高等植物の頂端分裂組織は、未分化状態を保ちながら分裂・増殖する細胞群であり、茎頂―根端軸方向への成長や器官原基の形成に必要な細胞を提供するという重要な役割を担っている。シロイヌナズナにおける分子遺伝学的解析から、地上部の分裂組織である茎頂分裂組織の領域決定には、細胞外ドメインにleucine rich repeat (LRR)をもつ受容体CLAVATA1(CLV1)/CLV2と、分泌性のリガンドであるCLV3との特異的結合による細胞間情報伝達系が重要であると考えられている。CLV3 はシロイヌナズナで32遺伝子報告されているCLV3/ESR (CLE )ファミリーの一員であり、C末に保存されたCLEドメインの12アミノ酸配列を機能単位とすることが当研究室で明らかにされている。
CLV3の機能単位である12アミノ酸の化学合成ペプチド（CLV3ペプチド）は、内生のCLVシグナル伝達系を介して茎頂分裂組織の領域を縮小する効果を持つ。これまでに、CLV3ペプチド添加による花茎伸長の有無を指標にサプレッサースクリーニングを行い、CLV3ペプチド耐性変異体(CLV3 peptide insensitive; cli )を単離した。本大会では、cli1突然変異体の表現型、およびCLI1 の遺伝学的・生化学的特性について解析した結果を報告する。

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植物は頂端分裂組織の発生により組織・器官を発達させる。茎頂分裂組織では分泌性シグナル因子CLV3ペプチドがLRR-RLKであるCLV1およびCLV2に認識され、stem cellsの分裂と分化を制御している。本研究では、CLEシグナル伝達経路を明らかにするためにCLV3ペプチド耐性変異体sol2の遺伝解析と生理解析を行った。sol2変異体ではclv変異体に特徴的な心皮数の増加が見られた。また26種類のCLE合成ペプチドをclv1, clv2, sol2変異体に投与して、根の伸長阻害効果を調べたところ、clv2変異体とsol2変異体は多くのCLEペプチドに対して耐性を示した。またclv2変異体とsol2変異体のCLEペプチド耐性の程度が似ていることから、SOL2とCLV2は根端分裂組織で協調的に機能していることが示唆された。sol2のポジショナルクローニングの結果、レセプターキナーゼ（At5g13290）の膜貫通領域にアミノ酸置換を引き起こす変異が見つかった。さらにSOL2のキナーゼドメインを用いてYeast two hybridスクリーニングを行った結果、プロテインキナーゼやホスファターゼ、転写因子と相互作用することが明らかとなった。これらの結果、SOL2は多面的な機能をもち、CLVシグナル伝達経路を介して茎頂分裂組織および根端分裂組織の維持に関与していることが明らかとなった。

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CLE (CLAVATA/ESR-related) ペプチドは細胞間相互作用因子として働き、細胞の分化制御を行うことで、植物の形態形成において重要な役割を果たしている。CLEファミリーに属するTDIF (Tracheary Element Differentiation Inhibitory Factor) は、12アミノ酸の低分子ペプチドとして機能し、シロイヌナズナにおいて道管分化阻害能をもつことが明らかになっている。シロイヌナズナゲノム上には32のCLE遺伝子が存在することから、TDIF以外のCLEペプチドも維管束形成に関与しうると考え、その可能性を検討した。その結果、葉の先端及び周縁部の前形成層形成を部分的に阻害する新規のCLEペプチドが存在することが明らかとなった。このペプチドとTDIFを同時に添加すると、維管束の不連続性という表現型が抑圧された。これらのことから、維管束形成はTDIFに加え、複数のCLEが関与しあうことで精密に制御されていると考えられる。これまでに維管束の不連続性を示すものとしてオーキシン関連の変異体が報告されていることから、現在オーキシンとCLEペプチドとの関連を想定した解析も進めており、合わせて報告する予定である。

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植物の分裂組織の機能には、細胞の分裂と分化のバランス制御が不可欠である。維管束分裂組織である前形成層（形成層）は、未分化な細胞群を維持しながら篩部や木部の細胞を生み出している。この前形成層の機能は、12 アミノ酸の CLE ペプチドである TDIF と LRR 受容体型キナーゼである TDR/PXY を介して、細胞非自律的に制御されることがこれまでの研究により分かってきた。主に篩部細胞で産生され、細胞外へ分泌された TDIF は、TDR を発現する前形成層細胞に受容され、分裂の促進と木部細胞への分化の抑制という二つの作用によって、未分化な細胞を増やすように働くと考えられる。
本研究ではTDIF シグナル伝達における標的遺伝子の探索を行った。標的遺伝子の候補として維管束で発現する遺伝子、CLV3 シグナル伝達の標的遺伝子である WUS の関連遺伝子、木部細胞の分化を制御する遺伝子、細胞分裂に関わる遺伝子等を選び、TDIF との関連を調べた。また、TDIF を与えて育成した植物で発現量の変動する遺伝子を探索した。そして、その候補となる遺伝子を得た。これらの遺伝子に対して T-DNA 挿入型変異体を用いた解析を進めており、その結果と合わせて報告する。

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イネの葉脈は平行脈（縦走維管束）とそれらを結ぶ連絡脈（横走維管束）からなり、維管束の形成過程を連続的に観察できることから、我々はイネを“維管束パターン形成を解析する上での優れたモデル”と位置づけ、これまで研究を進めてきた。これまでに、連絡脈である横走維管束の形成が過剰かつその間の距離が短くなるcommissural vein excessive1 (coe1)を単離した。昨年度の本大会ではこのcoe1について、得られたアリル間での表現型の差と、そこから予測される機能について報告した。今年度は、coe1の表現型を詳細に検討するとともにCOE1を介した横走維管束の形成制御機構についての詳細な検討を行った。その結果、1）COE1はブラシノステロイドシグナル系に関与すること、2）横走維管束の形成間隔制御にブラシノステロイドが関与すること、3）COE1は新規のブラシノステロイドシグナルを介して、横走維管束の間隔を制御することが示された。これらの結果を基に、横走維管束の分化起点の決定制御機構についての制御モデルを提示したい。

