植物において、様々な防御応答を司るジャスモン酸メチル（MeJA）は、アブシジン酸（ABA）と同様に気孔閉口を誘導する。MeJAが誘導する気孔閉口シグナル伝達には様々な因子が関与していることが報告されている。シロイヌナズナのタンパク質脱リン酸化酵素2A（PP2A）のAサブユニットの1つであるRCN1は、根におけるオーキシンシグナル及び孔辺細胞におけるABAシグナルに関与することが知られている。以前の我々の研究は、RCN1が、孔辺細胞におけるMeJAシグナルにも関与しており、正の調節因子として機能することを示唆した。RCN1は、MeJAによる孔辺細胞内の活性酸素種の産生、内向きカリウムイオンチャネル活性の制御に必須である。
今回我々は、MeJAによる孔辺細胞内の一酸化窒素産生やカルシウムイオンチャネル及びアニオンチャネル活性の制御機構におけるRCN1の役割を明らかにする為に研究を行った。ここで得られた知見は、シロイヌナズナ孔辺細胞におけるMeJAシグナリングの新たなモデルを提唱する。

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光化学系 (PS) IIにおいて励起される電子がPS Iのそれよりも多いと、活性酸素が生成されうる。これを回避するためには、PS IIとPS Iの構築が同調していることが求められる。この調節に葉緑体遺伝子の転写を制御するσ因子 (SIG1) が関与していることを見いだした。すなわち、光が弱いとき、SIG1がリン酸化されることで光合成遺伝子の過剰な発現を抑制し、光が強くなったとき、脱リン酸化して遺伝子の転写を促進することで、効率的な光合成が維持されていると考えられる。
σ因子をリン酸化するタンパク質キナーゼを探索するために、コムギ無細胞タンパク質発現系とタンパク質間相互作用検出系であるAlphaScreen (PerkinElmer) を組み合わせた。RIKEN Arabidopsis Full-Length (RAFL) cDNAライブラリーを用い、SIG1と約800種のタンパク質キナーゼ遺伝子を発現させ、探索に供した。その結果、SIG1と相互作用を有する49種のタンパク質キナーゼ候補を得た。また、[γ-³²P]ATPを用いたリン酸化アッセイにより、コムギ抽出液中にSIG1のThr-170をリン酸化する活性を見出した。これらの中からSIG1を特異的にリン酸化するタンパク質キナーゼを特定するとともに、コムギ抽出液中に見いだしたタンパク質キナーゼの同定を試みた。

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植物の形態形成の基礎をなす細胞の運命決定には、個々の細胞の位置情報が重要である。この位置情報の伝達手段の1つである原形質連絡は、特に高分子シグナルの輸送に機能しており、その中で自身のSEL(サイズ排除限界)を調節し、高分子シグナルの輸送を制御することで、結果的に植物の発生に重要な役割を果たしていると考えられている。
原形質連絡のSEL制御は被子植物において解析が進んでおり、植物体の特定の部位や発生段階に応じてその時空間的な制御が確認されている。しかし、様々な分化状態の細胞によって3次元的に構築される被子植物では、個々の細胞におけるSEL制御の解析が困難であり、従って、SEL制御が個々の細胞の分化状態に及ぼす影響は未だ明らかではない。
そこで私達は、この問題に単純な体制をもつヒメツリガネゴケを用いて取り組んでいる。これまでに、ヒメツリガネゴケ原糸体の特定の細胞を破壊することにより、個々の細胞の位置情報を人為的に変化させ、細胞の増殖・非増殖を切り替えられる系を確立した。さらに、光変換型蛍光タンパク質を用いた高分子の細胞間移動の可視化にも成功した。また、細胞周期追跡用マーカーによる細胞周期の可視化も試みている。私達はこの3つの系を組み合わせ、ライブイメージングによる原形質連絡・細胞分化・細胞周期の動的関係の観察を通し、原形質連絡の時空間的なSEL制御を細胞レベルで解析している。

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細胞間相互作用を担う因子のグループの一つに、CLV3/ESR(CLE)ファミリーの遺伝子にコードされる12アミノ酸から成るペプチドの一群がある。その中でもCLE41、CLE42、CLE44の3種は互いに相同性が高く、それらの遺伝子は同じサブグループ（以下、TDIF-Like(TDL)サブグループ）に属す。これらのペプチドは、いずれも道管分化を抑制する活性がある。プロモーターGUSの解析ではCLE41とCLE44は維管束において強く発現しているのに対し、CLE42は維管束ではなく茎頂分裂組織や腋芽を中心に強く発現していた。
そこで我々は、TDLサブグループ遺伝子の維管束以外の働きについて調べることとし、CLE42、CLE41の過剰発現体を作成した。過剰発現体の表現形の解析の結果、これらのペプチドは既知の道管分化抑制活性のほかに腋芽の形成を促進する活性があることが明らかになった。ペプチドそのものを植物に投与する実験からもそのことが確かめられた。現在進行中の腋芽関連遺伝子の発現量の変化を追う実験の結果とあわせ、TDLサブグループペプチドによる腋芽の制御のしくみについて議論する予定である。

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SphSは、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803の無機リン酸欠乏応答に関わるヒスチジンキナーゼであるが、SphSがその刺激を認識する分子機構は未解明である。一般にヒスチジンキナーゼは、N末側でシグナルを受容し、C末のキナーゼドメインの活性を調節する。本研究では、SphSのN末端に存在する疎水性領域とPASドメインのシグナル応答に関わる機能を、改変型SphSをSynechocystis細胞内で発現させ、SphSに発現が制御されるアルカリフォスファターゼ(AP)の活性を指標として調べた。PASドメインの欠損やドメイン内の点アミノ酸置換によって、リン酸の有無に関わらずAP活性を誘導したことから、PASドメインがリン酸シグナルの受容に重要であることが示された。一方、疎水性領域の欠損はAP誘導性を消失したが、その疎水性領域を他のタンパク質の疎水領域と置換した場合は、APの誘導性は維持された。従って、SphSの疎水性領域は、シグナルの受容に直接関わっていないことが示唆された。SphSは、大腸菌で発現させると疎水領域依存的に膜局在性を示した。以上の結果から、SphSが活性を示すにはN末端の疎水性領域でいずれかの膜上に局在することが必須であり、そのリン酸応答性はPASドメインの機能により制御されていると考えられた。

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植物の病害、環境ストレス応答において、Ca²⁺はセカンドメッセンジャーとして中心的な役割を担っている。ストレスを感受した細胞では、光合成活性の低下、サリチル酸などのホルモン合成、 活性酸素種の生成など、葉緑体に関係した様々な応答が起こる。しかし、ストレスに応答して葉緑体内Ca²⁺濃度がどのように変化するか、詳細は分かっていない。今回我々は、エリシターや過酸化水素、さらに高塩ストレスや浸透圧ストレスに応答して、ストロマ内のCa²⁺レベルが一過的に上昇する直接的な証拠を見つけた。例えば、植物にエリシター flg22を処理すると、まず数分後に細胞質Ca²⁺濃度の一過的上昇が起こり、引き続き 15-20分後にストロマ内Ca²⁺濃度のゆっくりとした上昇がみられた。一方、高塩ストレスに対しては、一過的な速いCa²⁺濃度変化が細胞質とストロマの両方で見られた。このことから、感染や環境シグナルを迅速に葉緑体へ伝達し、特徴的なストロマCa²⁺濃度変化を引き起こす機構の存在が強く示唆された。我々は、葉緑体局在タンパク質CASが細胞質Ca²⁺シグナルの発生と気孔閉鎖の制御に関わっていることを明らかにしている（Nomura et al., 2008 Plant J）。CAS欠失変異体ではストロマ内のCa²⁺変化が抑制されることから、ストロマ内Ca²⁺濃度の制御にCASが関わっている可能性が考えられる。

