性差がそれぞれ存在し、シスプラチンによる腎毒性の死亡率が男性で高く・高齢になると死亡率が逆転する臨床結果を説明することが可能であった。

本研究結果は性差医療の学術的根拠にもなりうる可能性があり、早期のデータ公開ならびに、その他の薬物性腎毒性の性差形成について詳細な検討を行う予定である。

【背景・目的】

薬物性肝障害は臨床試験の中止や市販後の撤退の主たる原因となるため、この可能性を有する薬物を前臨床において適切に評価し、有望な化合物を選定することが求められる。cccDNA modulatorとして新規に合成されたCDM-YはIFNα様作用を有する経口投与可能な新規B型肝炎治療薬候補品の1つである。本化合物について当研究室が開発した胆汁酸依存毒性評価系であるBAtox を実施したところ毒性発現を認めた。そこで本研究では、CDM-Y と胆汁酸併用による肝細胞死機序についてi) 胆汁酸排泄経路ならびにii) 薬理作用の延長に着目して解析することを目的とした。

【方法・結果・考察】

1. 胆汁酸排泄経路に着目した検討

ヒト肝キメラマウスより単離されたHepaSH細胞を用いてCDM-Yの直接的なBSEP阻害ならびに胆汁酸抱合阻害能の有無を評価したところ、各評価の陽性化合物と比較してCDM-Yによる阻害は認めなかった。

2. CDM化合物の薬理作用に着目した検討

種々のCDM化合物を検討した際に、薬理活性が最も高いCDM-Yにて毒性が強く見られることから薬理作用に着目した検討を実施した。細胞表面受容体に会合するTyrosine kinase 2（TYK2）とJanus kinase 1（JAK1）をsiRNAにてノックダウンしたHepaSH細胞にBAtoxを実施したところ、CDM-Yによる毒性についてsiTYK2条件では毒性が増強し、siJAK1条件では毒性が減弱した。またCDM-Y処置後の細胞にてwestern blotでTYK2ならびにJAK1のリン酸化を確認したところ、JAK1のみリン酸化を認めた。

【結論】

CDM-Yと胆汁酸共存化で惹起する細胞毒性はJAK1のリン酸化を介して引き起こされることが示された。本結果を踏まえ毒性学的観点からは、JAK1とTYK2のシグナルバランスを考慮し、CDM-Y誘導体創製を進めていく必要があると思われる。

我々は、抗がん剤であるシスプラチン（CDDP）による腎障害の詳細な機序を解明するために、マウス近位尿細管S1, S2, S3領域由来不死化細胞（S1, S2, S3細胞）を用いて検討を行ってきた。これまでの検討から、S1,S2細胞と比較してS3細胞がCDDPに対して高感受性を示すことを見出している。また、S3細胞にCDDPを低濃度から添加することでCDDPに約14倍の耐性を獲得した細胞（Cis-R細胞）を樹立した。そこで本研究では、S3細胞とCis-R細胞の比較を行うことでS3細胞のCDDPに対する脆弱性に関わる機序を明らかにすることを目的とした。

S3細胞とCis-R細胞においてCDDP添加後の細胞内Pt量を比較したところ、Cis-R細胞において高い細胞内Pt量を示した。一方、CDDP添加後のDNA中のPt量を比較したところ、Cis-R細胞において低い値を示した。CDDPは、細胞内においてタンパク質と結合することが知られていることから、「Cis-R細胞では、細胞質中にCDDPを捕捉するデコイタンパク質が高発現しており、それによりCDDPによる毒性が低くなっているのではないか」と仮説を立てた。マイクロアレイでコントロール細胞と比較してCis-R細胞でmRNA量が高く発現している遺伝子群を抽出したところ、CDDPと結合することが報告されているセレノシステイン含有タンパク質であるセレノプロテインP（SeP）がCis-R細胞において高発現していた。S3細胞に亜セレン酸を添加することで細胞内SePが誘導され、CDDPによる細胞毒性が抑制されることを検出した。また、S3細胞への亜セレン酸の添加で誘導されるCDDPに対する細胞毒性抑制作用が、SePのノックダウンによって消失した。これらの結果から、Cis-R細胞における耐性化の要因の一つとしてSePの関与が示唆された。

【背景と目的】持続可能性、経済性、及びハイスル―プット性などの観点から幅広い用量域及び多様な化合物に適用可能なin vitro毒性試験の重要性が高まっている。上記の試験にて、多くの場合は水系に被験物質を処理するが、溶解性の観点から試験への適用が困難な事例が認められる。そこで、生体適合性が高い新規溶媒の探索研究を行い、双性イオン液体（ZIL）がエラグ酸など一部の食品成分の溶解性を改善させ、in vitro試験においてDMSOと比較し低毒性であり、遺伝毒性を有さないことを見出した。ZILを安全性試験に用いることの利点、および適用限界の見極めを目的として以下の検証を実施した。

【方法】エラグ酸を1%DMSO、1％ZIL、あるいは2％ZILに溶解させ、HepG2細胞に0、30、100、300、および600 μMにて24 h処理した後の細胞生存率を測定した。また、薬物相互作用の検討を目的として、ヒト肝由来ミクロソーム、およびヒト凍結肝細胞を用いたCYP阻害試験、ヒト凍結肝細胞を用いたCYP誘導試験、ならびにCaco-2細胞を用いたP-gp阻害試験を実施した。

【結果】ZILとの共処理により、エラグ酸の析出による細胞障害が緩和され、肝毒性のハザード予測成績が改善した。ZILはヒト肝ミクロソーム、およびヒト初代肝細胞いずれにおいても各CYP分子種に対する阻害活性が認められ、ヒト初代肝細胞に対して各CYP分子種に対する誘導作用が認められた。一方で、P-gp阻害活性は認められなかった。

【結論】ZILは食品関連物質の新規溶媒として、安全性、および溶解性改善の観点から有用であり、難溶性物質の安全性試験成績を改善することが示唆された。一方で、CYPの代謝活性を有する試験系の溶媒として使用する際には、代謝活性への影響について注意が必要であることが明らかになった。

【目的】

血管局所刺激性は注射剤開発において安全性リスクの一つである。非臨床で血管局所刺激性を評価する方法には一般毒性試験内での投与部位局所の肉眼や組織評価、またはウサギ局所刺激性試験における耳介の病理組織学的検査等があるが、in vitroでの評価系として標準化された手法は確立されていない。本研究ではヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いた経内皮電気抵抗（TEER）値の変動を指標として、in vitroでより早期かつ簡便に血管局所刺激性を評価する系の構築とその有用性検討を行った。

【方法】

HUVECをトランスウェルに播種後、TEER値を連続的に計測しプラトーに達するまで約60時間インキュベートした。その後培地を除去し、評価溶媒と培地を6:4で混合した溶液を添加してTEER値の変動を測定した。評価溶媒としては、社内のサルの一般毒性試験やウサギ後耳介静脈での局所刺激性試験において刺激性が強いまたは弱いと評価された溶媒に加え、刺激性が強い溶媒と同等のpHかつ注射剤として市販されているパシルとアシクロビルを基準製剤として使用した。TEER値の評価は評価溶媒の想定投与時間である1時間後に行った。

【結果・考察】

サルやウサギでの血管局所刺激性の強弱とHUVECのTEER値の低下の有無には相関が認められ、本評価系がin vivoの血管局所刺激性を簡易的に評価する系として有用である可能性が示された。本系はin vivo試験の代替として血管局所刺激性を評価する系として3Rsに貢献することが期待される。

Information obtained from biodistribution tests conducted in non-clinical studies is important in the development of regenerative medicine products.

Some evaluation methods have been reported for detecting administered human cells, including quantitative PCR (qPCR), flow cytometry (FCM), and immunohistochemical staining (IHC). Since each product has its strengths and weaknesses, it is necessary to develop an optimal evaluation method for each product.

In a previous study, we measured human mesenchymal stem cells (hMSCs) in the blood of mice using qPCR and FCM methods. As a result, differences in hemodynamics were observed depending on the time elapsed after administration, suggesting that differences in measurement methods may have an effect.

In this study, we developed qPCR and IHC analysis methods to evaluate the distribution in mouse tissues, and compared the bio-distribution of hMSCs 30 minutes after administration.

In the qPCR method, the number of hMSC cells was calculated using the standard curve method and compared between each tissue, and 3931 to 4530 hMSC cells were detected in the lungs.

In the IHC method, immunostaining using anti-HLA (class 1 A, B, C) antibodies was performed on the lungs, liver, spleen, cerebrum and cerebellum, kidneys, and heart, and HLA-positive cells were found in the blood vessels of the lungs. It was seen here and there.

There is little knowledge of evaluating the same sample using different measurement methods, and it is hoped that the results of this study will help in selecting evaluation systems when developing regenerative medicine products.