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ミロシン細胞はアブラナ科の植物に見られる異型細胞であり，その液胞にβ－グルコシダーゼの一種であるミロシナーゼを含有する．虫などの食害によって組織が損傷を受けると，ミロシナーゼはグルコシノレートを分解し，忌避物質であるイソチオシアネートを産生して生体防御に働く．シロイヌナズナの葉では，ミロシン細胞は維管束近傍に点在する．我々はこれまで，液胞輸送に働くSNAREタンパク質AtVAM3の変異体では，ミロシン細胞が増加する一方で維管束の発達が著しく低下し，増加したミロシン細胞が未発達な維管束を繋ぐようにネットワーク状に分布していることを報告してきた．維管束の発達にはオーキシンが関与することが知られており，atvam3変異体ではオーキシン応答性レポーター遺伝子の発現が低下していたことから，オーキシン排出キャリアPIN1の分布パターンを解析した．その結果，atvam3変異体では，pPIN1::PIN1-GFPの発現が低下しており，その細胞内局在が部分的に野生型と異なっていた．以上の結果から，AtVAM3が細胞内におけるPIN1の局在を通してオーキシンの分布パターンを制御し，ミロシン細胞と維管束細胞の分化に関与している可能性を見出した．そこで，本大会ではミロシン細胞分化における液胞輸送系の機能を議論したい．

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シロイヌナズナDof5.8は胚や葉の前維管束細胞で発現している転写因子である。今回、Dof5.8が前維管束の発達に関与している可能性が示唆されたので報告する。葉原基の形成時に、Dof5.8プロモーター:GUSはオーキシン応答性マーカーDR5:GUSと類似の発現パターンを示した。そこで、プロトプラストを用いた一過的発現系によりDof5.8プロモーターがオーキシン応答によって制御されているかどうかを調べたところ、Dof5.8プロモーターはオーキシンとオーキシン応答に関わる転写因子MONOPTEROS (MP/ARF5)によって活性化されること、また、Dof5.8と高い相同性を示すOBP1（Dof3.4）のプロモーターも同様であることが判明した。さらに、前維管束細胞における発現とMPによる活性化には、Dof5.8プロモーターの5’上流領域の配列が必要であることも明らかとなった。Dof5.8の発現を異所的に誘導すると、前維管束細胞からの導管の分化が遅れることもわかった。これらのことから、Dof5.8は葉原基におけるMPの標的因子のひとつであり、前維管束の発達に関与している可能性が示唆された。この可能性をさらに検討するために、現在、Dof5.8とOBP1二重変異体の解析を行っている。(本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」に基づくものである。)

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植物の生育は様々な環境ストレスに左右され、植物はそのストレスに対してホルモン合成系を制御することによって適応していることが知られている。例えば乾燥ストレスに対してはアブシジン酸が合成されストレスに適応する。環境ストレスの中でも低温ストレスは、植物にとって最も影響を受けるものの一つであるが、現在まで低温ストレスとオーキシンの関係はほとんど明らかにされていない。そこで当研究室ではシロイヌナズナの根に着目し、低温ストレスがオーキシン反応にどのような影響を与えるのかを解析し、オーキシンとストレス応答機構の関係を解明することを目的に研究を行った。シロイヌナズナ根の低温処理（4℃、12時間）実験により、1．生長や重力応答性が阻害されるが可逆的な影響であること、2．低温ストレスはオーキシン情報伝達には影響を与えないが、オーキシンの輸送を阻害すること（オーキシン情報伝達系が正常でない突然変異体を用いた実験から）、3．オーキシンキャリアータンパク質であるPIN2タンパク質を介する細胞内小胞輸送が低温処理によって阻害されること（小胞輸送を阻害するbrefeldin Aを用いた実験から）が明らかになった。さらに、エンドソームの移動も低温処理によって阻害されることが明らかになった。これまでの結果より、低温処理によって抑制される重力反応は細胞内小胞輸送メカニズムが抑制されるためであると推察される。

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シロイヌナズナacaulis1-1 (acl1-1)表現型は、もう一つのアレルであるacl1-3表現型とは、温度依存的な表現型回復の点で異なる特徴が観察されていた。22℃で葉や花茎に形態異常を示すacl1-1およびacl1-3変異体は、28℃においては変異表現型が回復し、野生型と同様の形態となる。しかし、24℃においては、acl1-1変異体が22℃とあまり変わりない表現型を示すのに対し、acl1-3変異体では花茎の伸長に回復が見られた。
acl1-1のマッピングの過程から、acl1-1変異体が表現型の原因である変異とは別に逆位変異を有していた事が明らかとなった (Kamata and Komeda, 2008, Genes & Genetic Systems 83, 293-300)。逆位が生じた事により、両端に位置する二つの遺伝子の全長での発現が失われ、その間の複数の遺伝子発現も影響を受けていた。acl1-1変異体背景で逆位を持つ個体と持たない個体の成長を比較すると、持たない個体ではロゼットが一回り大きくなり、花茎もより伸長した。逆位を持たないacl1-1変異体を単離し、改めて24℃における表現型回復の様子を観察すると、acl1-3変異体と同様に部分的な表現型回復を示した。