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ブラシノステロイドは発生・成長・生殖などの植物生長の様々な過程で重要な生理機能を発現している。本研究は、ブラシノステロイド生合成阻害剤Brzを用いた化学遺伝学（ケミカルジェネティクス）により、ブラシノステロイド情報伝達機構の解明を試み、それらによる植物栄養成長期制御の分子機構の解明を目的としている。
暗所Brz存在下発芽において、胚軸が矮化し子葉が開く、暗所光形態形成を示さない胚軸徒長形質bil (Brz-insensitive-long hypocotyl)変異体は、ブラシノステロイド情報伝達の活性型突然変異体であると考え、細矮性slender dwarf様の特徴的な矮性形質を示す半優性形質のbil5を単離した。bil5遺伝子領域にはbisulfite sequence等によりエピジェネティック変異を同定し、この変異候補遺伝子の高発現体においてbil5形態が再現されたことから、変異遺伝子の同定に至ったと考えられた。また、受容体変異bri1-5bil5の二重変異体におけるエピジェネティック変異の検出、bil5変異体におけるブラシノステロイド応答性遺伝子群の高発現などから、bil5原因遺伝子はBRI1下流のブラシノステロイド情報伝達因子として機能する可能性が考察された。

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ブラシノステロイド（BR）は植物生長の様々な局面で重要な機能を果たしている植物ホルモンである。我々はBR情報伝達機構の解明を目指し、BR生合成阻害剤Brz存在下での胚軸伸長を選抜条件にして、ArabidopsisのアクティベーションタグラインからBR情報伝達変異体bil4 (Brz-insensitive-long hypocotyl 4)を選抜した。明所下で生育したbil4はロゼット葉の細小化と花茎の短化に基づく細矮性slender dwarf様の形態を示した。BIL4遺伝子として、7回膜貫通ドメインを持つ新規遺伝子が原因遺伝子であると同定した。BIL4プロモーター::GUS形質転換体の解析により、幼葉や根の初期細胞伸長帯においてBIL4の発現が観察された。また、GFP形質転換体のBIL4発現器官における解析により、BIL4タンパク質が液胞膜、TGNや初期エンドソームに局在していることが明らかになった。さらに、BIL4-oxではBR応答性遺伝子であるTCH4やSaur-AC1の発現が上昇していたことから、BRの情報伝達が活性化していることが考察された。以上の結果より、BIL4はTGNや初期エンドソームに局在してBRのシグナルを伝達し、BR応答性遺伝子の発現を調節することにより、初期の細胞伸長を引き起こすと考察された。

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ブラシノステロイド生合成阻害剤Brz存在下において、野生型シロイヌナズナは子葉およびロゼット葉の葉緑体発達による濃緑化が観察される。明所、Brz存在下において、緑化が促進されない低緑化形質を示す変異体として劣性のbpg2 (Brz-insensitive-pale green2) を単離した。zinc fingerとGTP結合ドメインを持つ新規遺伝子内にT-DNA挿入部位を同定した。BPG2遺伝子の相同遺伝子は、植物から緑藻、原核生物まで広く保存されていた。BPG2遺伝子の発現の解析では、緑化器官で発現量が高く、根では低いこと、暗所発芽後の光照射後1時間以内には発現が誘導されること、Brzにより発現量が増加することなどから、ブラシノステロイド情報伝達経路上での緑化と連動した機能が推察された。35S::BPG2-GFP形質転換体において、葉緑体でのGFP蛍光が観察された。葉緑体観察を行ったところ、bpg2変異体ではチラコイド膜構造の減少などの葉緑体発達異常が観察された。分子レベルでは、野生型ではBrz処理により葉緑体タンパク質の増加が観察されるのに対し、bpg2ではBrzによる増加は観察されなかった。葉緑体rRNAの16Sと23Sの前駆体の高蓄積が観察されたことからBPG2タンパク質は葉緑体rRNAのプロセシングに関与することが考察された。

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ブラシノステロイドは、細胞伸長や分裂、光形態形成、葉緑体制御などの生理活性を持つ植物ステロイドホルモンである。我々はブラシノステロイド情報伝達機構の解明を目指し、暗所、ブラシノステロイド生合成阻害剤Brz存在下での胚軸徒長を指標として、アクチベーションタグラインから半優性のbil2を選抜した。明所で生育したbil2の成熟個体は、ブラシノステロイド受容体過剰発現株BRI1-oxと同様なロゼッタ葉の上偏成長や葉柄伸長が観察され、ブラシノステロイド情報伝達が活性化していることが予想された。変異原因候補遺伝子は、細胞質に局在が予測される新規タンパク質をコードしており、タンパク質間の相互作用による細胞質内情報伝達に働いていることが期待される。
また、品種間差を利用したbil5の抑制因子の単離を試みている。bil5は、暗所、Brz存在下で胚軸徒長を示し、成熟個体は細矮性を示す。Columbia品種 (Col)由来のbil5変異体を近縁のLandsberg erecta品種（Ler)の野生型種と戻し交雑すると、成熟形質が野生型に復帰する株が出現することが観察されていた。このことから、Lerには、bil5遺伝子の機能を抑制するサプレッサー遺伝子が存在していると考え、バッククロス変異体の選抜とラフマッピングを進めている。

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アブシジン酸（ABA）は、種子休眠と発芽の調節に重要な役割を果たしている植物ホルモンである。我々はシロイヌナズナにおいて、AtNCED6およびAtNCED9によってコードされる9-シス-エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（NCED）が、種子におけるABA生合成に主要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。プロモーター・レポーター系およびin situ ハイブリダイゼーション、RT-PCRにより、AtNCED6は種子形成前期から中期にかけての胚乳において発現していることが明らかになった。一方、AtNCED9は種子形成中期の種皮および種子形成後期の胚において発現している。これらの結果は、ABA生合成が種子形成過程において、時期および組織特異的に調節されていることを示唆している。しかしながら組織特異的なABA生合成を調節する因子と、組織特異的に生合成されるABAの生理的役割はほとんど明らかになっていない。我々はAtNCED6およびAtNCED9のプロモーター解析をおこなうことで、複雑なABA生合成制御機構を明らかにすることを試みている。さらに、発達種子中で組織特異的にABAによって発現が制御される遺伝子の特定を進め、その生理的機能と作用機構の解明に取り組んでいる。

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Abscisic acid (ABA) regulates physiologically important stress and developmental responses. ABI1 encodes a protein phosphatase 2C that functions in early in ABA signaling. To address the mechanism of ABI1-mediated ABA signaling, we generated tagged ABI1 Arabidopsis expression lines in an abi1 knockout mutant and performed affinity column purification of ABI1-associated proteins. Transgenic tagged ABI1 plants show a strong ABA insensitive phenotype at the seed germination stage. After silver staining, visible bands overlapped with controls, and specific bands associated with purified tagged ABI1 samples were consistently observed. Mass-spectrometrical analyses allowed identification of proteins associated with ABI1. These included some known ABA signaling components. These results suggested that our strategy has the potential of identifying ABA signaling components. We found that a sub-group of gene family members interacted with ABI1 in an ABA dependent manner. The functional relationship between ABI1 and this protein family is being characterized.