【背景】腸内細菌は宿主と密接に関係しており、免疫応答や行動にも影響を与えることが明らかとなっている。また、腸内細菌は腸内環境の変化に鋭敏であり、摂取したものによって迅速に構成が変化する。本研究はこの鋭敏性に着目して腸内細菌叢の変化を解析することで、宿主に対する環境毒性物質の影響評価を目標とする。その前段階として、ニワトリ（ジュリア種、６週齢）に各環境毒性物質を投与し、腸内細菌叢の変化を解析した。

【方法】ニワトリを６羽ずつ６群に分け（DW群、コーン油群、鉛群、イミダクロプリド群、ワルファリン群、ナノプラスチック群）、それぞれ無毒性量を経口より単回投与した。投与一日前より隔離飼育とし、投与３日後まで毎日新鮮糞を採取した。採取した糞便は速やかに-80℃にて保存した。各糞便よりDNAを抽出し、細菌が持つ16S rRNAのV3-V4領域をターゲットとして次世代シークエンサーを用いて遺伝子解析を実施した。

【結果と考察】鉛群及びイミダクロプリド群、ワルファリン群でα多様性の有意な減少を認めた。鉛群ではLachnospiralesとOscillospiralesの割合が増え、投与３日後にはBacillalesの割合が増加した。イミダクロプリド群は主要な細菌叢組成はコントロール群と変わらなかったが、投与日より菌種が減少し、投与３日後には投与前と同程度となった。ワルファリン群においても菌種の減少が見られ、投与３日後でも回復することは無かった。ナノプラスチック群は鉛群同様に投与後にLachnospiralesとOscillospiralesの割合が増えたが、投与3日後にはLactobacillalesの割合が増加した。以上のように単回投与でも各環境毒性物質で特徴的な変動が見られた。この結果を野生鳥類に外挿するにはまだ多くの検討課題があるが、健康指標として活用できる可能性が示唆された。

【目的】

慢性腎臓病 (CKD)時の合併症のうち、特に心血管系疾患の発症は生命予後と深く関連している。このリスク要因の一つとして、CKD時に生じる「腸内細菌の乱れ」によって腸内での産生が増加するインドキシル硫酸 (IS)などの尿毒症物質が知られているが、血液透析による除去が困難であり治療法が求められる¹。我々は過去にこの産生増加にビタミンA (VA)の蓄積が関与することを発見した。しかしながら、腸内産生がなぜ増加するのか詳細な機構は不明である。そこで本研究ではVAの免疫を成熟させる栄養素としての側面に着目し、腸内細菌由来物質の産生増加機構について解析を実施した。

【方法】

ICRマウスの腎臓を5/6摘出後、8週間飼育することでCKDマウス (5/6 Nephrectomy: 5/6Nx)を作製し、各種解析を行った。mRNAおよび蛋白発現量は、それぞれリアルタイムRT-PCR法、ウェスタンブロット法により測定した。

【結果・考察】

我々はVA不含給餌を行った際に、5/6Nxマウスで生じる免疫グロブリンA (IgA)分泌異常およびIS等の尿毒症物質蓄積を予防できることを発見した。これは、5/6NxマウスにおいてVAの蓄積が腸管免疫の異常を引き起こしていることを示唆している。そこで腸管IgA産生細胞を対象とした解析を行った結果、5/6Nxマウスではパイエル板における樹状細胞のレチノイン酸分泌が亢進し、IgA産生細胞への分化反応である胚中心反応が促進されることを明らかにした。さらに、阻害剤投与による本経路の抑制は、5/6Nxマウス腸管のIgA量およびIS等の血中濃度を低下させた。

【結論】

以上の結果より、VAおよびIgAを介した新たな腎-腸連関機構を解明した。本研究のさらなる解析が、新規治療薬の開発に繋がることが期待される。

【参考文献】

1. Fukuoka K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2023.

【目的】リン（P）の調節は、腎臓、小腸、骨の3つの臓器で行われており、腎臓病患者では腎機能の低下により高リン血症に陥りやすい。本研究では、片腎摘出マウスにトリポリリン酸カリウム（K5P3O10）を給餌し、腎障害時におけるリンの恒常性について検討した。

【材料・方法】6週齢のC57BL/6Jマウスに右片腎摘出処置（UNx）を施し、1.5%K5P3O10を含む飼料を4または8週間給餌した（高P食給餌群）。対照群（低P食給餌群）及び偽処置群には0.3%K₅P₃O₁₀を含む飼料を給餌した。給餌期間終了後、血中Ca及びP濃度の測定、腎臓及び小腸のリン酸トランスポーター関連遺伝子（slc34a2a、slc34a2b、slc34a2c）や腎臓のビタミンD水酸化酵素（CYP24A1、CYP27B1）の遺伝子発現解析を行った。

【結果】摂餌量に群間差は認められず、Pの摂取量は給餌濃度に比例した。高P食群で血中P濃度が増加したが、血中Ca濃度に変化は認められなかった。遺伝子発現解析では、高P食給餌群で空腸のslc34a2b及び腎臓のCYP24A1の発現が低リン食給餌群に比べ増加傾向にあった。回腸においては群間に差はなかった。腎臓のCYP27B1は低リン食給餌群と比較して高リン食群で有意な増加が認められた。病理組織学的解析では、腎臓にはごく軽度の尿細管病変並びに線維化が見られたが、小腸には特に所見は認められなかった。

【考察】本実験系において、空腸でリン吸収に関わるトランスポーターの変動が確認されたことから、腸でのリンの吸収は空腸が主であることが示唆された。初期の腎障害下においては、リンの恒常性は腎臓ではなく空腸で調節していると考えられた。また、腎臓中のCYP27B1の発現量の増加が認められたことから、不活性ビタミンDが活性化されカルシトリオールの合成量が増加しているものと推察された。

近年、ヒトの細胞内には3,000種類以上のアセチル化タンパク質が存在することが示唆されており、細胞内の多様な生命現象を調節していると考えられている。最近、リジン残基はアセチル化に加えて様々なアシル化修飾を受けることが明らかになっている。リジンアシル化修飾は、脂肪酸などの内在性カルボン酸に由来するアシルCoA依存的に引き起こされるが、リジン残基を修飾するカルボン酸は生体内に存在する内因性カルボン酸のみだろうか？我々は日々、食品と共に様々な化合物に暴露されており、その中には、カルボン酸も含まれる。そこで、食品成分として摂取しているカルボン酸のうち、化学反応を介して生体内タンパク質のリジン残基に修飾するものがあるのではないかと仮説を立てた。様々な食品成分由来のカルボン酸について検討したところ、緑茶に特有のアミノ酸として知られるL-テアニンが細胞内でタンパク質に修飾される可能性を見出した。本研究は末端アルキンとアジドの選択的反応であるクリックケミストリーとLC-MS/MSを用い、L-テアニンによる新規リジンアシル化修飾タンパク質の探索を目的とした。細胞にアルキン標識したL-テアニンを処理し、タンパク質にアシル化修飾として取り込まれたL-テアニンアルキンを、蛍光アジドによるクリックケミストリーにより検出した。その結果、多くのタンパク質がL-テアニンにより修飾を受けていることを示唆する結果を得た。さらに、チェイス実験により、L-テアニン修飾は可逆的であることを見出した。現在、ビオチンアジドを用いたクリックケミストリーの手法によりL-テアニンが修飾するタンパク質の網羅的な探索を試みており、本発表で紹介したい。

　トランス脂肪酸とは、炭素-炭素間にトランス型二重結合を1つ以上有する不飽和脂肪酸の総称である。生体内で合成される脂肪酸の二重結合はシス型のみのため、食品の摂取を通して生体内に蓄積するが、その由来の違いから、加工食品中に多く含まれる「人工型」と、牛乳や肉などに多く含まれる「天然型」（反芻動物の胃の中の微生物が産生）の2種類に大別される。過去の疫学研究などから、特に人工型が、循環器系疾患、神経変性疾患、生活習慣病といった諸疾患の危険因子とされ、規制の対象となってきたが、その具体的な毒性発現機構は不明で、科学的根拠に乏しい。当研究室では、トランス脂肪酸が、関連疾患病態と密接に関連する細胞外ATP（自己由来の起炎性因子）、DNA損傷により誘導される細胞死（アポトーシス）を促進する作用と、その詳細な作用機構を明らかにしてきた。さらに、前者について、人工型のみが細胞死を促進することを見出し、報告したが、後者については、脂肪酸種ごとの毒性の有無は不明であったため、本研究ではその解明、および毒性の軽減方法の考案を目的として、以下実験を行った。

　ヒト骨肉腫細胞株U2OSなどの細胞株に対し、DNA損傷剤ドキソルビシンを処置したところ、エライジン酸などの人工型存在下で、細胞死の著しい促進、およびそのエフェクター分子であるMAPキナーゼJNKのリン酸化（活性化）の亢進が認められたが、トランスバクセン酸などの天然型では認められなかった。また、上記の人工型の作用は、オレイン酸（エライジン酸のシス異性体）の共処置でいずれも顕著に抑制された。以上の結果から、DNA損傷時の細胞死についても、人工型のみが特異的に促進すること、その毒性はオレイン酸によって効果的に軽減可能であることが示唆された。現在、オレイン酸と同様に毒性を抑制可能な天然・食品由来成分の探索を行っており、本会では、最新の成果をご報告したい。