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植物の主要な吸水器官である根は，水分勾配に応答して水分含量の高い空間へと屈曲・伸長させる水分屈性を発現する．水分屈性は植物の乾燥回避機構に重要な役割を有していると考えられるが，その分子機構は未解明である．我々は，シロイヌナズナの水分屈性突然変異体（mizu-kussei; miz）の単離と解析からその発現機構の解明を目指しており，今回，miz2の変異原因遺伝子の同定に成功したので報告する．miz2 は水分屈性を欠損する劣性の突然変異体である．マップベースクローニングの結果，miz2 変異は小胞輸送に関与するARF-GEFをコードするGNOM内の1アミノ酸置換をもたらす変異であることが推定された．miz2は，既存のgnomアリルで認められるような胚発生，根や維管束の形態，重力屈性について，いずれの異常も認められなかった．一方，GNOM機能を阻害するbrefeldin A処理によって，野生型シロイヌナズナの水分屈性および重力屈性が顕著に阻害されることが明らかになった．これらの結果から，水分屈性にはGNOMによって制御される小胞輸送が必須であること，重力屈性とは独立して機能する小胞輸送系が水分屈性に存在することが示唆された．

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植物の細胞内では様々なオルガネラが恒常的に流動しており，その動きは速く方向性を持っている．この原形質流動は古くから研究されており，細胞骨格のアクチンとミオシンが重要な働きをしていることが知られている．しかし，個体レベルにおける原形質流動の意義はいまだに不明である．そこで我々は，モータータンパク質のミオシンに注目し，シロイヌナズナを用いてその意義を明らかにしたいと考えた．シロイヌナズナには17種類のミオシンが存在し，そのうちclass-XIミオシンに属する13種類のアイソフォームが原形質流動に働いていると考えられている．我々はこの13遺伝子のT-DNA挿入変異体を単離し、逆遺伝学的解析を行ったが，顕著な表現型は観察されなかった．次に二重変異体を作製したところ，野生型と比較して植物の背丈や成長速度には差がないが，葉柄が屈曲する変異体を得た．この葉柄の屈曲する条件を詳細に解析したところ，光と重力に過剰に応答していることを発見した．すなわち，野生型の葉柄が屈曲しない条件下で，二重変異体の葉柄は光に対して正の方向に，重力に対して負の方向に屈曲した．この結果は，2つのミオシンが過剰な屈曲応答を抑制する機能を持っていることを示唆している．ミオシンアイソフォーム間での機能分担についても議論する．

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重力屈性反応の分子機構の解明を目指して、シロイヌナズナ花茎の重力屈性異常変異体sgr (shoot gravitropism)を単離・解析してきた。一方で、表現型を指標にしたこれまでのスクリーニングでは、表現型の弱いものや形態異常を示すものは排除された可能性が高い。そこで本研究では、変異体を用いたDNAマイクロアレイ解析から新規の重力屈性関連遺伝子の単離を試みた。
シロイヌナズナ花茎において、主要な重力受容の場は、内皮細胞である。そこで、内皮を欠失しているsgr1/scarecrow、sgr7/short root及びSGR7/SHRの1アミノ酸欠損変異体であるeal1 (endodermal-amyloplast less 1)を用い、3者で共通して花茎での発現量が低下している遺伝子をアレイ解析により探索した。これらの遺伝子は、sgr1やsgr7の制御下で発現しており、重力屈性に関与する可能性が期待される。29個の遺伝子が、候補として挙げられ、そのうち少なくとも1遺伝子については、その欠損変異体が弱い重力屈性異常を示した。現在、この遺伝子の機能解析について研究を進めている。

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CLEファミリーはC末にCLAVATA3と相同性の高い配列を持つ遺伝子群で、12アミノ酸からなるペプチドをコードしている。CLE遺伝子群は分裂組織のサイズ調節やその分化に関与していると考えられているが、多くのCLE遺伝子について、その詳細な機能は不明である。本研究では、根で発現することが知られているCLE3に注目し、その発現パターンを解析するとともに、CLE3過剰発現株の根を観察することで、CLE3の根の形態形成における役割を明らかにすることを目的とした。
低硝酸培地で栽培した個体の根ではCLE3遺伝子の発現量が高く、高硝酸培地ではその発現量は低かった。一方、アンモニウム(NH₄⁺)を窒素源とする培地では、300 μM NH₄⁺を含む培地での発現量が最も低く、NH₄⁺の減少または増加にともないCLE3 mRNAが増加した。CLE3 mRNAの発現が多い個体では根の生重量が小さく、発現量が少ない個体では根の生重量が多くなる傾向がみられた。CLE3 promoter-GFP植物の観察から、CLE3が根の維管束で発現するいることが明らかとなった。CLE3過剰発現株は側根が野生型株と比較して短くなる傾向が見られ、CLE3が側根の伸長に関与している可能性が示唆された。本研究発表では、さらにCLE3過剰発現株の詳細な解析を行い、CLE3の機能について議論する。

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高等植物においてプログラム細胞死（programmed cell death:PCD）は、維管束等の形態形成、病原体に対する過敏感細胞死等、生命システムにおける重要なプロセスに関与している。近年、植物におけるPCDのメカニズムは徐々に明らかにされてきているが、未解明の部分も数多く残されている。特に高等植物を用いた場合、個体レベルでの細胞死誘導時における細胞内構造等の詳細な変化を経時的に観察することは極めて困難である。そこで我々は、主な組織が一層の細胞から構成されるコケ植物では、個体レベルのままでの詳細な細胞内観察が容易であるという特性に着目し、モデル植物ヒメツリガネゴケを材料に軟腐菌を用いた効率的な細胞死誘導系の確立を試みた。今回確立した細胞死誘導系では、軟腐菌培養液上清を添加処理後24時間で約70%の原糸体の細胞死が認められ、細胞死が起こり始める数時間前に葉緑体が核のある中央部ヘ移動する様子が観察された。この葉緑体移動現象は液胞構造の形態変化を伴うと考えられることから、AtVAM3-GFPを導入した液胞膜可視化株を用いた解析を試みた。その結果、葉緑体が集合し、凝集後約30分以内で液胞が崩壊することが分かり、さらに液胞崩壊時の液胞膜の動態変化を捕らえることに成功した。現在、細胞死誘導過程における、その他細胞内小器官と細胞骨格の動態と誘導された細胞死の特徴等の解析を進めている。