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アブシジン酸（ABA）は、ストレス応答において中心的な役割を担う陸上植物に普遍的な植物ホルモンである。高等植物ではABA応答の分子制御機構が明らかにされつつある。一方、コケ植物などの下等陸上植物におけるABA応答の分子機構に関する知見は非常に少ない。本研究では、コケ植物におけるABA応答の生理学的解析とシグナル伝達機構の解明を目的とし、ABA応答の負の制御因子として知られるシロイヌナズナABSCISIC ACID INSENSITIVE 1(ABI1)の相同遺伝子MpABI1を苔類ゼニゴケから単離した。MpABI1はN末端に機能未知のドメインを持つPP2Cをコードする。蘚類ヒメツリガネゴケの一過的発現系において、MpABI1の過剰発現がABA誘導性プロモーターの活性を顕著に抑制した。この抑制効果はN末端ドメインを欠失させても維持され、PP2CドメインがABA依存的な遺伝子発現の抑制に十分であることが示唆された。また、MpABI1のPP2Cドメインを過剰発現するヒメツリガネゴケ形質転換体を作出し、ABA依存的なストレス耐性の変化を解析した。その結果、これら形質転換体においてABA処理による凍結耐性の上昇が顕著に抑制されていた。これらの結果はMpABI1が苔類におけるABA応答の負の制御因子であり、PP2CによるABA情報伝達の制御機構が陸上植物に共通であることを示唆する。

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植物の蒸散は主に葉の表面に存在する気孔を通して行われるため、植物個体の生育や生存には、気孔の開閉と気孔の分化の双方が調節され、成長段階や周囲の環境条件に適合した気孔の数や密度のバランスが保たれる必要がある。アブシジン酸（ABA）は水分の不足を感知して速やかに気孔を閉鎖させることが知られている。我々は前回の発表で、ABA非感受性であるabi1-1及びABA欠損株であるaba2-2変異体では野生型に較べて気孔密度が増大しており、ABAが気孔分化を抑制している可能性を報告した。今回行った経時観察の結果、野生型の葉の形成過程においては加齢によるABA量の増加に伴い気孔の分化が抑制され、表皮細胞が伸長することで葉面積が増大するが、aba2-2とabi1-1では野生型に比べて気孔が分化する期間が長期間に渡ることで表皮細胞が伸長できる期間が短縮され、植物体が小型化する要因となっていることがわかった。aba2-2における成長抑制はABAを与えることで回復したため、ABAは気孔閉鎖といった蒸散量の調節に関わるだけでなく気孔の分化を抑制することで、葉の成長段階が転換する時期の決定に関わっている可能性が示唆された。

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植物は刻々と変化する大気中の湿度を感知して、気孔の開閉を制御している。植物が低湿度にさらされた場合、気孔閉鎖に伴い、内生ABA量が増加することはよく知られている。一方、植物を高湿度に移行すると、1時間以内に内生ABA量が減少し、気孔が開放されることを我々は見いだした。高湿度に応答して、ABA 8’-水酸化酵素のCYP707A3とCYP707A1の遺伝子発現量が増加し、ABAの代謝産物が蓄積した。高湿度移行後、cyp707a1と cyp707a3変異体では気孔の開放が抑制され、さらに、これら二重変異体では気孔開放の抑制が向上した。興味深いことに、高湿度後の内生ABA量はcyp707a3変異体で高く維持されており、cyp707a1変異体では僅かな蓄積量であった。プロモーターGUSを用いた実験から、高湿度に応答してCYP707A1は主に孔辺細胞で、CYP707A3は維管束で染色が観察された。維管束が存在しない表皮細胞では、 cyp707a1 変異体のみが外からのABAに対して高感受性を示した。以上の結果から、高湿度に応答して、CYP707A3は維管束において植物全体の主要なABA量の不活性化を担い、孔辺細胞へ移動するABA量を調節しており、一方、CYP707A1は孔辺細胞において孔辺細胞自身の内生ABA量を制御して、気孔の開放に関与していることが示唆された。

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気孔は植物葉表皮に存在する水蒸気や二酸化炭素の通路となる孔辺細胞に囲まれた小孔で、乾燥・高濃度二酸化炭素・暗黒・菌の感染・植物ホルモンにより閉じる。いずれの場合もNOが関与しておりNOシグナル伝達は気孔のユビキタスな経路と考えられる。植物NOシグナル伝達研究の歴史はわずか10年に過ぎず伝達機構研究は緒に就いたばかりで多くの謎に包まれている。謎の一つに動物のNOシグナル主要経路である「NO/cGMP経路」が気孔で働いているかという問題がある。
cGMP合成酵素阻害剤でNO誘導性気孔閉鎖が阻害されるにも関わらず、細胞膜透過性cGMPは気孔の閉鎖誘導しないという矛盾する結果があり、この経路の存在に賛否両論がある。
澤らは（2007）cGMPが活性酸素とNOによりニトロ化されたニトロ-cGMPがマウス培養細胞で生成し二次シグナル分子として働くことを発見した。そこで我々はこの新シグナル分子が植物の気孔でも作用しているかを検討した。ニトロ-cGMPをシロイヌナズナ表皮に与えると気孔は閉鎖し、cADP-リボ－ス合成阻害剤であるニコチンアミドや8-ブロモ-cADPR、キレ-ト剤を加えると閉鎖が阻害されるが、ホスホリパ－ゼD阻害剤を加えても閉鎖は阻害されない。またニトロ化されないcGMPは暗所で気孔を開かせるがニトロcGMPはその能力はなく、気孔内で機能を分け合っていると考えられる。

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グルタミン酸は動物の中枢神経系のシグナル伝達物質として、習・記憶に深く関わっている。植物には中枢神経系に匹敵する組織器官はなく、グルタミン酸のシグナル伝達作用はないものと思われてきた。ところが、シロイヌナズナのゲノムプロジェクトが思わぬ結果をもたらした。動物グルタミン酸受容体のホモログが20種も見出されたのである。以来、植物グルタミン酸受容体の研究が根を中心に始まり、今では動物と同様にグルタミン酸が受容体に結合するとイオンチャンネルが開放され、Caイオンが流入し、細胞内Caイオン濃度が上昇、様々な生理作用をもたらすことが明らかになってきた。今回、我々はグルタミン酸が気孔閉鎖を誘導することを明らかにしたので報告する。グルタミン酸の投与により気孔は閉鎖するが、EGTAやBAPTA-AMなどのCaキレ－ト剤および一酸化窒素合成酵素阻害剤で閉鎖は阻害され、細胞内Caイオンの上昇と一酸化窒素の合成を通じてシグナルが伝達されていると考えられる。

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根が、土壌中の水分勾配を的確に感知して、より水の多い方向へ伸長していく現象として、水分屈性が知られている。これまでの生理学的な解析から、根は、根冠部で水分勾配を感知し、アブシジン酸やカルシウムなどを介してシグナルが伝達され、伸長帯領域の水分の多い側と少ない側とで偏差成長が起こり屈曲すると考えられている。しかしながら、その分子機構はほとんど解明されていない。そこで我々は、水分屈性の分子機構を解明するため、遅延型の水分屈性を示す変異体を単離し、その原因遺伝子が K⁺ チャネルをコードする AKT2 遺伝子であることを明らかにした。さらに、AKT2 遺伝子は、根の屈曲部位である伸長帯において、ABA によって発現が誘導されることを示した。今回我々は、水分屈性時の AKT2 の役割を明らかにするために、pAKT2::GUS 形質転換体を用いて AKT2 遺伝子の発現部位を検討した。その結果、水分勾配非存在下では、根の伸長帯領域の篩部で、均一な AKT2 遺伝子発現が観察された。一方、水分勾配条件下では、低水分側（屈曲する根の外側）の篩部に高頻度で、AKT2 遺伝子発現が観察された。このことは、水分屈性時の AKT2 遺伝子の偏差的発現が、水分屈性に重要な役割を果たすことを示唆している。