アセチル化に代表されるヒストンの多様なリジンアシル化修飾は、エピジェネティックな遺伝子発現制御に関わり、生命現象の根幹を成すシステムであるが、その異常はがんなどの疾患の原因となることが知られている。これらのアシル化修飾の少なくとも一部は、短鎖脂肪酸などの内在性カルボン酸に由来するアシルCoA依存的に引き起こされる。一方、我々は日々環境中の様々なカルボン酸に曝されており、例えば食品添加物には100種類以上のカルボン酸が含まれる。それら化合物が食事などを介して体内に非意図的に取り込まれると、内在性脂肪酸と同様にヒストンに修飾し、遺伝子発現を変動させ、その結果、健康に影響を及ぼしている可能性があるのではないかと考えた。そこで、アシル化ヒストンとリーダータンパク質の相互作用を利用して、無数に存在する生活環境中のカルボン酸の中でヒストン修飾能を有するものを簡便且つ効率的に探索するためのアッセイシステムを構築した。本アッセイ系を用いて生活環境中で消費量が高い食品添加物などのカルボン酸を探索したところ、複数の化合物がヒストン修飾能を有することを発見した。その中でも食品甘味料として多用されるアスパルテームに注目し、アスパルテームによって発現変動する遺伝子をRNA-seq解析により検討した。しかし、発現が変動する遺伝子はほとんど存在しなかったことから、アスパルテーム修飾の主要な標的はヒストンではない可能性が考えられた。そこで、アルキン標識アスパルテーム誘導体を合成し、細胞内のアスパルテーム修飾タンパク質の検出を試みたところ、多くのタンパク質がアスパルテームにより修飾を受けていることを示唆する結果を得た。現在、ケミカルバイオロジーの手法を用いてアスパルテームが修飾するタンパク質の網羅的な探索を試みており、本発表では、アスパルテームがタンパク質修飾を介して生体に影響を与える可能性について議論したい。

【はじめに】我々は昨年の本学会で、ネオニコチノイド系農薬のイミダクロプリド（IMI）のラット発達期曝露による児動物の海馬神経新生障害を報告した。本研究ではクルクミンの非晶質製剤（CUR）のIMI誘発神経新生障害に対する修飾作用を検討した。

【方法】妊娠6日から離乳時の生後21日目まで母ラットに750 ppmのIMIを混餌投与し、同時に120 ppmのCURを飲水投与した。離乳後は児動物にCURのみの投与を成熟後の生後77日目まで継続した。群構成は、無処置、IMI単独、IMI+CURとした。

【結果及び考察】離乳時の児動物で、IMIは顆粒細胞系譜の神経前駆細胞と未熟顆粒細胞の増殖低下を介した神経新生の抑制を示した。COX2⁺､FOS⁺､p-ERK1/2⁺顆粒細胞数は減少し、神経可塑性の低下が示唆された。RELN⁺ないしPVALB⁺介在ニューロン数は減少し、神経新生や神経可塑性の抑制への関与が示唆された。CURは神経幹・前駆細胞を増加させ、神経可塑性も回復した。介在ニューロン数も回復傾向を示し、IMI毒性に対する保護作用が示唆された。IMIは抗酸化酵素遺伝子を発現減少させたが、CURは抗酸化作用を示さなかった。成熟後もIMIによる神経新生や神経可塑性の抑制が持続し、それらに対してRELN⁺介在ニューロンが反応性に増加した。CURは顆粒細胞系譜と神経可塑性の回復と共に介在ニューロン数の増加傾向を示し、持続するIMI毒性に対する修復・保護作用が示唆された。IMIによる酸化ストレス誘発を示唆する遺伝子発現変動は認めなかった。

【まとめ】IMIは海馬神経新生と新生顆粒細胞の神経可塑性を成熟後まで持続的に抑制し、それに対する離乳時での酸化ストレスに対する感受性増加による介在ニューロン制御抑制の関与が示唆された。CURは持続的に介在ニューロンを介した修復・保護作用を示したが、抗酸化作用を示さなかったことから、CURは介在ニューロンに対する直接的な作用により神経新生と神経可塑性を回復した可能性が示唆された。

Imidacloprid (IMI) is a widely used neonicotinoid insecticide; the developing cerebellum is known for its high sensitivity to neurotoxicants. However, neurotoxic potential of IMI on cerebellar development remains unknown. This study examined the maternal exposure effect of IMI on cerebellar development in rat offspring. Dams were exposed to IMI (83, 250, and 750 ppm in diet) from gestation day 6 until day 21 post-delivery on weaning, and offspring were maintained without IMI exposure until postnatal day (PND) 77 in adulthood. Behavioral tests revealed that the grip time in forepaw grip test and inclined plate degree in inclined plane test were decreased at ≥ 250 ppm both in the adolescent and adult stages. In the cerebellum, number of CALB1 ^＋ Purkinje cells decreased at 750 ppm on PND 21, and sustainedly decreased until PND 77, appearing at ≥ 83 ppm. IMI at 750 ppm increased Iba1 ^＋ microglia and CD163 ^＋ M2-type microglia in the molecular layer (ML) and internal granular layer of the cerebellar cortex, accompanying upregulation of Il6, Il10, and Tnfα in the examination at 750 ppm. Cerebellar malondialdehyde level was elevated at 750 ppm, accompanied by Sod2 downregulation. TUNEL^＋ apoptotic cells were also increased in the ML at 750 ppm, accompanied by Casp3 upregulation. Obtained results suggest that maternal IMI exposure induced oxidative stress damages and neuroinflammation in the developing cerebellum causing apoptosis of migrating granule cells followed by progressive loss of Purkinje cells and long-term deficits in motor activity and coordination functions in offspring.

非臨床安全性試験では、中枢毒性や状態悪化等により動物が行動異常を呈する場合がある。このような異常行動を的確に検出するためには、連続的にモニタリング可能な高感度評価系の開発が必要である。そこで本研究では、深層学習等を活用し動画データから動物の異常行動を自動解析するモデル構築を試みた。結果として、カニクイザルの骨格推定モデルを活用し異なるアルゴリズムを用いた教師あり学習により、カニクイザルにおける4種の異常行動の各検出モデルを構築した。各モデルの詳細を下記に示す。

活動量低下：骨格座標を指標にトラフィッキングすることで移動量及び速度を算出し、動物の活動量を定量化する。薬剤起因性の活動性低下を定量的に検出することで、状態悪化を定量的に判断できる。

常同行動：骨格情報に対して時間周波数解析を用いることで、常同行動（旋回及び反転行動など）を検出する。興奮や精神的苦痛などによって惹起される常同行動の定量化により中枢神経系異常の検出や環境エンリッチメントの改善などへ応用が期待される。

嘔吐：物体検知モデルを用いた嘔吐物検出に、口の位置情報及び物体の移動方向を組み合わせることで嘔吐を検出する。嘔吐の発生タイミング及び頻度を正確に知ることができる。

痙攣：ペンチレンテトラゾール投与後に誘発された痙攣データを基に作成した分類アルゴリズムにより重度の痙攣をリアルタイムに検出する。重篤度の高い異常行動に対して、獣医学的ケアの迅速化などへの貢献が期待される。

これら4モデルの構築により、これまでの観察手法では困難であった所見の発生タイミングの正確な検出及び定量的な評価が可能となった。これらの新たな指標を活用することで、毒性評価の精度向上だけでなく、異常行動の早期検出による獣医学的ケアや飼育環境の最適化への応用が期待される。

Methylmercury (MeHg) is the causative substrate for Minamata disease, and it is known to induce sensory impairment. The neurotoxicological mechanism of MeHg has been widely studied in the central nervous system, but not as much in the peripheral nervous system. It has been reported that the number of neurons in the rat dorsal root ganglion (DRG) decreased 14 days after MeHg exposure (Day14). In addition, from behavioral analysis, only hypoalgesia was observed during Day11 to 48 and then, recovered to control level. However, the histological background for hypoalgesia-specificity remain unclear. In this study, we investigated the possibility that hypoalgesia originates in the peripheral nervous system. MeHgCl (6.7 mg/kg/day) was orally administered into 9-week male Wistar rats for 5 days, followed by 2 days without administration, and this cycle was repeated once. Seven, 14, 28, 42, 56, and 70 days after the beginning of MeHg exposure, frozen sections from L4-5 DRG were prepared and immunostained by nociceptive and mechanoreceptive cell markers. DNA microarray analysis for Day14 was also performed. Histological analysis showed that the number of mechanoreceptive and nociceptive cells have both decreased around Day14 and recovered afterwards. Microarray data also did not show specific cell death of nociceptor cells. These data suggest that the hypoalgesia-specificity may be caused by the impairment of central but not peripheral nervous system.