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シロイヌナズナのプログラム細胞死(PCD)の負の制御因子であるAtLSD1は、細胞質で複数の転写因子(AtbZIP10,IAA8,CBF-C)上の“GxP”モチーフを認識して相互作用することで、これらの核輸送を抑制する「リテンションタンパク質」であることをこれまでに報告している。つまり、AtLSD1のPCDの負の制御因子としての機能は、AtLSD1のリテンションタンパク質としての機能に由来すると考えられる。一方、AtLSD1のホモログであるAtLOL1は、PCDの正の制御因子であることが既に報告されている。AtLOL1とこれらの転写因子との相互作用をin vivoで調べた結果、AtLSD1と同様に“GxP”モチーフを介して結合することを明らかにした。また、これらの転写因子は核と細胞質の両方に局在するが、“GxP”モチーフに変異を導入することにより、核のみに局在するようになった。このことはAtLSD1/AtLOL1との“GxP”モチーフを介した相互作用が、これらの転写因子の核輸送の抑制に必須であることを示唆している。また、AtLSD1のみが持つC末端領域を欠いたAtLSD1ΔCの過剰発現体ではAtLOL1の過剰発現体様のPCDの表現型が観察されたことから、このAtLSD1のC末端領域がPCD誘導機構におけるAtLSD1とAtLOL1との相反する機能に関与すると考えられる。

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プログラム細胞死(PCD)の誘導に関わるシロイヌナズナのbZIP型転写因子AtbZIP10は、微小管プラス端集積因子であるAtEB1a,bと特異的に相互作用する。もしAtEB1がAtbZIP10の核-細胞質間の移行を制御するのであれば、PCDの誘導機構においても重要な機能を持っていると考えられる。そこで、AtEB1についてAtbZIP10との相互作用機構について詳細に調べると共に、PCDの誘導機構における機能解析を行った。シロイヌナズナの葉肉プロトプラストを用いてAtbZIP10-GFPを一過的に発現させた結果、AtEB1の共発現により増加したAtbZIP10-GFPの細胞質における蛍光シグナルが、微小管脱重合阻害剤Taxolを処理した時に更に増幅されることを明らかにした。これらの結果から、微小管のプラス端に結合したAtEB1a,bとAtbZIP10の特異的な相互作用がAtbZIP10の核－細胞質間移行に深く関与していると示唆される。さらに、PCDを誘導するフモニシンB1処理によりAtEB1aの過剰発現体において細胞死の誘導レベルが上昇したことから、AtEB1の機能がPCDの誘導機構に関与すると示唆された。現在はペプチドディスプレイ法を用いてEB1の標的認識アミノ酸配列を同定する実験も合わせて行っており、この結果についても合わせて報告する。

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AAL毒素はトマトアルターナリア茎枯病菌の病原性因子であり，宿主植物にプログラム細胞死を誘導する．しかし，AAL毒素による細胞死のシグナル伝達経路は明らかになっていない．AAL毒素および茎枯病菌に感受性であるNicotiana umbraticaとウイルス誘導型のジーンサイレンシング法を用いて，AAL毒素による細胞死に関与する遺伝子を解析した．これまでに，AAL毒素による細胞死においてエチレン経路が重要な役割を果たすことを明らかにし，エチレン応答に関与するAP2/ERF転写因子であるNuERF4をAAL毒素細胞死に関与する遺伝子として単離した．今回，AAL毒素細胞死におけるNuERF4の役割を調べた．GAL4のシス配列と35S最小プロモーターのキメラ遺伝子を用いてNuERF4の転写制御能を調べたところ，転写を正に制御する活性を有していた．また，NuERF4を一過的に発現させた葉組織において細胞死は観察されなかったが，AAL毒素を合わせて処理すると早期に細胞死が誘導された．さらに，NuERF4を一過的に発現させた葉組織に茎枯病菌を接種すると，GUSを発現させた葉組織に比べ病徴が激しくなった．NuERF4はAAL毒素処理によってその遺伝子発現が誘導されることから，細胞死誘導には十分ではないが，AAL毒素による細胞死に必要な因子を正に制御すると考えられた．

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オートファジーは、オルガネラを含む細胞質成分を液胞に輸送し、分解する真核生物に普遍的な細胞内分解システムである。
私たちはこれまでに、電子顕微鏡観察に依拠しない植物オートファジーのモニター系を開発し、(1) ATG（autophagy-related）遺伝子破壊植物（atg mutants）はオートファジー能を欠損していること、 (2)オートファジーが不能であると栄養状態が良いにもかかわらず、老化・細胞死が促進することを明らかにしている。しかしながら、なぜオートファジーが不能であるとこのような表現型が示されるのかについては依然不明であり、植物オートファジーの生理的役割を明らかにする上で大変興味深い問題である。
最近、私たちはatg mutantsの老化・細胞死促進表現型がサリチル酸水酸化酵素遺伝子（NahG）の過剰発現によって抑制されることを見いだした。しかし、NahGによって分解されないサリチル酸アナログ、benzothiadiazole（BTH）を添加するとNahGによる抑制は解除された。これらの結果は、atg mutantsではサリチル酸生合成以降のシグナリング経路が活性化されており、それにより老化・細胞死が促進していることを示唆している。植物オートファジーはサリチル酸シグナリングの除去の一端を担っているかもしれない。

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約24時間周期の内因性リズム（概日リズム）を利用して、多くの生物は様々な生理反応を制御している。シロイヌナズナにおける概日時計の主要な構成因子であるLHYとCCA1を欠損させた二重変異体lhy;cca1では、花成時期に変化が生じる（Mizoguchi et al., Dev Cell 2002; Mizoguchi et al., Plant Cell 2005）。例えば恒明条件下で栽培したlhy;cca1では、野生型と比べて花成遅延形質がみられる。我々は最近、LHY/CCA1による花成制御には、GI-CO-FTを介した光周性花成経路の他に、SVP、FLC及びELF3を介した花成制御経路が関係していることを見出した (Fujiwara et al., Plant Cell 2008; unpublished)。恒明条件下で栽培したlhy;cca1では、花成遅延とともに、葉柄・胚軸長の短縮が見られる。これらの変異形質発現の分子機構理解を目指して、lhy;cca1にEMS処理を行い、胚軸・葉柄長等の器官伸長を指標として、7系統の増強変異体（petanko1-7; pta1-7）と1系統の抑圧変異体を単離した。本大会では、pta1の解析結果を中心に、概日時計因子による器官伸長制御と花成時期の制御について報告する。