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茎頂分裂組織(SAM)から供給された細胞はそれぞれ個別の特殊化した細胞へと分化する。この過程は基本的に一方向的であり、分化運命決定を受けた後、その状態をエピジェネティック制御によって維持し続ける。我々はEMSで変異誘起したシロイヌナズナからbouquet-1 (boq-1)変異体を分離した。boq-1は劣性一遺伝子座の変異で、花茎の数の増加や帯化等の顕著な地上部表現型を示す。 花茎表現型は発芽後に多数のSAMが茎頂や葉柄基部において発生することによる。これらのSAMは外観上、機能上、またSHOOT MERISTEMLESS (STM)遺伝子依存的である点でも胚性SAMと区別できない。以上の結果は、boq-1においてSAMから供給された分化途上にある細胞が脱分化してSAM形成に至るという考えを示唆する。boq-1変異はまた、stm変異体における不定芽形成能を昂進すると共に、stmやwuschel変異体の不完全な花器官形成を部分的に抑圧した。遺伝子クローニングの結果、BOQ遺伝子はWD40リピートタンパク質をコードすることが判明した。boq-1変異は一アミノ酸置換を伴うミスセンス変異であり、野生型背景での変異タンパク質の過剰生産はboq-1変異に似た表現型をもたらす。これらの結果はBOQ遺伝子が細胞分化のエピジェネティック制御に何らかの役割を果たしていることを強く示唆する。

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子葉は胚発生期に形成される器官であり、その形成にはオーキシンが重要な役割を果たす。しかしながら、オーキシンを介した器官形成の分子機構の詳細は未だ不明な部分が多い。私たちは、子葉の形成に関与する因子の単離を目的として、pinoidエンハンサーmacchi-bou（mab）変異体のスクリーニングを行い、mab2変異体を得た。pid単独変異体はまれに三つ葉の子葉を形成するという表現型を示すが、mab2 pid二重変異体は子葉を完全に欠失する。そして、mab2変異体は単独でも子葉の形態、ポジショニングに異常を示し、胚発生初期の胚で分裂異常が観察された。mab2変異体では、マップベースクローニング法により、メディエーターの制御複合体をコードしている遺伝子に点変異が生じていた。さらに、その遺伝子のT-DNA挿入株もmab2変異体と同じ表現型を示した。また、酵母two hybrid実験から、MAB2は他のメディエーター構成因子と相互作用しうることが示された。これらの事から、MAB2はシロイヌナズナにおけるメディエーターの制御複合体として機能している可能性が示唆された。

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私たちはこれまでに、NACドメインタンパク質をコードするVND7 (Vascular-related NAC domain protein 7)が、道管分化のマスター制御因子として機能していることを明らかにした。本研究では、VND7と相互作用する因子をtwo-hybrid法により探索し、新規のNACドメインタンパク質をコードするVNI2 (VND-Interacting 2)を同定した。トランジェントアッセイを行ったところ、VNI2はVND7が持つ転写活性を抑制することが明らかとなった。またプロモーター解析により、道管分化過程の初期の細胞ではVNI2とVND7がともに発現しているのに対し、分化がより進行した細胞ではVND7のみが発現していることが明らかとなった。そこで分化過程におけるVNI2の発現を延長させる目的で、VNI2遺伝子をVND7プロモーター制御下で発現させた形質転換体を作成したところ、得られた植物体では道管分化が強く抑制された表現型が観察された。これらの解析結果より、VNI2は道管分化の初期過程でVND7と結合し、VND7の機能を阻害しているものと推測された。

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シロイヌナズナの根の維管束は、中心柱の直径を結ぶ点となる最外層の二か所に原生木部が形成され、この原生木部軸と直交する直径を結ぶ二か所に原生篩部が作られる二元型の構造をとる。この対称性を持つ維管束パターンの形成は発生段階で厳密に制御されていると考えられる。しかしながら、その分子機構に関してはよくわかっていない。そこで私達は根の維管束パターンを制御する分子機構に迫るため、その対称性が失われる変異体lonesome highway (lhw) を単離し解析を進めている。lhw変異体は、野生型では二本のラインとして観察されるxylem pole pericycleのマーカーJ0121の発現が一つになるものとして単離された。lhw変異体の根は、一つの原生木部、一つの原生篩部のみが形成される一元型の維管束パターンとなっていた。また、。lhw変異体の維管束では細胞数の減少が観察された。LHWの原因遺伝子はbHLHをコードするタンパク質であり転写因子であると考えられる。そこで現在、LHWと相互作用する因子の解析および作用機構の解析を進めている。

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我々は、シロイヌナズナの根特異的に遺伝子発現を活性化する独自のアクティベーションタギング法を開発し、根端メリステムのパターン形成に異常を示す優性変異体(UAS-tagged root patterning, urp変異体)を複数単離した。これらのうち、urp4とurp5は互いに相同性をもつ新規な転写因子様タンパク質の過剰発現により、根の細胞分裂が異常に亢進していた。URP4とURP5の機能欠損型変異体には顕著な異常は見られなかったが、同じファミリーに属する別の遺伝子の変異体の芽生えでは、根端分裂組織が高頻度に欠失していた。一方で、胚発生後においては主根の成長以外に異常は見られず、側根や不定根が正常に形成されるために野生型と同様の成長を示した。この変異体の胚発生過程を詳細に観察したところ、発生初期から胚柄の分裂と伸長が抑制されており、根端分裂組織の発生に重要なレンズ型細胞が見られなかった。また胚の上部にも異常が見られ、子葉原器の数や成長が野生型と異なっていた。この遺伝子は胚発生で特異的に発現し、初期胚では胚柄と胚全体で、中期以降は胚柄に発現が限定していた。酵母をもちいた実験により、このタンパク質のアミノ末端側の領域に転写活性化能が見出された。以上の結果は、この新規な転写因子様タンパク質が、胚の軸形成やパターン形成に重要な機能を果たしていることを示唆している。

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高等生物は複雑な構造をもつが、それらは全て受精卵という単一細胞に由来する。高等植物の受精卵は高度な細胞極性をもち、その不等分裂によって異なる発生運命をもつ娘細胞を生じる。この際の軸性は成熟体の頂端?基部軸に相当するが、初期発生の過程で体軸が形成される仕組みについては現在でもほとんど分かっていない。
シロイヌナズナのホメオボックス型転写因子をコードするWOX8 (WUSCHEL RELATED HOMEOBOX8)遺伝子は受精卵で発現し、その不等分裂後には一方の基部側の娘細胞にのみ発現が受け継がれる。その後も胚発生後期に至るまで、WOX8は基部細胞系列のみで発現を続け、胚のパターン形成に重要な役割を果たすことが明らかとなってきた。我々の解析から、WOX8の非対称発現は既知の軸性因子には依存しないこと、およびその発現は複数の異なるcis配列により冗長的に制御されることが判明した。これらのcis配列に結合する転写因子群を同定したところ、それら欠損株では受精卵におけるWOX8の発現レベルが低下し、胚での発現領域が縮小した。さらに、受精卵の細胞極性や胚の軸性も損なわれたことから、これらの転写因子は体軸形成に必須の新規制御因子群であることが明らかとなった。

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高等植物の地上部の器官はすべて茎頂分裂組織（Shoot Apical Meristem: SAM）から形成される。SAMの機能を正常に維持するためにはサイトカイニンが必須である。イネのLONELYGUY（LOG）遺伝子はサイトカイニン生合成の最終ステップを触媒する酵素をコードし、SAMの活性を制御している。log-6変異体のSAMは胚発生初期から野生型のSAMより小さく、生殖成長期になると消失してしまう。そして、log-6変異体でSAMが小さいことの原因はSAMの細胞数減少であったことから、サイトカイニンはSAMの細胞分裂を促進することが示唆された。
サイトカイニンによるSAMの細胞数制御についてより詳細に解析するために、LOG過剰発現体(LOGox)を作成し、その表現型を観察した。LOGox植物は外見上の異常は認められなかったが、複数の系統において種子発芽時に複数のシュートが発生するという表現型が観察された。これは、胚発生においてサイトカイニンがSAM形成に関わることを示唆している。イネでは、受精後3日目にSAMの位置が決定し、4日目にはSAM原基が確認できる。しかし、SAM形成におけるサイトカイニンの機能は明らかになっていない。LOGox植物の胚発生を詳細に解析することにより、新たな知見が得られるものと期待される。