メチル水銀（MeHg）による神経障害機構の研究は中枢神経において多く行われてきたが、末梢神経においてはあまり行われていない。我々は、MeHgを投与したラット末梢感覚神経細胞が存在する後根神経節（DRG）における、MeHg投与開始14日後の神経細胞の脱落とマクロファージの集積を報告した。炎症応答細胞は細胞死に伴い集積した可能性がある一方、炎症性サイトカインの過剰分泌により細胞死を促進する可能性もある。そこで、マクロファージの経時的集積と神経細胞死の時系列的変遷を明らかにし、マクロファージの活性を抑制した遺伝子改変マウスを用いて、炎症応答細胞の神経細胞死に対する影響を検討した。9週齢雄WistarラットにMeHgCl水溶液（6.7 mg/kg/day）を5日間投与、2日間未投与のサイクルで2週間投与した。コントロールは体重あたり同量の水を投与した。また、MeHg投与と同時にマクロファージ活性化抑制剤であるミノサイクリンを30 mg/kg/day及び100 mg/kg/dayで投与した。投与開始7, 14, 28, 42, 56, 70日後に灌流固定し、腰部DRGの凍結切片標本作成後、Iba1、CD68、NeuNに対する各抗体で染色し、組織学的定量を行った。Iba1陽性細胞はMeHg投与開始28日後より増加し、70日まで持続的に増加した。対して、CD68陽性細胞は投与開始14日後に一過性に増加した。一方、NeuN陽性の神経細胞数は既報とは異なり、数的変化が見られなかった。次にマクロファージの活性化抑制の為、2濃度条件でのミノサイクリン投与を行ったが、いずれもMeHgによるマクロファージ活性化は抑制できなかった。以上より、MeHg投与ラットDRGにおいてマクロファージ及び活性型マクロファージ数の経時的変動が見られたが、神経細胞死に対してどのような影響を与えるかは明らかにすることができていない。さらに、NeuNを用いた神経細胞数の定量化では、既報のNeurofilamentを用いた定量化で得られた結果と異なり、神経細胞数の顕著な減少は見られなかった。今回の発表では、得られた結果が何に起因したか詳細な検討を行い報告する。

中枢神経系（CNS）における薬物反応のin vitro評価は、神経疾患における薬物毒性を評価する上で極めて重要である。微小電極アレイ（MEA）を用いた評価系では、神経ネットワークの成熟が促進されることから、神経細胞とグリア細胞の共培養が一般的である。中枢神経系の薬物反応におけるアストロサイトとニューロンの役割が異なることを考えると、共培養条件において、ニューロンとアストロサイトの神経機能を分離する必要性がある。本研究は、独立成分分析（ICA）を用いて、MEA上のニューロンおよびアストロサイト共培養系から発生する神経シグナルを分離することにより、この課題に取り組むことを目的とする。妊娠17日目のラットから取り出したRat primary neuron及びヒト由来iPS細胞由来神経細胞をMEAプレートに培養し、培養条件を変えることで共培養と各細胞単体培養をプレート毎にそれぞれ独立に実現した。得られた共培養条件の神経信号に対してICAを実施し、共培養条件から得られた神経信号を独立した成分に分離した。各成分は各細胞の信号源に基づいて分類され、続いて分離・再構成された。結果として、各細胞由来の独立成分が低周波帯域において特徴を有していた。ICAを適用することで、共培養データからそれらの個々の細胞由来成分を抽出することができた。また、ICA後の抽出データは、薬物応答に関して、単培養データと同様の傾向を示した。本研究は、ICAを用いて共培養条件から神経細胞とアストロサイトのシグナルを抽出することに成功した。したがって、これまで困難であった神経細胞種毎の薬剤応答の評価が可能となることが期待される。

化学物質が脳にもたらす組織学的な変化を効率的かつ定量的に解析できることは、神経毒性評価において有用であるが、脳全体の組織観察や3次元データの解析には多くの労力とコストを要する。そこで本研究では、化合物による生体の脳全体における組織学的な観察を容易に実施できる手法として、ゼブラフィッシュ胚・仔魚の脳の三次元イメージングを行い、細胞死やミクログリア動態の解析を効率的に行う手法を紹介する。神経毒性が知られているエタノールやバルプロ酸ナトリウムを複数濃度、時間でゼブラフィッシュを曝露したうえで、安価で短時間に全身の細胞膜や死細胞を標識できる蛍光色素や、ニューロンやミクログリアに蛍光タンパク質を発現させたトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、２光子顕微鏡で脳全体を観察した。ゼブラフィッシュ仔魚は麻酔溶液に浸されたアガロースゲルの板の上に1プレートあたり最大数十匹包埋され、水浸対物レンズを用いて観察された。画像処理および解析には、オープンソースソフトウェアであるImageJを使用し、ミクログリアや死細胞の三次元座標、体積、形状などを各画像から自動的に取得し、あわせて手動で組織学的性状の定性評価や脳の特定の領域の座標を取得した。取得した座標情報や特徴量のデータは、Rを用いて、サンプルの傾きや大きさの個体差を補正して異なるサンプル間での比較できるようにした上で、統計解析を行った。その結果、試験薬物やその濃度、曝露時間、脳の領域に応じて、細胞死やミクログリアの動態が変化することを定量的に解析できた。複数サンプルの脳全体の観察と、立体的に脳を領域分けした画像解析を簡単な操作で行える本法によって、神経毒性をもつ化合物による組織学的な変化を効率よく詳細に評価できものと考えられる。

【目的】プロテオグリカン（PGs）はコアタンパク質にグリコサミノグリカン糖鎖が結合した複合糖質の総称であり、パールカン、ビグリカンおよびシンデカン-1は、血管内皮細胞が産生するPG主要分子種である。PGsは細胞増殖や血液の凝固線溶系の調節など血管機能の調節を担う。動脈硬化は先進国共通の主要血管病変の一つであり、血管壁の肥厚に伴い局所的な酸素濃度の低下をもたらす。低酸素環境に曝された内皮細胞は低酸素応答を引き起こし細胞生存に向かうシグナルを伝達するが、PGsに及ぼす影響は明らかとなっておらず本研究ではその解明を目的とした。【方法】ウシ大動脈内皮細胞を37℃、5% CO2のもと、通常酸素条件および低酸素条件（1% O2）で培養した。siRNAはリポフェクション法により導入し、遺伝子発現はRT-qPCR法、タンパク質発現はウェスタンブロット法で解析した。細胞層と培養上清の総タンパク質量はBCA法、組成はSDS-PAGEで分離後にCBB染色で評価した。【結果・考察】低酸素条件下の内皮細胞において、シンデカン-1のmRNA発現は変化せず、ビグリカンとパールカンのmRNA発現が時間依存的に増加した。その一方で、PGコアタンパク質発現は一様に減少した。このとき細胞層と培養上清の総タンパク質量は各培養条件で有意な差は認められず、PGsコアタンパク質の選択的な減少が示された。さらに、低酸素条件下におけるパールカンとビグリカンのmRNA発現の増加をHIF-1αが介在することが示された。PGsの減少は血栓形成や血管透過性を亢進させるため、低酸素環境下における内皮細胞プロテオグリカン合成量の減少は動脈硬化病変の悪化につながると予想される。一方で、HIF-1αを介したPG mRNAsの発現誘導は、PGsコアタンパク質の減少によって引き起こされる血管脆弱化に対する防御応答を反映していると考えられる。

【目的】動脈硬化症は先進国共通の主要な生活習慣病であり、その病変部において内膜肥厚による血管壁の狭窄が発生し局所的な低酸素環境が形成され病態進行の増悪を引き起こす。プロテオグリカン（PGs）は、コアタンパク質にグリコサミノグリカン糖鎖が結合した複合糖質であり、血管内皮細胞が産生するPGsは血管機能の調節において重要な役割を担う。当研究室では低酸素条件下で培養したウシ大動脈内皮細胞が産生する主要なPGsであるビグリカン、パールカンおよびシンデカン-1のコアタンパク質発現が減少することを確認しているが、ヒトへの外挿性は明らかとなっていない。そこで本研究ではヒト由来の血管内皮細胞を用いて解析した。【方法】ヒト血管内皮細胞株EA.hy926細胞を37℃、5% CO2のもと、通常酸素条件および低酸素条件（1% O2）で培養した。各PGs分子種のmRNA発現はRT-qPCR法、コアタンパク質発現は細胞層および培養上清を陰イオン交換クロマトグラフィーまたは限外濾過法で濃縮した後、ウェスタンブロット法を用いて解析した。【結果・考察】低酸素条件下で培養したヒト血管内皮細胞において、ビグリカンmRNAは24時間以降に増加、パールカンmRNAは時間依存的に減少し、シンデカン-1mRNAは大きな変化が見られなかった。コアタンパク質の発現は、ビグリカン、パールカン、シンデカン-1のいずれも低酸素条件下における減少が認められた。以上の結果より、低酸素環境におけるPGコアタンパク質の減少は種差によらない共通の現象であることが示唆された。PGsはアンチトロンビンIIIや細胞増殖因子/サイトカインと結合し、それぞれの活性制御を通じて血管の抗血栓性や傷害修復などに重要な役割を果たす。したがって、低酸素環境によるPGsの減少は動脈硬化症における血管障害の進展に寄与すると考えられる。