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植物は多くの動物と異なり、移動する能力をもたず、ひとたび発芽・成長を開始した環境に柔軟に適応して生存している。周囲の環境に適応し、より効率的な光合成を行うためには、葉の形態の調節が重要である。葉の形態制御には植物ホルモンや光の情報伝達系などが関わっていることが知られているが、本研究室の先行研究により、概日時計も葉の形態制御に関与していることが明らかになりつつある。概日時計因子LHYとCCA1の機能を失ったシロイヌナズナのlhy;cca1二重変異体では、花成時期や器官伸長などに変化が生じる。特に恒明条件下では、花成遅延（Fujiwara et al., Plant Cell 2008）ばかりでなく葉柄長の短縮、葉の歪曲等の形質が見られる。我々は概日時計による葉の形態制御の分子機構を明らかにすることを目的として、分子遺伝学的研究を進めている。現在までに、lhy;cca1の短葉柄及び花成遅延形質を増強する7つの変異（petanko 1-7: pta1-7）と抑圧する4つの変異（svp、flc、elf3、phyB）を単離した。この中で、pta5は劣性変異であり、3番染色体下腕に座上していることが分かった。pta5単独変異体では花成遅延は見られないが、pta5はlhy;cca1の恒明条件下における花成遅延形質を増強した。候補遺伝子内の点突然変異の有無や相補性試験の結果もあわせて報告する。

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EARLY FLOWERING 3 (ELF3) plays key roles in the control of plant morphology, flowering time and circadian rhythms. However, it has not been elucidated how ELF3 protein accomplishes the multi-tasks. Also there has been less information on direct interactors for ELF3 and mutations that suppress the phenotypes of elf3.
In order to isolate suppressors and enhancers of elf3-1, heavy ion beams mutagenesis was performed using the elf3-1 seeds and M2 populations were screened under continuous light condition based on 3 phenotypes: flowering time, hypocotyl length and leaf size. According to these criteria, 7 suppressors and one enhancer of elf3-1 have been identified. These suppressor mutations were named suppressor of elf3 1, 3, 5, 7, 14, 15 and 20 (sel1, 3, 5, 7, 14, 15, and 20). We will discuss possible roles of these suppressor and enhancer genes in the multiple functions of ELF3.

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ELF3は光応答、器官伸長、花成、概日リズム等の制御系において重要な役割を果たしている。一方、ELF3のアミノ酸配列情報からその生化学的機能を推定することは困難であり、多面的機能を発揮しうる分子機構については未解明な点が多い。
我々はELF3の多機能性発現メカニズム解明を目的として、elf3変異体の早咲き・長胚軸・小子葉・薄緑色葉の4形質に着目して、これらの形質の全てあるいは一部を抑圧／増強する変異体の単離を試みた。変異導入はelf3-1種子の重イオンビーム処理により行った。本研究では、抑圧変異体S#20についての解析結果を報告する。S#20では、「早咲き・小子葉・薄緑色葉」の3形質が部分的に抑圧された。一方、長胚軸形質については増強されていた。この抑圧変異suppressor of elf3 20 (sel20)は、劣性変異であり、1番染色体上腕に座上していることが分かった。現在までに、elf3変異の抑圧変異として、gi、fca、fwa、ld、ft変異が報告されているが、これらの遺伝子の染色体上の位置はSEL20とは異なっていた。花成関連遺伝子FHA/CRY2を、SEL20の候補遺伝子の1つと考え、解析を進めたところ、第2エキソン内に21塩基の欠失を見出した。ELF3の多機能性発現における青色光受容体FHA/CRY2の役割について、解析結果をもとに議論する。

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トマトは果実発達など、他のモデル植物では研究しにくい多くの要素を有しており、産業的にも重要な研究対象である。そのため、ゲノム解読や研究基盤整備が国内及び国際研究コンソーシアムにより現在精力的に進められている。我々は矮性トマト品種マイクロトムを材料として、T-DNA挿入変異系統の作出を始めている。T-DNAの挿入による遺伝子機能欠損変異体では原因遺伝子の迅速な同定が可能であるため、T-DNA挿入系統は遺伝子機能解析の重要なツールとなる。
現在までに80系統以上のT-DNA挿入系統を作出し、サザンブロット解析により平均1.86コピーのT-DNA挿入を確認した。T1世代集団の栽培・観察により、形態形成等に関する変異体を4系統得た。また、T-DNAのトマトゲノム上の挿入位置を同定するために、T-DNAの隣接配列を取得した。調査した109のT-DNAの隣接配列のうち、60配列についてトマトゲノム配列を取得した。得られたゲノム配列はNCBI等のデータベースを用いて解析を行った。これらのT-DNA挿入変異系統の整備は、今後のトマト研究推進に大きく貢献すると考えている。

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生物における多くの生理応答が概日時計の制御を受けている。植物では、器官サイズ制御が概日時計によって制御される事が示されているが、その機構は未解明である。我々はこれまでに、概日時計の中心因子LHYおよびCCA1の二重機能欠損変異体(lhy;cca1)が、恒明条件で短胚軸・短葉柄となることを確認している。このlhy;cca1では、細胞の数が変わらないまま細胞体積が減少していた。高等植物の細胞体積の制御は、核内倍加による細胞質の増加とその後の膨圧変化等による細胞体積の増加によって制御されるというモデルが示されている。
本研究においてlhy;cca1における核相の解析を行ったところ、野生型と比べ大きな変化は見られなかったことから、LHYとCCA1は主に核内倍加を介さない細胞体積制御により、恒明条件下での器官サイズを制御している事が示唆された。また、器官サイズ異常を示す他の概日時計関連因子欠損変異体をもちいて核相解析を行ったが、同様の結果が見られた。現在、概日時計による器官サイズ制御の分子機構解明を目指し、lhy;cca1の短胚軸・短葉柄形質の抑圧変異体を単離・解析している。現在までに得られている知見を紹介し、器官サイズ制御における概日時計の役割について考察する。