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ニンジン不定胚発生阻害因子4-hydroxybenzyl alcohol（4HBA）は、胚発生能力を有する細胞（embryogenic cells）より放出され、液体培養時には不定胚発生を阻害する。我々は、2007年度48回年会において、胚発生能を誘導したニンジン実生胚軸を固形培地上で培養した際、4HBAの類縁化合物であるvanillyl alcohol（VA）が不定胚発生を阻害せずにむしろ促進することを報告した。また，4HBAとVAがシロイヌナズナの不定胚発生に対しても阻害俣は促進効果を持つことを見出した（植物生理学会49回年会）。
今回我々は、様々なシロイヌナズナアクセッションの不定胚発生に対する4HBAおよびVAの効果について報告する。いくつかのアクセッションについて調査したところ，一部のアクセッション，例えばTsu-0やKl-1の不定胚発生は，それぞれ4HBAによって阻害的，またはVAによって促進的な影響を受けた。これらを含めたaccession毎の効果を示し，4HBAおよびVAのシロイヌナズナ胚発生における作用について考察する。また，4HBAやVAが胚発生特異的遺伝子の発現に与える影響についても解析する。

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糸状性シアノバクテリアには、窒素飢餓状態になるとヘテロシストを形成するものがある。ヘテロシストは窒素固定に特化しており、分裂しない。Anabaena sp. PCC 7120はヘテロシスト形成のモデルとして、遺伝学的・生理学的研究に詳しく研究されてきた。この糸状体は約10細胞に1個という間隔でヘテロシストを形成し、1本の糸状体の中で光合成と窒素固定を分業している。ヘテロシスト分化については、関連する多くの遺伝子が同定されており、ヘテロシスト分化において細胞分裂が必須であるという報告もある。また、これまでの研究は、振とう培養によって得られるヘテロシスト間距離をヘテロシストから栄養細胞への窒素供給や阻害物質分泌による細胞分化阻害によって説明するものであった。最初にヘテロシストに分化する細胞の決定はランダムと見なされていた。本研究では、Anabaena sp. PCC 7120 を用い、ヘテロシスト分化の過程を継時観察する方法を確立し、ヘテロシストパターンの経時的変化、ヘテロシスト分化とフィコビリン蛍光との関係、将来ヘテロシストに分化する細胞の窒素飢餓開始時における位置などのデータをもとに、窒素飢餓開始時における4細胞のセットがヘテロシスト分化に重要であることを明らかにし、ヘテロシストパターン形成について新たなモデルを提案する。

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Pentatricopeptide repeat (PPR) タンパク質は陸上植物で数百個の巨大な遺伝子ファミリーを形成しており、植物の発生、分化、生殖など様々な生理現象に重要な役割を担っていると考えられている。PPRタンパク質の主要な機能として、ミトコンドリアや葉緑体のRNA前駆体のプロセシングに関与することが報告されているが、大多数のPPRタンパク質については未解明である。我々は、初期の陸上植物であるヒメツリガネゴケのPPRタンパク質遺伝子について、網羅的な遺伝子破壊株の作製を行っているが、今回、非常に興味深い表現型を持つPpPPR_63遺伝子破壊株を得たので報告する。表現型の異常として、1）原糸体コロニーの生長の遅延、2）側枝始原細胞の球状化、3)分枝数の増加が観察された。PpPPR_63はPPRモチーフ以外にC末端にヌクレアーゼ活性を持つと推測されるNYNドメインを持っている。PpPPR_63の細胞内局在を明らかにするため、遺伝子の3´端のエキソンに緑色タンパク質 (GFP) コード配列をノックインした安定形質転換体を作製し、GFP蛍光の局在性を観察した。その結果、PpPPR_63は原糸体、仮根および芽の細胞核に局在することが明らかになった。このことから、PpPPR_63は原糸体、仮根および芽の生長や分化に関与している可能性が示唆される。

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植物細胞は動物と比較して、分化した後も多能性幹細胞へと分化転換する能力が高い。モデル植物のヒメツリガネゴケでは、切断した葉を培養すると、24時間以内に切断面の近傍の細胞が先端成長、分裂を開始し、原糸体頂端細胞として機能するようになる。この原糸体頂端細胞は完全な植物体を作る事ができる多能性幹細胞である。私たちは分化転換過程で促進的に機能する制御因子の探索を目的として、カスタムマイクロアレイによる葉切断後の継時的な転写解析を行い、以下の条件で遺伝子の絞り込みをおこなった。
1)切断直後は検出できないが葉の切断後6、12時間目に発現する。
2)切断直後と比較して6、12時間目に8倍以上の発現がある。
3)葉の切断後1時間以内に一過的に発現上昇を示す。
この3条件のいずれかにあてはまる遺伝子の中から29個の転写因子を見いだした。次に、この転写因子群に転写抑制領域SRDXを融合させたタンパクを温度依存的に発現させ、共通の標的遺伝子の発現を誘導する因子の存在にかかわらず標的遺伝子の発現を抑制する形質転換株を作成した。その結果、bZIP型転写因子No.195のSRDX融合タンパク発現株において、切断葉細胞の分化転換効率が著しく低下し、細胞周期再開の示標であるサイクリンDの発現が抑制された。これらの結果から、No.195は分化転換過程において何らかの機能を持つことが強く示唆される。

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次世代シークエンシングはディープシークエンシングとも呼ばれ、得られる情報量の膨大さでゲノミクスを変えつつある。我々のグループは、チューリヒ機能ゲノミクスセンターに導入された454シークエンサー（スイス・ロッシュ）を活用している。454シークエンサーの1晩のランにより、長さ400 bpの配列が100万フラグメント以上得られる。すでに454シークエンサーは、微生物コミュニティの同定やメタゲノミクスに使われている。これは、培養や配列クローニングによるバイアスを避けて、BLASTサーチに十分な長さのDNAシークエンスが直接得られるからである。我々のグループでは、植物と微生物の相互作用に着目して、食虫植物内に生息するバクテリアの解析を行っている。また、ゲノム情報がほとんど得られていない「非モデル」植物の解析も454シークエンサーを用いてすすめている。

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シロイヌナズナでは26種類ものα-エクスパンシン遺伝子の存在が知られており、果実の成熟、分裂組織の原基形成、組織脱離、花粉管伸長など様々な形態形成の場において機能していることが示されてきている。DNAマイクロアレイ解析の結果をもとに、今回我々は伸長生長を行う胚軸や花茎において高発現しているAtEXPA1、4、6、15に着目し、軸性器官の伸長生長とエクスパンシン機能との関わりについて解析を行った。T-DNA挿入変異株の表現型を観察したところ、atexpa1およびatexpa15変異株において発芽直後の芽生え下胚軸が野生株に比べて短くなる傾向にあり、二重変異株では有意に短くなった。プロモーターGUS解析の結果、AtEXPA15はこの時期の下胚軸において特徴的な発現が観察されたことから、AtEXPA15と下胚軸の伸長生長との関与が示唆される結果が得られた。現在、変異株の表現型の詳細観察とAtEXPA1の発現パターンの解析を行っているので、それらの結果を合わせて報告する。