　ヒトは生活の中で農薬やPM2.5など多くの環境化学物質に曝露されており，これらの長期的な曝露はがんなどの慢性疾患の発症に関連することが指摘されている．この根底にあるメカニズムとしてエピゲノム異常が示唆されているが，その毒性因子や分子メカニズムは未解明である．一方，環境化学物質の中でも親電子物質はタンパク質と付加体を形成することで，その酵素活性を制御することが報告されている．

　我々は，複数の環境親電子物質に対し，エピゲノム制御因子であるDNAメチル基転移酵素DNMT3Bの酵素活性阻害スクリーニングを行い，4 種の阻害物質を同定した．さらに，このうちの1 種についてはDNMT3Bに直接結合し，酵素活性の低下とそれに起因したDNAメチル化低下を誘導することで，炎症性サイトカインの発現増加を介した炎症応答を惹起する可能性を見出した．そこで本研究では，スクリーニングにより得られた4種の親電子物質の中から，農薬として現在世界各国で用いられているジチアノンに着目し，炎症応答に関わる転写因子であるSTAT1に対する影響を解析した．

　まず，DNMT3A/Bに対するジチアノンの酵素活性阻害能について評価したところ，いずれも処理濃度依存的な酵素活性の低下が認められた．続いて，ヒト肺胞上皮腺癌由来A549細胞にジチアノンを処理し，リン酸化STAT1の経時的な変化を確認したところ，48 時間以降において恒常的なリン酸化STAT1の増加が認められた．

　以上より，ジチアノンはDNMT3の酵素活性を阻害するエピゲノム制御因子として機能し， STAT1のリン酸化を誘導することで恒常的な炎症応答を惹起する可能性が示された．今後，ジチアノンの発現制御を受けるサイトカインを探索していく予定である．

【目的】血管の内腔を覆う血管内皮細胞に対する酸化ストレスは動脈硬化症の発生に寄与する。生体エネルギー分子であるadenosine triphosphate（ATP）は、細胞傷害に伴い放出され炎症反応を惹起する生体機能調節分子として機能することが知られている。また、ATPは動脈硬化症の増悪化を引き起こすことが報告されているが、その詳細なメカニズムについては明らかとなっていない。そこで本研究では、動脈硬化病変発生の初期プロセスである血管内皮細胞への酸化ストレスに対してATPが与える影響とその分子機構を検討した。

【方法】ヒト血管内皮細胞株EA.hy926細胞をATPおよび過酸化水素で処理した。細胞傷害性は、乳酸脱水素酵素の逸脱量で、細胞形態はGiemsa染色により細胞を固定した後に顕微鏡下で観察し評価した。遺伝子発現レベルはReal time RT-PCR法で、タンパク質発現レベルはWestern blotting法で測定した。

【結果・考察】過酸化水素の血管内皮細胞に対する傷害性はATPによって増強した。ATPは過酸化水素処理によるHO-1 mRNAの発現誘導を抑制することが確認された。一方で、他の酸化ストレス防御因子の発現には影響を与えなかった。このことから、細胞外ATPは酸化ストレスに対する応答調節を通じて細胞傷害性を増強させる可能性が示唆された。次にATP受容体であるP2XおよびP2Y受容体の関与を検討した。その結果、P2X受容体アンタゴニストPPADSによる影響は認められなかったが、P2Y受容体アンタゴニストSuraminは、ATPによるHO-1 mRNAの発現抑制の回復および過酸化水素による傷害性の増強を抑制することが確認された。これらの結果から、細胞外ATPはP2Y受容体を介して血管内皮細胞の酸化ストレスに対する応答調節に寄与している可能性が示された。

【目的】パールカンは，アンチトロンビンIIIや増殖因子FGF-2の活性化を通じて，血管内皮細胞の抗凝固および増殖活性を調節しているヘパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種である。パールカン発現の変化は，動脈硬化症などの炎症性の血管病変の増悪と密接に関係するが，その詳細な機構は不明である。炎症性の血管病変では細胞および血小板から高濃度のATPが分泌され，プリン受容体を介して細胞機能を調節している。本研究では，ATPが内皮細胞のパールカン発現に及ぼす影響と，そのメカニズムの解明を目的とした。【方法】培養ウシ大動脈内皮細胞をATPで処理し，パールカンコアタンパク質およびそのmRNA発現はWestern Blotおよびreal-time RT-PCRによりそれぞれ解析した。siRNAはリポフェクション法により導入した。【結果・考察】内皮細胞をATPで処理したとき，液相のパールカンコアタンパク質およびmRNA発現の減少が認められた。ADPやアデノシンでは減少作用は認められず，細胞膜貫通型ヘパラン硫酸プロテオグリカンのシンデカン-1およびシンデカン-4もATPにより減少した。内皮細胞に構成的に発現しているプリン受容体（P2X4R，P2X7R，P2Y1RおよびP2Y2R）の発現をそれぞれ抑制したとき， P2Y2受容体のノックダウンによりATPによるパールカン発現低下の回復が認められた。ATPによりシグナル分子Aktの活性化が抑制され，P2Y2受容体発現の抑制によりこのAktの抑制は回復した。Akt阻害剤であるAkt inhibitor Ⅷは，ATPと同様のパールカンｍRNA発現の抑制効果を示したが，Akt活性化剤SC79によるパールカンmRNA発現に変化は認められなかった。以上より，ATPは内皮細胞のパールカンコアタンパク質発現を抑制し，この抑制にはP2Y2R-Aktシグナルの抑制を介在することが示唆された。炎症性の血管病変では，液相に放出されたATPによるパールカン発現の抑制が抗凝固活性の抑制を通じた血栓形成の誘導に関与することが示唆される。

【目的】プロテオグリカンはコアタンパク質に対してウロン酸とアミノ糖の繰り返し構造からなるコンドロイチン・デルマタン硫酸やヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンが結合した複合糖質である。プロテオグリカンは細胞増殖や血液凝固線溶系など血管機能の調節を担っている。血管の内側を覆う血管内皮細胞は、動脈硬化において血管壁が肥厚すると局所的に低酸素環境に曝される。当研究室は、血管内皮細胞が産生するプロテオグリカンのコアタンパク質発現が低酸素環境下において発現変動することを明らかにしている。その一方で、低酸素環境下におけるグリコサミノグリカンの合成調節はよくわかっておらず、本研究では低酸素環境がグリコサミノグリカン伸長酵素の遺伝子発現に及ぼす影響の解明を目的とした。【方法】コンフルエント（dense culture）および1.2×104 cells/cm2で播種後24時間（Sparse culture）のウシ大動脈内皮細胞を37℃、5％ CO2のもと、通常酸素条件および低酸素条件（1% O2）で8および24時間培養した。各糖鎖伸長酵素のmRNA発現はRT-qPCR法にて測定した。【結果】低酸素培養下では、sparse cultureにおいてコンドロイチン・デルマタン硫酸糖鎖の伸長酵素であるCHSY1の発現低下が認められた。また、同様にコンドロイチン・デルマタン硫酸糖鎖の伸長酵素であるCHPF2は細胞密度によらず発現低下することが明らかとなった。その一方で、ヘパラン硫酸糖鎖の伸長酵素であるEXT1、EXT2、EXTL3はdense cultureにおいて培養後8時間では発現抑制されるものの、24時間では増加に転じることが示された。また、sparse cultureではEXT1の発現変動がdense cultureとは反対に低酸素培養後8時間で増加し、24時間で減少に転じること、EXT2は低酸素培養後24時間まで持続的に発現抑制されることが明らかになった。今回明らかになったこれらの変化が各タンパク質発現や糖鎖に対して及ぼす影響を明らかにすることが今後の検討課題である。

Cardiotoxicity significantly contributes to drug attrition during the new drug development process and the withdrawal of drugs already in the market. Although the hERG assay under the ICH S7B has been a key tool for assessing hERG-related arrhythmic risks since 2005, concerns persist regarding its accuracy, as hERG-blockade does not consistently correlate with QT prolongation in humans. Recent advances in the stem cell field now enable the generation of highly pure human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) that faithfully replicate native behavior of human ventricular myocytes, offering a more precise assessment of the proarrhythmic potentials of candidate drugs.