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木本植物の多くは播種してから開花結実するまでに長大な期間を要する。幼若期間と呼ばれるこの期間は、果樹等有用な樹種の育種年限が長大化する大きな要因である。また、個体サイズが大きくなってから着花するので、スギやヒノキのような風媒生殖の樹種では、大量の花粉により花粉症問題を引き起こす。そこで、我々は、遺伝子組換え技術を利用して木本植物の花成を自在に制御することを目的に研究を進めている。FLOWERING LOCUS T (FT)やTERMINAL FLOWER 1 (TFL1)は、栄養成長から生殖成長への切り替えに関する遺伝子の一つで、我々はポプラの一種であるセイヨウハコヤナギ (Populus nigra L. var. italica)から9種類のFT /TFL1 ファミリー遺伝子を単離した。遺伝子の発現量と発現パターン、組換えシロイヌナズナの表現型からポプラのTFL1と決定したPnTFL1をRNAiで抑制した組換えポプラは、顕著な早期開花の表現型を示した。
一方、遺伝子の発現量と発現パターン、組換えシロイヌナズナの表現型からポプラのFTと決定したPnFT1とPnFT2については、この遺伝子を過剰発現する組換えポプラを作出したが、通常の生育条件下では、導入遺伝子の発現量にかかわらず着花せず、同族のアスペンと比較して結果が大きく異なった。

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イネは短日条件で花成が促進する短日植物である。短日条件による花成促進の分子機構において花成促進遺伝子Hd3a が重要であることが明らかとなっている。Hd3a 遺伝子は短日条件下におかれたイネの葉身の維管束で特異的に発現し、タンパク質へと翻訳されたのち維管束を通って茎頂分裂組織へと到達し、花成を促進していることが現在明らかになっている。これまで我々は維管束特異的な活性を持つHd3a のプロモーターの制御化でHd3a-GFP を発現する形質転換体イネを作成し解析を行ってきた。この形質転換体は早咲き表現型を示すことが明らかとなっており、さらに茎頂分裂組織を共焦点レーザー蛍光顕微鏡により観察したところ、GFP蛍光が茎頂分裂組織において観察された。しかしながら、維管束で発現したHd3a-GFPがどのように茎頂分裂組織へと移動しているかを示した知見はほとんどない。そこで、この形質転換体を用いて茎頂分裂組織の生育ステージごとのHd3a-GFP融合タンパク質の局在を観察し、また茎頂分裂組織においてHd3a-GFPと相互作用するタンパク質について解析を試みることで新たな知見を得たいと考えている。今回はこの解析により得られた成果について紹介する。

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フロリゲンは、植物が花芽形成に適した環境を感知すると葉で合成され、茎頂へ移動し花成を誘導する因子として、約70年前に提唱された。その実体は長く謎であったが、私たちはイネを用いた分子遺伝学的解析から、イネHd3aタンパク質がフロリゲンの分子実体であることを強く示唆する結果を得た（Tamaki et al. 2007)。これはシロイヌナズナオーソログのFTの解析等からも支持されている。
Hd3a-GFPを自身の発現部位である維管束で強く発現する形質転換イネを詳しく観察したところ、花成の促進に加えて分枝の増加、花序（穂）の構造の変化等が観察された。分枝の増加についてより詳細に観察したところ、Hd3aには本来休眠するはずの腋芽の生長を開始させる能力があることが分かった。さらにHd3aタンパク質の挙動をGFPを指標に追跡した結果、維管束でのみ転写、翻訳されるHd3a-GFPを腋芽メリステムにおいても観察することができた。このことは、Hd3aが葉から腋芽メリステムへ移動し腋芽の生長を開始させる機能を持っていることを示唆している。フロリゲンはこれまで葉から茎頂メリステムへ光周性情報を伝達する分子と捉えられてきたが、その実体であるHd3a/FTの解析を通して、Hd3a/FTは様々な組織間を移動する新しい情報伝達分子であるという概念に拡張できるのではないかと考えている。

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Hd3a and FT proteins have been recently proposed to act as florigens in rice and Arabidopsis, respectively. However, molecular mechanisms of their function remain to be determined. In this study, we identified GF14c (14-3-3 isoform protein) as an Hd3a interacting protein in yeast two-hybrid screen. In vitro and in vivo experiments, using a combination of pull-down assay, co-immunoprecipitation and bimolecular fluorescence complementation, confirmed the interaction between Hd3a and GF14c.
Functional analysis using either GF14c overexpression or knockout transgenic rice plants indicated that GF14c plays a role in regulation of flowering. GF14c-overexpressing plants exhibited a delay in flowering and the knockout mutants displayed early flowering that was comparable to wild-type plants under short-day conditions. Taken together, these results suggest that GF14c acts as a negative regulator of flowering by interacting with Hd3a.