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当研究室で単離されたポプラペルオキシダーゼアイソザイムCWPO-Cは、シナピルアルコールや高分子モデル基質であるシトクロムcタンパクを酸化可能であり、その触媒機能から、細胞壁内でのリグニン脱水素重合への関与が示唆された。また、CWPO-Cタンパク質表面に露出した74番および177番チロシンが、高分子基質に対する酸化部位として候補に挙げられた。そこで本研究では、シロイヌナズナにおけるCWPO-Cホモログ遺伝子に着目し、そのT-DNA挿入変異体の表現型解析を試みた。
今回検討した7種すべての変異体において、目視による顕著な表現型の変化は確認できなかった。6週齢の変異体NO. 6、NO. 7のみで、主茎比重が野生型と比較してそれぞれ16.9、23.7、28.8％減少し、リグニン定量の結果、野生型と比較して変異体NO. 6で12.6%、NO. 7で15.9%のリグニン量の減少が確認された。またDFRC法によるリグニン構造分析の結果、リグニン当たり分解物の収率とS/G比の増加傾向が確認された。以上の結果からTyr-177を有するAT2g41480、およびTyr-74を有するAT1g05240はシロイヌナズナのリグニン生合成に関与する予想されると共に、Try-74および／あるいTyr-177の重要性が示唆された。

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アラビノガラクタン-プロテイン（AGP）は原形質膜や細胞壁に存在する植物に普遍的なプロテオグリカンで、様々な生理現象に関与する。AGPの糖鎖はβ-3,6-ガラクタンを骨格とし、側鎖にはL-アラビノース（L-Ara）や4-O-メチルグルクロン酸（4-Me-GlcA）、グルクロン酸（GlcA）が結合する。細胞表層タンパク質の多くがアラビノガラクタン（AG）糖鎖化を受ける可能性が指摘されているが、AG糖鎖の生理機能は明らかにされていない。今回、糖質分解酵素を用いたAG糖鎖の構造改変を試みた。ゲノム情報を利用して真菌のα-L-アラビノフラノシダーゼ（Arafase）とβ-グルクロニダーゼ（GlcAase）をクローニングし、ピキア酵母により組換え酵素、rArafase及びrGlcAaseを作成した。rArafaseはin vitroでダイコン成根由来AGPに作用し、L-Araを遊離した。rGlcAaseは単独ではほとんどAGPに作用しなかったが、rArafaseと協調的に作用させると、L-Araとともに4-Me-GlcAやGlcAを遊離した。Arafase遺伝子とGlcAase遺伝子をシロイヌナズナに導入したところ、組換え植物ではそれぞれの活性が野生型植物の10倍以上に増加した。現在、AGP糖鎖の構造改変が表現形質に与える影響を解析している。

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UDP-アラビノースムターゼ (UAM) は植物の糖ヌクレオチド代謝経路においてUDP-アラビノースの5員環、6員環の相互変換を行う酵素であり、アラビノフラノース残基を含む多糖類や糖タンパク質の合成に必須である。UAMはRGP (Reversibly glycosylated polypeptide) と命名された、UDP-グルコースと可逆的に結合するタンパク質と同一である。しかし、UAMがこのRGP活性とムターゼ活性の2つの活性を併せ持つ生物学的意義は不明である。そこで我々は、RGP活性により糖を結合するアミノ酸残基の特定ならびにそのアミノ酸残基のムターゼ活性への関与を調べた。UDP-グルコースと反応させたUAMをLC/MS分析に供したところ、グルコースは158番目のアルギニン(R158)残基に結合していた。このR158を含む3つのアルギニン残基をアラニンに置換したUAMを作成しムターゼ活性を比較した結果、R158A置換体ではムターゼ活性は検出されなかった。一方、R151A置換体は非置換体と同程度のムターゼ活性を有し、R165A置換体では非置換体の6%程度の活性が見られた。これらの結果からR158が糖と結合するアミノ酸残基であり、RGP活性とムターゼ活性は同一のアルギニン残基上で起きることが明らかになった。

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イネ、オオムギ、トウモロコシなどのイネ科植物には、二次細胞壁の構築が異常なために植物体が脆く折れやすいカマイラズ (brittle culm : bc) 変異体が存在する。イネにはカマイラズ変異体が7種類存在するがbc5変異体は唯一節のみでカマイラズ形質を示す。節はイネ科植物で発達した器官であり、これまでに節で異常が見られる細胞壁変異体は報告されていない。また、bc5変異体のカマイラズ形質は出穂後に現れることから、BC5は節の二次細胞壁構築に関与すると予想される。今回我々はBC5の節の二次細胞壁構築における機能を明らかにするため、bc5変異体と正常系統の細胞壁を比較した。bc5変異体の節の厚壁組織は細胞壁染色試薬であるサフラニンやリグニン特異的染色試薬であるフロログルシノールに染まりにくく、細胞壁の厚さも薄くなっていた。bc5変異は節のセルロース、ヘミセルロース量に影響し、糖量でそれぞれ47%、35%減少していた。構成糖分析、メチル化糖分析の結果から、bc5変異体の節のヘミセルロースでは特にアラビノキシランが減少していることが示唆された。これらの結果より、BC5は節の厚壁組織においてセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどの二次細胞壁成分全体の蓄積を制御すると予想される。

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全ての植物細胞が持つ一次細胞壁に対して二次壁（＝木質）は茎や胚軸、葯、鞘などの限られた組織にのみ形成される。私たちは植物特異的転写因子ファミリーであるNACファミリーに属するNST1、NST2、NST3（=SND1）転写因子が、茎や胚軸の繊維細胞、葯、鞘の内被細胞など、道管以外における二次壁形成を根本的に制御するマスター転写因子であることを明らかにした。本研究ではNST1過剰発現植物、nst1 nst3二重変異体などでのマイクロアレイ解析の結果からNST転写因子の下流で働く転写因子群をリストアップした。そしてそれらをNST3プロモーターによりnst1 nst3二重変異体に発現させたときに表現型を回復できるか、過剰発現したときに異所的な二次壁形成を引き起こすか、CRES-T法を適用したときに二次壁形成に影響が現れるか、プロモーターの活性が二次壁形成部位に見られるか、などを指標として妥当性を検証した。その結果MYB46を中心とするMYB転写因子群、NST転写因子群とは異なるサブファミリーに属するSND2を中心とするNAC転写因子群が複雑な制御関係を構成してNST転写因子群の下流で働いているらしいことがわかってきた。本発表では現時点で明らかになった二次壁形成過程における転写制御ネットワークを概説する。

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熱帯雨林の早生樹種ファルカタは、地球上で一番成長の早い樹木である。ファルカタは、マメ科の樹木であるため、根粒菌(Rhizobium属)と共生して空気中の窒素を固定する。更に、菌根菌(phosphorus-promoting mycorrhizal fungi)とも共生してリンも獲得できる。
ポプラのセルラーゼを構成発現するファルカタは、野生株と比較してセルロース量は変わらなかったが、キシログル量が減少した。このセルラーゼは、セルロースミクロフィブリル表層の非結晶部位を分解し、そこに編み込まれているキシログルカンを除去する。その結果、細胞壁の塑性が増大し、成長が促進された。また、葉の開閉運動は、葉の基部にある運動細胞(motor cell)の急速な膨圧変化によって起こるが、細胞壁の力学的性質が変わったため、昼夜の膨圧変化に敏感に対応するようになった。
そこで、本研究では、セルラーゼを構成発現するファルカタ木部における糖化性、およびエタノール生産量について検討した。形質転換ファルカタ木部における糖化レベルは、野生株に比較して増加した。木部キシログルカンの除去が糖化性の向上をもたらしたと推察される。