Currently, these cells are under active investigation, particularly within the ICH guideline revision (CiPA initiative), showing their potential as novel assays for preclinical cardiotoxicity testing. NEXEL’s highly pure human iPSC-derived cardiomyocyte, Cardiosight®-S, is also a part of many cell products that are being tested for the purpose and has been validated for its effectiveness.

The outcomes generated by NEXEL’s NeXST service have undergone validation across numerous cases, encompassing the evaluation of both reference drugs and unknown drugs. Through optimization tailored to Cardiosight®-S in various platforms, NeXST service is highly versatile for various purposes within cardiac toxicity screening.

In conclusion, Cardiosight®-S, along with the NeXST service, emerges as a promising alternative source for the early determination of cardiac risk in both drug discovery and preclinical studies.

【背景と目的】DNA損傷マーカーであるγ-H2AXはラット膀胱および腎発がん物質の早期検出における鋭敏な指標であり、膀胱では幹細胞マーカーとの併用により検出感度は更に向上する。本研究では、同手法の肝臓への応用を目指し、肝発がん物質の早期検出におけるγ-H2AXと幹細胞マーカーの有用性を検討した。

【方法】肝発がん物質または非肝発がん物質を28日間投与した雄F344またはSDラットの肝臓を用い、γ-H2AXおよび 肝幹細胞マーカー（ALDH3A1、APN /CD13、EpCAM）に対する免疫組織化学染色を実施した。γ-H2AXは陽性細胞比率の算出、ALDH3A1は陽性像の定性評価、APNおよびEpCAMは半定量的スコアリングを行い、それぞれ対照群に対する陽性細胞比率の有意な増加（γ-H2AX）、肝細胞における陽性像（ALDH3A1）、スコアの有意な増加（APN、EpCAM）を陽性と判定した。

【結果】既報を含め、γ-H2AXは49物質、ALDH3A1は84物質、APNは40物質、EpCAMは56物質に対し評価を行った。その結果、各マーカー単独での肝発がん物質の検出感度および特異度はALDH3A1が71.1%/78.3%と最も高く、他はそれぞれγ-H2AX：48.5%/75.0%、APN：48.1%/23.1%、EpCAM：58.8%/68.2%であった。γ-H2AXとALDH3A1の併用により、検出感度は78.9%に向上した。また、ALDH3A1は投与物質によって異なる発現パターンを示し、PPAR作動薬では小管状陽性像、および胆管発がん物質では肝細胞に加えて胆管上皮の陽性像が認められる傾向があった。

【考察】今回検討した幹細胞マーカーの内、ALDH3A1が単独およびγ-H2AXとの併用において最も高い検出感度を示し、ラット肝発がん物質の早期検出に有用であると考えられた。さらに、ALDH3A1の発現パターンは、投与物質の発がん機序や標的細胞と関連する可能性が示唆された。現在、各マーカーの未評価物質についてさらなる解析を進めている。

新日本科学安全性研究所における、カニクイザルを用いた生殖発生毒性試験では、雌雄1対1の3日間同居法により妊娠動物を作出し、その中間日を妊娠0日と設定している。我々は、周期的な月経（25～35日）を示すカニクイザルは、月経発現後11～16日目に排卵すると考え、その期間のうち3日間を交配期間に設定した。この方法を用いた場合、妊娠率は20%程度であった。カニクイザルの月経周期は必ずしも規則的に発現しないことがあり、3日間の雌雄同居期間に排卵していない可能性もある。妊娠率を向上させるためには、簡便かつ非侵襲的な方法で排卵時期を予測し、交配期間を最適化する必要があった。そこで、カニクイザルの卵巣及び子宮を経時的に超音波検査し、排卵時期の指標を検索することとした。当検討には、体重2.5～5.0 kg、4～15才のカニクイザルの雌を用いた。規則的な月経が確認された23例について、月経開始日を月経1日（MD 1）として、MD 2、10、12、14、16、18、20（黄体が確認されるまで）に、主席卵胞径及び子宮内膜厚を38 mmリニア経腹プローブ（5～18 MHz）を装着した超音波診断装置（ARIETTA 850LE、株式会社日立製作所）で測定した。その結果、主席卵胞径は月経開始日から経時的に伸長し、5 mm前後［中央値5.3（最小値2.7、最大値6.6）］で最大値を示した後、急速に縮小したため、主席卵胞径が4.5 mm以上を示す時期を排卵直前期とすると、78.7%の動物で排卵時期を予測可能であった。なお、主席卵胞径が最大値となるまでの期間は、月経開始日から14.3 ± 2.7日で個体差が認められた。また、子宮内膜厚に有意な経時的変化はみられなかった。以上より、超音波検査による主席卵胞径のモニタリングは、カニクイザルの排卵時期の予測及び交配期間の最適化に有用な手段になると考えられた。

異物応答性核内受容体CARは、肝臓に高発現し、異物代謝酵素の発現調節を担う一方、その活性化は齧歯動物において肝細胞増殖とそれに伴う肝がんを惹起する。当研究室ではマウス肝においてCARは細胞増殖促進因子であるYAPとの相互作用を介して肝細胞増殖を誘導することを見出したが、最近の研究成果より、CARはYAPを介さない経路によっても肝細胞増殖を誘導する可能性が示された。最近、細胞増殖やアポトーシスに関与するGadd45bの欠損により、マウスにおけるCAR依存的な肝細胞増殖及び肝発がんが抑制されることが報告された。本研究では、CAR依存的な肝細胞増殖機構の全容解明に向けて、CARによるマウスGadd45bの転写調節機構の解明を目指した。マウスにCAR活性化薬のphenobarbitalを24時間間隔で2回腹腔内投与し、最終投与3時間後に肝を採取した。定量的逆転写PCR法により、phenobarbital投与に伴いGadd45bの肝mRNAレベルが増加することが確認された。Gadd45b遺伝子プロモーターCpG配列のメチル化に注目し、肝ゲノムDNAを抽出し、非メチル化依存的にCCGG配列を切断するHpaII処理後、Gadd45b遺伝子プロモーター上のHpaII認識配列を含む領域をPCRで増幅したところ、メチル化レベルはphenobarbital 投与で低下することを示唆する結果が得られた。マウスGadd45b遺伝子プロモーター（-3 kb）を用いたレポーターアッセイでは、CAR活性化によりレポーター活性は増加した。また、本レポータープラスミドをCpG配列メチル化酵素で処理した後にアッセイを行ったところ、構成的なレポーター活性は減弱した。以上の結果から、マウス肝においてCARは、Gadd45bプロモーターのCpG配列の脱メチル化を誘導することでGadd45bの転写を促進することが示唆された。

一酸化窒素 (NO) は，タンパク質システインチオール基を酸化修飾 (S-ニトロシル化) することが知られている．我々はこれまでに，NOがDNAメチル基転移酵素 (DNMTs) の S-ニトロシル化を介してその酵素活性を阻害することを明らかにした．DNMTsによるDNAメチル化は，遺伝子発現の制御やゲノム安定性の維持における重要な役割を担っており，その活性阻害はDNAメチル化レベルを低下させ，遺伝子の発現異常を引き起こす．

本研究では，ヒト鼻中隔上皮がん細胞であるRPMI2650細胞を用いて，NO ドナーである GSNO を処理し，48時間後における遺伝子発現への影響について解析した．まず，トランスクリプトーム解析から，NO 曝露により多くの遺伝子発現が上昇する傾向を得た．次に，発現上昇した遺伝子群の生物学的意義を推定するため，遺伝子オントロジー解析を行ったところ，DNA 複製や損傷応答，細胞周期の調節に関連する遺伝子群の濃縮が認められた．RT-qPCR を用いたバリデーションにより，NO処理48時間以降に腫瘍抑制遺伝子である結合組織成長因子 CCN2 (CTGF) および初期増殖応答因子 EGR1の発現上昇が確認された．さらに，DNMTs阻害薬である 5-アザシチジン処理により，CCN2 および EGR1 の時間依存的な発現上昇が確認され，これらの遺伝子発現上昇が DNA 脱メチル化を介する可能性が示唆された．

本研究から，NO 曝露により，ヒト鼻中隔上皮がん細胞において腫瘍抑制遺伝子の発現が増加することが明らかになった．今後の展望として，NO によるこれらの遺伝子発現上昇が，エピゲノム変化に起因するものであるか，DNA メチル化に着目した解析を行う予定である．

近年，ヒトの生涯曝露の総体を理解する学問領域として「エクスポソーム」という概念が提唱された．一方，エクスポソーム研究は測定項目が膨大であることから生涯曝露量に主眼を置いた研究が進められており，分子メカニズム研究はほとんど行われていない．そこで，本研究では遺伝子発現制御機構の一つであるDNAメチル化に着目し，反応性の高い環境中の親電子物質による影響を解析した．