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イネは、短日植物で日の長さが短くなると花成を促進する。Heading date 3a (Hd3a) は、短日で花成を促進する因子として単離され、近年、Hd3aがフロリゲンの実体であることが報告されている。RICE FLOWERING LOCUS T1 (RFT1) は、Hd3aともっとも相同性が高いファミリー遺伝子で、第6染色体上にHd3aと近接して座乗している。
Double Hd3a-RFT1 RNAi個体は、300日経ても開花しないことから、Hd3aとRFT1が、重要な因子としてイネの開花を制御していることを報告している。興味深いことに、Hd3a RNAi個体は、短日特異的に開花が遅延するのに対し、RFT1 RNAi個体は、長日特異的に開花が遅延し、さらに、RFT1 promoter:: RFT1: GFP形質転換体植物の茎頂分裂組織において、GFP蛍光が観察されたことから、短日でHd3aが、長日でRFT1が、フロリゲン様たんぱく質として、花成を促進していることが示唆された。また、上流因子の変異体を用いた解析により、RFT1は、短日とは異なった因子により制御されることが示唆された。本研究では、上流因子・下流因子の解析及び、光制御の解析を統合してHd3aとRFT1によるイネの光周性花成のネットワーク機構を報告する。

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イネ品種の花成時期の多様化は稲作地域の拡大や育種技術の発展に貢献した重要な形質の一つである。一般的にイネは短日条件下で花成が誘導される事が知られている。これまでの分子遺伝学的解析から、花成誘導における分子経路が明らかにされつつある。しかし、栽培イネ品種における多様な花成時期をもたらす分子的な原因については未だ知見が乏しいのが現状である。そこで本研究では、栽培イネ64品種から構成されるイネコアコレクションを用い、栽培イネにおける花成時期の多様化機構を明らかにする事を目指している。
これまでに、各花成関連遺伝子の発現量と花成時期との関係を調べたところ、Hd3a遺伝子の発現量と花成時期の間に強い相関関係があることを明らかにした。また、それぞれの花成関連遺伝子に関して64品種全てにおけるシークエンス解析を行った結果、Hd1ではタンパク質機能に重要とされるCCTドメインの一部または全てを失うような変異が多く見つかった。さらにこのHd1アリルの多様性は、花成時期及びHd3a発現量のそれぞれとの間に相関が見られた。また同様に、Hd3aプロモーター領域における塩基多型や、Ehd1における遺伝子発現の多様性においてもHd3a発現量および花成時期の多様性への関与が確認されている。以上を踏まえ本発表では、花成関連遺伝子の品種間多型が栽培イネ集団での多様な花成時期に与える影響について考察したい。

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我々はこれまで、光治療用色素として有用であるとの観点から、クロロフィルa(Chl a)の長鎖フィトールが外れた水溶性のクロロフィライド a(Chlide a)を得ようと試みてきた。しかし、強酸処理によって長鎖フィトールをエステル加水分解すると、中心金属Mgも外れたフェオフォーバイドaが生成してしまう。そこで、市販の酵素を作用させてChl aの長鎖フィトールのエステル結合のみを穏やかに加水分解することを試みた。酵素としてエステラーゼ（エステラーゼ、コレステロールエステラーゼ、フォスファターゼ）とプロテアーゼ（αキモトリプシン、スブチリシンカールスバーグ、パパイン）を用い、含水有機溶媒中、30℃、暗所にて48時間インキュベーションした。その結果、パパインを使用したときのみChlide aが生成し、また未知な色素の生成も確認された。HPLC、吸収スペクトルおよびFAB-mass分析から、未知の色素がChl dであることを明らかにした。反応温度30℃でのChlide aおよびChl dの収率はそれぞれ8％および2％であったが、反応温度を70℃に上げることにより、18％および4％に向上した。

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暗所作動型プロトクロロフィリド還元酵素(DPOR)はニトロゲナーゼ類似酵素であり、プロトクロロフィリド(Pchlide)のポルフィリンD環を立体特異的に還元し、クロロフィルの直接の前駆体であるクロロフィリドaを生成する反応を触媒する。この反応では、C17-C18間の二重結合が立体特異的に還元されるが、その分子機構は全く不明であった。DPORの触媒コンポーネントであるNB-蛋白質（BchN-BchBへテロ四量体）の結晶構造を解析した結果、BchBのアスパラギン酸残基（BchB-Asp274）がC17位の下方から、基質Pchlide自身のC17位のプロピオン酸基がC18位の上方から、プロトンをそれぞれPchlideのC17、C18に付加することで立体特異的な還元が行なわれると推察された。本研究では、この仮説を検証するため、BchB-Asp274を始めPchlide還元反応に関わると推定される残基について、部位特異的変異導入により一連の変異型NB-蛋白質を作製し、精製蛋白質を用いて生化学的解析を行なった。また、C17位にプロピオン酸基ではなくアクリル酸基を有するPchlideアナログ、クロロフィルcのDPOR反応への効果を検討した。これらの結果は、立体構造から推察したD環炭素間二重結合の立体特異的な還元機構を支持するものであった。

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光合成生物には進化的起源の異なる2つのプロトクロロフィリド(Pchlide)還元酵素が存在し、このうち光非依存型酵素(DPOR)が暗所でのクロロフィル(Chl)生合成を決定づけている。光合成細菌のDPORはL-蛋白質(BchL)とNB-蛋白質(BchN-BchB)のという各々ニトロゲナーゼのFe-蛋白質とMoFe-蛋白質と類似した2つのコンポーネントから構成される。しかし、酸素発生型光合成生物においてDPORがどのように働いているか不明な点が多い。我々はラン藻Leptolyngbya boryanaのDPORのコンポーネントの機能発現及びその酸素耐性について報告する。L. boryanaのchlL欠損株とchlB欠損株において各々L-蛋白質(ChlL)及びNB-蛋白質(ChlN-ChlB)を発現させるといずれも暗所でのChl生合成能を相補した。これらL-蛋白質とNB-蛋白質を発現する2つの株の粗抽出液を混合することでDPORの活性を検出することに成功した。このアッセイ系を利用して2つのコンポーネントの酸素感受性を個別に評価した。その結果、L-蛋白質活性は酸素暴露により速やかに失活したが、NB-蛋白質活性は顕著な失活は見られなかった。これはL. boryanaにおいてDPORコンポーネントのうちL-蛋白質が酸素による失活の標的となっていることを示唆している。