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ポリガラクツロン酸は、ペクチン構成糖鎖として高等植物の一次壁や細胞間層に存在し、植物組織の分化・形態形成に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、ポリガラクツロン酸を加水分解するポリガラクツロナーゼをポプラで過剰発現させ、形質転換体の性状について解析した。CaMV 35Sプロモーターを用いてリンゴ由来のポリガラクツロナーゼ遺伝子を構成発現させた。形質転換ポプラの細胞壁は、野生型と比べてガラクツロン酸量が減少した。形質転換ポプラは、茎の伸長・肥大成長が野生型と比べて遅くなった。茎横断切片の顕微鏡観察の結果から、形質転換ポプラは各組織における細胞の径が野生型より小さいことがわかった。また、木部繊維細胞を解繊し、顕微鏡観察により繊維長を計測したところ、形質転換体において繊維長が短いことが認められた。このような矮性の表現型は、これまでにタバコおよびシロイヌナズナで報告されているポリガラクツロナーゼ発現形質転換体と一致した。

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ペクチンメチルエステラーゼ（PME）はペクチンのメチルエステル基を脱メチル化する酵素である。 PMEはファミリーを形成し、ペクチンの脱メチル化により細胞壁の力学的特性を調節する機能を持つと考えられているが、個々の遺伝子の生理機能は未解明である。私たちは、シロイヌナズナの細胞壁関連遺伝子群の網羅的な解析に基づき、PME遺伝子の一つであるAtPME61が花茎の中部から基部に掛けて、皮層周辺の組織で特徴的な発現を示すことを見出し、その遺伝子の役割について解析を進めてきた。その結果、AtPME61は花茎の支持組織形成において重要な役割を担うことを示す結果を得たので報告する。
AtPME61遺伝子を欠損したT-DNA挿入変異体pme61は、野生型に比べて花茎が細く、力学的な強度も低下していた。pme61変異体の花茎基部の皮層周辺を観察したところ、特定の細胞列での形態異常が見られた。JIM5及び JIM7抗体を用いた免疫蛍光抗体法による観察からpme61変異体では花茎基部の皮層周辺の細胞で細胞壁のメチルエステル化率が高く、またPME酵素活性の測定結果より花茎基部でPME活性が顕著に低下していることをそれぞれ明らかにした。以上より、AtPME61はシロイヌナズナ花茎の基部において主要なPMEとして働き、花茎の支持組織形成に必須の役割を担っていると結論づけた。

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キシログルカンはタイプ1と呼ばれる細胞壁において、セルロース微繊維間を架橋している主要なマトリックス高分子である。エンド型キシログルカン転移酵素/加水分解酵素(XTH)は、このキシログルカンの切断や繋ぎ換えを触媒することで、細胞壁の構築・再編をもたらす。一方、ツユクサ亜綱の単子葉植物の細胞壁はタイプ2と呼ばれ、キシログルカンはその含量や分子構造から架橋性構造は担っていないとされてきた。しかし、タイプ2細胞壁をもつイネにおいても、ゲノム上に29のXTH遺伝子が存在することが明らかとなった。これらの遺伝子は器官・発生段階毎に様々な発現様式を示し、イネ細胞壁においてもXTHは何らかの重要な機能をもつ可能性が考えられた。
そこで本研究ではイネ細胞壁におけるXTHの役割を解明するため、葉身や節間の伸長域で特異的に高い発現を示すOsXTH19に着目した。OsXTH19の組換えタンパク質を用いて酵素活性の測定を行った結果、OsXTH19はキシログルカンの転移活性と加水分解活性の両方をもつことが明らかとなった。このことから、イネ細胞壁においてもキシログルカンが何らかの役割を担っていることが示唆された。OsXTH19欠損変異体やpromoter::GUS形質転換体の解析等の結果と合わせて、イネ細胞壁におけるキシログルカンやXTHの機能を考察する。

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エンド型キシログルカン転移酵素/加水分解酵素（XTH）はキシログルカンの繋ぎ換えまたは分解反応を触媒する酵素であり、結晶性セルロース微繊維とキシログルカンの架橋構造から成る細胞壁の構築・再編には必要不可欠な酵素である。これまでの研究で、種子植物においては、XTH遺伝子が大きな遺伝子ファミリーを形成していること、そして各XTH遺伝子メンバーがそれぞれ特定の組織で働いていることが明らかになっている。これらの事実から、種子植物においては、多様化した組織の細胞壁構築・再編のために多数のXTH遺伝子が派生してきたことが示唆されている。一方、維管束を持たず、細胞型が比較的少ないとされるコケ植物のXTH遺伝子構成についての知見はほとんどない。そこで我々は、ヒメツリガネゴケのゲノム情報を用いて、コケ植物のXTH遺伝子ファミリーの全容解明を試みた。この結果、ヒメツリガネゴケにおいても、種子植物と同じ規模のXTH遺伝子ファミリーが存在することが判明したが、コケの中には種子植物のXTHとは全く構造の異なるXTHが多数存在することも明らかになった。我々は、コケ固有の新規XTHについて、発現解析と逆遺伝学的手法による機能解析を行い、コケ独自に派生したXTH遺伝子群の役割の解明を目指している。

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ミトリササゲ下胚軸の伸長成長部域より、トリプシン処理ウサギ赤血球凝集活性を指標に、各種クロマトグラフィーを用いて分子量25kDのレクチン様タンパク質を単離した。そこで仮にVigna lectin 25（VL25）と名づけたそのタンパク質の性質について報告する。
VL25の赤血球凝集活性には強いpH依存性があり、pH7のリン酸緩衝液中では活性を示したが、pH5以下では全く活性を示さなかった。またVL25の赤血球凝集作用はガラクトースの添加によって阻害された。
抗イールディン（Yieldin;YLD）抗血清を用いたwestern blotting解析の結果、抗YLD 抗血清がVL25を認識したことから、VL25とYLDは共通の分子構造を有していることが示唆された。YLDはミトリササゲ由来の、細胞壁の力学的性質の調節に寄与していると考えられている、分子量約30kDの細胞壁結合性タンパク質である。
以上の結果から、VL25は、YLDの一部か、ごく近縁のタンパク質で、ガラクトース結合性レクチン活性を持つものであると考えられる。従ってその解析を通じてYLD作用機構の解明の糸口が得られる可能性がある。

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短日植物であるキクでは花成における限界日長に系統間差が存在する．我々は二倍体野生ギク，キクタニギク（Chrysanthemum seticuspe f. boreale）の中で，約12時間の限界日長を持つNIFS-3系統と約13時間の限界日長を持つMatsukawa-1系統を材料として花成制御機構の解明を試みた．キクタニギクよりFT/Hd3aと相同性を示すCsFTL1, CsFTL2およびCsFTL3を単離した．さらにAP1と相同性を示すCsAFL1およびCsM111を単離し，LFYと相同性を示すCsFLを単離した．FT-Like遺伝子の中で，CsFTL3は両系統において，日長の短縮に従って葉で発現が誘導された．花成が誘導される短日条件において，茎頂部におけるCsAFL1の発現が上昇した後，CsM111とCsFLの発現が上昇する傾向が見られた．限界日長付近におけるCsAFL1，CsM111，CsFLの発現パターンはNIFS-3系統とMatsukawa-1系統において差が見られた．以上の結果からキクタニギクにおける，光周性花成誘導時の葉と茎頂部における花成関連遺伝子の動態について考察する．