まず初めに，大気汚染物質や農薬に含まれる45種の親電子物質についてDNAメチル化を制御するDNAメチル基転移酵素（DNMT3B）に与える影響を検討した．その結果，DNMT3B酵素活性を低下させる4種の親電子物質を同定した．以降は4種のうち1種である大気汚染物質1,2-ナフトキノン（1,2-NQ）に着目した．LC-MS/MSによりDNMT3Bとの相互作用を解析したところ，1,2-NQは特定のリジンおよびヒスチジン残基に結合することが示された．続いて，網羅的な遺伝子発現解析を行なったところ，1,2-NQによりケモカイン類を含む炎症応答関連遺伝子の発現が上昇することがわかった．さらに，qPCRによる詳細な発現解析により，1,2-NQおよびDNMT阻害薬の処理時間依存的にCXCL8を含むケモカイン類の発現が上昇することが示された．続いて，DNAメチル化を検出するバイサルファイト法を用いてCXCL8エンハンサー領域のDNAメチル化レベルを解析したところ，1,2-NQはそのレベルを低下させた．また，1,2-NQは処理濃度依存的にA549細胞の増殖を誘導したが，CXCL8受容体アンタゴニストの前処理はこの効果を有意に抑制した．

以上の結果から，環境中親電子物質の一つである1,2-NQはDNMT3Bと直接相互作用することでDNA脱メチル化を誘発し，炎症応答活性化を介して肺がん細胞増殖を亢進する可能性が示された．

【緒言】

17β-エストラジオール(E2)は乳がんのリスク因子として知られている。 E2はCYP1酵素によって2-hydroxyestradiol(2-OHE2)と4-hydroxyestradiol (4-OHE2)へ代謝され、強い遺伝毒性を示すといわれているが、その詳細は明らかとされていない。本研究では、形質転換試験が可能なマウスBhas42細胞、E2の遺伝毒性評価に用いられるヒトMCF-7細胞を用いて、E2代謝物の遺伝毒性を評価した。

【方法】

Bhas42細胞及びMCF-7細胞に対してE2代謝物を24時間処理し、発がん指標遺伝子（マウス12種、ヒト6種）のmRNA量 を定量的RT-PCRにより測定した。さらに、Bhas42細胞ではイニシエーション試験（細胞の悪性形質転換試験）により、また、MCF-7ではComet Assay法によりE2代謝物の遺伝毒性を評価した。

【結果】

Bhas42細胞では、解析した12種の発がん指標遺伝子全ての発現誘導が2-OHE2処理群で確認され、4-OHE2よりも2-OHE2の方が強い遺伝毒性を示すことが確認された。しかし、E2代謝物処理による形質転換巣の増加は認められなかった。MCF-7細胞では、2-OHE2処理により６種の発がん指標遺伝子のうち3種の発現誘導が確認され、Bhas42細胞と同様に2-OHE2が遺伝毒性を示すことが示唆された。一方、Comet Assayの結果からは2-OHE2よりも4-OHE2でわずかに強い遺伝毒性が確認された。

【考察】

E2代謝物の遺伝毒性はBhas42細胞で強く見られること、また2-OHE2と4-OHE2の遺伝毒性の強さは試験系によって異なることが示された。エストロゲンはその受容体を介してDNA修復に関与することから、E2代謝産物の遺伝毒性発現における細胞間差は、その受容体の発現状態に依存している可能性がある。　

【目的】

様々な食品中に含まれるアセトアミド（AA）はラット肝臓に強い発がん性を有する。我々はこれまで、AAがラット肝臓に特徴的な大型小核を誘発することを明らかにし、大型小核ではchromothripsis様の変化を示唆する分子病理学的特徴が見られることを報告してきた。本研究では、AAの肝発がん過程におけるchromothripsisの関与を明らかにするため、AA誘発の肝腫瘍について次世代シーケンサー（NGS）及びオプティカルゲノムマッピング（OGM）を用いた変異解析を実施した。

【方法】

雄性6週齢のF344ラットにAAを2.5%の濃度で26～30週間混餌投与し、対照群の肝臓とAA投与群から採取したhepatocellular adenoma及びcarcinomaを解析に供した。NGS解析では、DNAを抽出後、300-400 bp程度のDNAライブラリーを調整し、whole genome sequencingを行った。オプティカルゲノムマッピング解析では、長鎖DNAを抽出後、特定の塩基配列に対しDNAの蛍光標識を行った。その後、Saphyr Chipを用いて一分子単位でDNAを直鎖化し、配列特異的に標識したDNAのシグナルパターンを検出することで、メガbpサイズのDNAを断片化することなく解析した。

【結果】

NGS解析の結果、AA誘発肝腫瘍では大型でランダムなコピー数変異が様々な染色体で認められ、7番染色体のがん遺伝子c-Myc及びMDM2を含む領域で高頻度にコピー数の増加が認められた。また、 OGM解析ではAA誘発肝腫瘍において7番染色体を含め、染色体間転座が多数認められた。

【考察】

Chromothripsisは、染色体粉砕とその後の染色体再構成によって複雑なコピー数変異と構造変異を引き起こすことが知られている。AA誘発の肝腫瘍で認められた大型でランダムなコピー数変異と多数の染色体間転座は、AAの肝発がん過程におけるchromothripsisの関与を支持するものと考えられた。現在、c-Myc及びMDM2を含む染色体領域の転座について解析を進めており、コピー数増加との関連を検索している。

SLCO2A1 is a prostaglandin transporter in the body. Our laboratory’s previous research implied its role in inflammation regulation via PGE2 transport. We also found that cigarette smoke extracts (CSE) reduced SLCO2A1 function and expression in alveolar epithelial cells derived from mouse lungs. This study aimed to explore the effect of CSE on human SLCO2A1 mRNA expression and promoter activity across cell lines from organs susceptible to smoking-induced inflammation (lung, gut, and liver). We investigated the effect of CSE alongside AhR inhibition using perrialdehyde (PAH) and PD98059 on SLCO2A1 mRNA expression in different cell lines (such as LoVo, HepG2, NCI-H292). Most cell lines exhibited reduced SLCO2A1 mRNA expression after CSE treatment, except HepG2. Treatment with PAH and PD98059 restored SLCO2A1 mRNA levels after CSE exposure, indicating that AhR signaling is involved in CSE-mediated SLCO2A1 downregulation. Luciferase reporter assays using various SLCO2A1 promoter constructs (from 0.2 to 3.7kb upstream of transcription starting site) revealed significantly decreased activity with CSE in pGL3/3.7k promoter construct, and only PD98059 restored activity after CSE treatment, implying that CSE reduces SLCO2A1 transcription via AhR. Mutations in two AhR consensus sites within the promoter region restored luciferase activity after CSE treatment, affirming that there is an AhR and DNA interaction for SLCO2A1 transcription. In summary, CSE negatively modulates SLCO2A1 expression through AhR/DNA interaction.

【目的】カドミウム（Cd）は、水田や農地に蓄積することが報告されており、長期間の汚染による毒性が懸念されている。一方、サトウキビ圧搾後の残渣であるバガス（BG）は、比表面積が大きいことから、重金属の吸着剤として利活用されている。そこで本研究では、Cdの除去に適したBGの処理方法を検討し、吸着メカニズムの基礎的検討を行った。

【方法】BGを窒素ガス存在下で200ºCおきに1000ºCまで焼成した。各種BGをCd溶液に加え、初濃度や温度、pHを変更した複数の条件下で、24時間振とうし、ろ液中のCd濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析装置により測定した。諸物性として、比表面積、細孔容積およびpH_pzc（pH of the point of zero charge）の測定を行った。

【結果・考察】BGのpH_pzcは4.27から6.51の範囲であり、これらのpHを超える条件において、BG表面は負に帯電する可能性が示唆された。Cdの吸着量は、pH 4からpH 8の領域で高く、pH 2およびpH 10では低かった。以上の結果より、吸着メカニズムには、BG表面の負電荷およびCd(Ⅱ)イオンの存在が重要であることが示唆された。一方、Cdの吸着量およびBGの比表面積は、焼成温度の上昇に伴い増加し、800ºC で焼成したBGにおいて最高値を示した。また、吸着量と比表面積（r=0.837、p=0.038）、メソ孔（r=0.841、p=0.036）およびpH_pzc（r=0.818、p=0.046）との間に有意な正の相関関係が認められ、BGへのCdの吸着量は、焼成処理による比表面積の増大に伴い増加することが示唆された。本研究の結果より、Cdの吸着は、比表面積、BG表面の負電荷およびCd(Ⅱ)イオンの存在に関連しており、800ºC で焼成したBGがCdの吸着に適していることが示唆された。

【目的】ポリカーボネート樹脂等の原料として利用されてきたビスフェノールA（BPA）は、エストロゲン作動性を介した内分泌かく乱作用が懸念されており、特にNOAELより低用量で作用を示す低用量影響の可能性が指摘されている。この懸念の最大の問題点は、低用量影響が子宮肥大試験等のガイドライン試験では検出されない上に、低用量影響自体も再現性が乏しい点にあり、その真偽を含めて長年議論が続いている。本研究では独自に作製したエストロゲン応答配列の制御下でルシフェラーゼ（Luc）を発現するレポーター（E-Rep）マウスを用いて、全身でのエストロゲン作動性を高感度に検出できるスクリーニング試験系を構築し、BPAの低用量影響の検出を試みた。