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陸上植物では、クロロフィルbはクロロフィルaに転換された後分解することが知られている。クロロフィルb還元酵素は、この反応の第一段階であるクロロフィルbを7-ヒドロキシメチルクロロフィルaに還元する反応を触媒する。シロイヌナズナには2種類のクロロフィルb還元酵素（NOL、NYC1）が存在する。そこでクロロフィルb還元酵素の生理的役割を明らかにするため、nyc1とnolの様々な変異体を解析した。NOL過剰発現株においてはクロロフィルa/b比が高くなった。またNYC1欠損株は老化時のクロロフィル分解が抑制され、緑色を保つ（stay-green）という表現型を示したが、NOL欠損株は野生型と同じように、クロロフィルの分解が見られ、stay-greenの表現型を示さなかった。さらに我々は、NYC1欠損株が種子にクロロフィルを蓄積し、発芽率が低下するとともに、子葉の緑化が起こらないことを見出した。このように、クロロフィルb還元酵素は、光合成機能に留まらず、種子形成から、発芽、緑化、老化に至る過程で重要な役割を担っていることが明らかになった。また、これらの現象に対して、NOLとNYC1は異なった働きをしていることが示唆された。

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葉は老化時に黄変するが、これはクロロフィル分解により元来含まれていたカロテノイドが顕在化したために起こる現象である。クロロフィルおよびその中間代謝物は単独で存在すると光条件下では植物に大きな損傷を与えるため、植物はクロロフィル分解系を発達させている。このクロロフィル分解系に異常が起こった突然変異体は老化時も葉の色が緑色を保つ「stay-green」表現型を示す。これまでに我々はイネの「stay-green遺伝子」としてNYC1およびNOLを報告してきた。これらはクロロフィルbの分解の最初のステップを触媒するChlorophyll b reductaseをコードし、その突然変異体は葉老化の最後期ではクロロフィルa/b比がおよそ1になる。これはクロロフィルaとbをほぼ同量含むLHCIIの分解が特異的に抑制されていることによる。nyc3もクロロフィルの分解異常によりstay-green表現型を示す突然変異体であるが、クロロフィルa/b比は1にはならず、nyc1およびnolとは異なるタイプのstay green突然変異体であることが分かる。マップベースクローニングの結果、NYC3はα β hydrolase-fold family proteinをコードすることが分かった。NYC3のクロロフィル分解に関する機能について報告する。

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コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ（CPO）は、ヘムやクロロフィルに共通の生合成系においてコプロポルフィリノーゲンIIIを酸化的脱炭酸によってプロトポルフィリノーゲンIXに変換する酵素である。この反応にはO₂を電子受容体とするHemFとRadical SAMファミリーに属するHemNという構造的に全く異なる2種類の酵素が存在する。ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803のゲノムには既知のhemFと高い類似性を示すsll1185、既知のhemNと類似性を示すsll1876とsll1917が存在する。本研究ではE. coliで発現させた各タンパク質の酵素活性を検討することにより各遺伝子産物の機能同定を行った。Sll1185は好気条件でCPO活性を示したことから、Sll1185がO₂依存型CPO；HemFであることが確認された。一方、Sll1876及びSll1917の吸収スペクトルは共に[4Fe-4S]クラスターを有する特徴を示したが、Sll1876のみがNADHに依存したCPO活性を示した。この結果はSll1876がRadical SAM型CPO; HemNであることを示している。前回報告した生理学的な結果を含めると、Synechocystis sp. PCC 6803は好気条件ではHemF、嫌気条件ではHemNを主なCPOとしていることが示唆された。

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Prasinophyceae are primitive eukaryotic green algae. These ubiquitous marine picophytoplankton contribute considerably to global carbon-fixation. Prasinophytes contain unique antenna proteins, dubbed Lhcp, which predate modern light-harvesting complex (LHC). Ostreococcus tauri, the first prasinophyte to be completely sequenced, is an ideal species for primitive algal studies. Characterization of photosynthetic systems in this species will clarify early stages in eukaryotic photosynthetic evolution. In this study we isolated O. tauri LHC, photosystem I, and photosystem II complexes using sucrose density gradient centrifugation. This reveals novel PSI complexes formed by strong association with both Lhca (PSI-specific LHC) and Lhcp. Both this complex and purified PSI-core are devoid of the far-red chlorophyll fluorescence (>700 nm) typical of PSI in other oxygenic phototrophs. Here we discuss the implication of this PSI-Lhcp association and the full characterization of O. tauri photosynthetic components using a variety of biochemical techniques, including HPLC, spectroscopy, and proteomic identification by mass spectrometry.

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緑色硫黄細菌Chlorobium limicolaのアンテナ複合体クロロゾームは、光エネルギーを捉えて、光反応中心に一重項エネルギーを伝達している。クロロゾーム内のバクテリオクロロフィル(BChl) c会合構造とその全体構造形成における水の役割を、固体¹³C-NMRおよび²⁵Mg-NMR分光とX線回折を用いて解析した：(1)¹³C-NMR分光では、分子間¹³C磁気双極子相互作用と会合構造内の近接分子間炭素原子間距離が比較された。その結果、現在までに明らかとなっている溶液内BChl c異性体の会合構造およびBChl c異性体同族体混合物の固体会合構造の6種類から、固体会合体と同じweakly-overlapped dimers forming displaced layersが最適な会合構造として選ばれた。これにはBChl cの二量体累積構造と2種類の単量体様累積構造が内在している。(2)クロロゾーム内の会合構造の安定化における水の不可欠な役割が、脱水過程の追跡と、BChl c固体会合構造とのX線回折パターンの比較によって示された。会合体内の水配置の検討より水の結合部位に関する知見を得た。(3)²⁵Mg-NMR分光により、クロロゾーム内に2つの異なる四極子相互作用をもった²⁵Mg核の存在を検出した。それらは軸方向の水分子の有無によって説明され、二量体累積構造であることが証明された。

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