【方法】OECD TG440（子宮肥大試験）に準じたプロトコールで実施した。卵巣摘出したE-Repマウスに各被験物質を7日間連日経口投与した。投与前、投与1、2、4日後に全身in vivoイメージングでLuc由来の発光量を評価し、7日目に子宮重量を測定した。評価には11用量のBPAに加え、陽性対照物質として17α-ethinylestradiol（EE）と骨組織特異的なエストロゲン作動性を示すバゼドキシフェン（BZA）を用いた。

【結果・考察】EE投与による各エンドポイントへの影響を評価したところ、0.3 - 1 μg/kgで全身発光量は上昇したのに対し、同一個体の子宮重量は変化しなかったことから、子宮重量に比べ全身発光量の方が感度の高いエンドポイントであることが示された。さらに子宮肥大試験では陰性であったBZAの作用を全身発光量の上昇として検出できたことから、組織選択性を示す化学物質に対してもE-Repマウスの試験法が有効であることが示された。E-Repマウスの試験法でBPAのエストロゲン作動性を評価したところ、NOAEL付近の用量に加え、推定一日摂取量付近の用量においても作用が検出され、本試験法はBPAの低用量影響を検出可能であることが明らかとなった。以上より、E-Repマウスを用いた本試験法は、エストロゲン作動性化学物質の低用量問題の解決に貢献することが期待される。

【目的】マイクロプラスチック（MPs）は直径5 mm以下のプラスチック粒子であり、特に1 µm以下のものはナノプラスチック（NPs）と定義され、環境中の至る所に存在している。近年、MPs/NPsはヒトの体内（糞便、血中など）から検出されおり、ヒトはその曝露を避け得ない状況にある。また、環境中のMPs/NPsは紫外線や波などにより劣化し、サイズや表面性状などの物性が変化することが知られている。その点、微粒子は、その物性によって体内動態や細胞内動態が異なることが知られているが、現状、MPs/NPsのサイズや表面性状などの物性の違いが及ぼす影響は未解明である。そこで、本研究では物性の中でも表面性状の劣化に着目し、MPs/NPsの細胞内動態の解明に向け、その評価基盤構築を試みた。

【方法・結果・考察】ポリエチレン（PE）の粉末サンプルに波長172nmの紫外光を照射することで環境中の表面性状を模擬した劣化サンプル（d-PE）を作製した。PEもしくはd-PEをマウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7に添加し、Flow Cytometryを用いて細胞内への取り込みを細胞内部の複雑さを反映する側方散乱光（SSC）により評価した。PEもしくはd-PEを添加した細胞のSSCを測定したところ、d-PE添加群にてSSCの増加傾向が認められた。次に、細胞内取り込みを評価すべく、疎水基に反応して緑色の蛍光を発し、親水性が高まると赤色蛍光を示す蛍光染料であるNileRedを用いて蛍光標識したPE, d-PEを作製し、細胞内取り込みを評価した。ヒト単球細胞株であるTHP-1に添加し顕微鏡観察を行ったところ、蛍光標識したd-PEが細胞に接着している、もしくは細胞内に取り込まれている様子が観察された。現在、将来的なMPs/NPsの細胞内動態の詳細解明に向け、細胞内取り込みの定量法確立を進めている。

【背景・目的】現在我が国では水俣病のような高濃度メチル水銀（MeHg）曝露は考えられない。むしろ生物濃縮によってMeHgが蓄積した魚介類の摂取による妊婦を介した胎児への低濃度MeHg曝露の影響が懸念されている。しかしながら、MeHgの神経分化に関する毒性メカニズムは不明である。そこで、in vitro神経分化系を用いて、MeHgが神経機能に及ぼす影響と神経機能関連遺伝子のエピジェネティクス変化について検討した。

【方法】神経分化モデルとしてヒト胎児脳由来不死化細胞 (LUHMES細胞) を用いて実験を行った。LUHMES細胞を分化誘導しMeHg (0、0.1、1 nM) を神経分化2日目から６日間曝露した。神経分化4、10、16日目に神経スパイク活性をMaestro MEA systemで測定した。神経分化8日目に遺伝子発現量はRT-qPCR法、タンパク発現量はWestern blot法、DNAのメチル化はELISA法を用いて解析した。

【結果・考察】MeHg 1 nM 曝露により、DNAメチル化の増加、神経突起伸長抑制及び神経スパイク抑制を確認した。DNAメチル化の維持に関与するDNMT1はMeHg 1 nM 曝露によってタンパク発現量は増加した。次に、DNMT1の分解に関与するDNMT1メチル化はMeHgにより減少した。さらにDNMT1メチル化を調節するSET７，SET８，LSD1について、MeHg 1 nM 曝露による遺伝子発現量、タンパク発現量を検討した所、有意な差は確認できなかった。以上の結果からLUHMES細胞において神経分化期の低濃度MeHg曝露がDNMT1上昇によるDNAメチル化を介して神経突起の伸長を抑制し、DNMT1上昇にはMeHgによるDNMT1メチル化の減少が関与する可能性が示唆された。

背景：大気中の粒子状物質 (PM_2.5) に含まれる1,2-ナフトキノン (1,2-NQ) は、ガソリンの不完全燃焼とナフタレンの光酸化によって生成される。1,2-NQは求電子分子として働き、標的タンパク質と共有結合を形成する。我々は1,2-NQが上皮成長因子受容体（EGFR）とN-アリール化を起こし、PI3K-AKTシグナルを活性化することを報告した。本研究では、EGFR-ERKシグナル伝達カスケードに対する1,2-NQの影響を明らかにすることを試みた。

方法: NSCLC A549細胞を無血清培地で前培養し、1,2-NQで処理した。また、細胞を1,2-NQ処理前にEGFR阻害薬セツキシマブ/パニツムマブ、RAF阻害薬LY3009120、またはMEK阻害薬U0126でそれぞれ処理し、受容体の活性化とその後のシグナル伝達を阻害し、EGFR-ERK経路の影響を解析した。EGFRとERKのリン酸化に対する1,2-NQの効果は、特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより評価した。

結果と考察：1,2-NQは用量依存的にEGFR(Tyr1068)とERK1/2 (Thr202/Tyr204) のリン酸化をもたらした。興味深いことに、セツキシマブ、パニツムマブ、LY3009120またU0126による前処理では、1,2-NQによって誘導されたERKリン酸化を抑制した。これらのデータは、1,2-NQ誘導性ERK活性化 がEGFR-RAF-MEKシグナル伝達によって活性化することを示唆している。今後、1,2-NQによって制御されるERK下流シグナル伝達のメカニズムおよび生物学的意義を解析することで、新たなCOPD/癌の治療戦略の可能性を探る。

【背景・目的】核内受容体PXRは、リガンド特異性が低く、多様な化学物質に応答することから、化学物質による毒性発現の標的分子として注目されている。これまでに我々は、in vitro網羅的評価から4種のフェノール系酸化防止剤（PA）がラットPXR（rPXR）と比較して、ヒトPXR（hPXR）に対し強いアゴニスト活性を示すことを見出した。本研究では、in vitro及び in silico解析を実施し、hPXRの各種PAに対する応答性の詳細とrPXRとの種差の要因を解析した。

【方法】ヒト肝癌由来HepG2細胞を宿主とするレポーター解析を用い、PA4種のアゴニスト活性を評価した。さらにRT-PCR法を用い、ヒト大腸癌由来LS180細胞における各PAに応答したPXR標的遺伝子のmRNA発現変動を解析した。次にドッキング解析により、各PAのhPXR LBDに対する結合親和性及び結合様式を予測した。そして、相互作用への寄与が予測されたアミノ酸残基をヒト型に置換したrPXRを作製し、レポーター解析でPAへの応答性を評価した。

【結果・考察】レポーター解析及びmRNA発現解析にて、PA4種は何れも強いhPXRアゴニスト活性を示し、うち2種は、典型アゴニストRIFと比べ、より低濃度域で強く作用した。他方、特異的アンタゴニストSPA70はそれらの作用を強く阻害した。ドッキング解析では、hPXR LBD内の2つの極性アミノ酸残基がPAとの相互作用に寄与すると予測された。そこで、rPXRにおける該当アミノ酸残基をヒト型に置換したところ構成的及び最大活性は減弱したが、PA2種に応答した活性化倍率が増強した。以上より、PAのhPXRアゴニスト活性の詳細とPXRのヒト-ラット間におけるPA応答性の種差の要因が示された。本成果は、広く工業製品等に使用されるPAの安全性評価に有用な情報を提供しうる。