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日長に影響されずに花成が起きる中日性植物のトマトには、FTクレードに属するホモログとしてSP3D、SP5G、SP6Aの3遺伝子が存在する。SP3D遺伝子の突然変異体は、single-flower trussと呼ばれ、遅咲き表現型を示すので、SP3Dは花成遺伝子の一つと考えられている。しかし、他の2遺伝子については、その機能は明らかになっていない。
アラビドプシスでは、FT遺伝子の発現は日長と概日リズムの影響を受けていることから、トマトにおけるSP遺伝子群の発現の日周変動を各日長条件下で調べた。その結果、SP3Dは日長に応答せず一定の低い発現を示したが、SP5Gは長日条件では日の出4時間後にピークを示し、短日条件ではほとんど発現がみられなかった。また、SP6Aの発現はほとんど検出できなかった。また、栽培トマトの近縁野生種について、各遺伝子の発現を調べたところ、SP5Gの発現パターンはほぼ同じであったのに対し、SP3Gの発現パターンは、いくつかの短日性トマトにおいて、短日条件下の暗期にピークを示した。現在、SP5G、SP6Aの機能を明らかにするため、これらの遺伝子を構成的に発現したり、RNAiによってその発現を抑制したりした形質転換体を作製し、表現型の解析を進めている。また、別の中日性植物であるタバコのFTホモログの発現解析についても報告する。

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コムギにおけるAP1/FUL-like遺伝子VRN1は、花成における促進遺伝子として、葉で働く重要な遺伝子である。イオンビーム処理により、2倍体の一粒系コムギにおいて、VRN1遺伝子領域が欠失した変異体maintained vegetative phase (mvp) を得た。mvp変異体は、低温処理にも長日条件にも応答せず、栄養成長を続けて生殖成長へ移行しない。mvp変異体では、ゲノム中に完全なFT遺伝子が存在するにもかかわらず、FTの発現が見られない。このことから、VRN1遺伝子はFT遺伝子の上流に位置し、FT遺伝子発現に何らかの関与をしていると考えられる。一方、正常コムギ系統では、短日条件下でもVRN1の発現はみられるが、FT発現はみられない。また、遺伝子発現パターンの解析から、コムギでは2種類のCO-like遺伝子が機能分化して働いていると考えられる。長日条件におけるVRN1とCO-like遺伝子によるFT遺伝子発現誘導モデルを提唱する。

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真夜中の光中断が短日植物の開花を抑制することはよく知られている。モデル短日植物のイネの分子遺伝学的研究から、光中断による開花抑制は、フィトクロムを介したフロリゲン遺伝子Hd3aの抑制が原因であることが報告されたが、詳細な分子機構は明らかではない。
我々は、イネの光周性開花期制御機構を知るために、促進因子Ehd1と抑制因子Lhd4/Ghd7に注目して研究を行ってきた。Ehd1は、イネ特異的なHd3a誘導因子であり、短日条件の朝方の青色光に応答して転写が誘導される。一方、Lhd4/Ghd7はフィトクロム依存的に長日条件下で転写誘導されることから、長日条件の開花抑制因子である考えられた。
今回、我々は、朝のEhd1の転写が、赤色光の光中断により抑制されることを明らかにした。この時、Lhd4/Ghd7の転写は、Ehd1の転写を抑制したNBmaxのタイミングの光パルスにより、長日条件と同レベルの誘導を示すことから、短日条件では、Lhd4/Ghd7の光に対する応答性が真夜中にシフトすることで、光中断による開花抑制が起こると考えられた。一方で、赤色光と青色光の連続照射はEhd1の誘導を抑制できないことから、光中断の抑制は比較的長時間維持されるものの、その開始にはタイムラグがあることが示唆された。以上を踏まえて、光中断の分子機構と本来のイネの光周性花芽形成機構の関係について考察する。

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花成誘導日長条件下において葉の維管束篩部で発現誘導されるシロイヌナズナFT蛋白質は、「長距離花成シグナル」であることが報告された。しかし、・FTトランスジーンを本来の発現領域を越えて茎頂直下の篩部で発現させたため、篩管を介した葉から茎頂への長距離輸送を十分に示していないこと、・それ自体が長距離輸送されうるGFP蛋白質をタグとして使用したこと、・輸送の時間的な側面が未検討なこと、・FT mRNAの重要性を否定する根拠が乏しいことといった課題も残される。
我々は、異なるアプローチによりこれらの課題を解消した。確実に長距離輸送を検出するため、シロイヌナズナ胚軸接木法を用いて検討を行った。まずこの接木法において、台木・接穂間の篩部連続性の確立時期、篩部の機能的連絡を確認し、内生のFT遺伝子および構成的ないしは一過的に全身で過剰発現するFTトランスジーンによる花成促進効果は接木伝達性を示すことを確認した。我々は、T7タグを付加したFT蛋白質の接木面を越えた長距離輸送を検出し、さらに一過的発現系を利用して、この長距離輸送が少なくとも24-48時間に起こることを示した。一方で、FT遺伝子による長距離伝達性の花成促進効果における、FT mRNAの重要性を積極的に否定するため、同義置換したFT遺伝子を用意し、mRNAの一次配列、二次構造はともに重要でないことを示した。

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長日植物であるシロイヌナズナでは、長日条件下において葉の維管束篩部でFT遺伝子が発現し、茎頂に移動したFT蛋白質がbZIP型転写因子FDと相互作用してAP1などの下流遺伝子の転写を制御することによって花成を促進する。しかしながら、遺伝学的研究などの知見からFT蛋白質の花成促進機能はFD蛋白質に完全には依存しないと考えられる。そこでわれわれは新たにFT蛋白質と相互作用する因子の同定を目指し、TCP蛋白質に着目した。TCP蛋白質ファミリーはTCPドメインと呼ばれる保存されたbHLH領域を持つ転写因子ファミリーであり、シロイヌナズナには24個の遺伝子が存在している。本研究ではこの中から5つのTCP蛋白質を選び、酵母two-hybrid法とタバコ表皮細胞でのBiFC法を用いてFT蛋白質との結合能を検証した。その結果、複数のTCP蛋白質がFT蛋白質との結合能を示した。また、BiFC蛍光の観察結果より、TCP蛋白質によって蛍光の強度や細胞内局在に違いが見られた。この局在の違いについては、TCP-EGFP融合蛋白質の観察により、TCP蛋白質の細胞内局在の違いをほぼ反映していることがわかった。現在は、シロイヌナズナ体内、特にFT蛋白質の機能部位であると考えられる茎頂分裂組織でFT蛋白質と相互作用して機能するTCP蛋白質を同定するため、TCP遺伝子の発現パターンの解析を行っている。

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crp-1D (cryptic precocious-1D)変異体は、FT過剰発現体の花成早化表現型を昂進する優性変異体として単離された。CRP遺伝子は転写メディエーター複合体のサブユニットMed12に相当するタンパク質をコードする。われわれは、CRP遺伝子の発生過程における役割について調べるために機能欠損変異体crp-3, 4を取得し、crp-1D変異体とともにその表現型を解析している。crp変異体は多面的な形態異常を示し、転写メディエーターは植物においても発生の様々な過程において機能することが示唆された。
crp変異体の花成時期を測定したところ、crp-1D変異体は花成早化表現型を示したのに対し、crp-3, 4変異体は花成遅延表現型を示した。したがって、CRP遺伝子は花成を促進する因子であり、また、crp-1D変異は機能獲得型の変異であることが考えられる。
現在、花成制御におけるCRP遺伝子の役割を調べるために、crp変異体における既知の花成制御経路因子の発現パターンを調べている。これまでのところ、野生型とcrp変異体との間で花成抑制遺伝子FLCの発現量の違いが観察されており、これらの結果をふまえ、CRP遺伝子と花成関連遺伝子との関連について、現在解析を進めている。

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シロイヌナズナのLFYは、花芽分裂組織決定に重要な遺伝子であり、主としてMADS-box遺伝子の発現を正に制御する。FLO/LFYは植物に特有の転写因子であり、有胚植物のみで存在が報告されている。われわれは、FLO/LFYの祖先的な機能を解析することを目的として、有胚植物の中で最も基部で分岐したと考えられている苔類に属するゼニゴケのFLO/LFY相同遺伝子(MpLFY)を単離し、機能解析を行っている。まず、MpLFYの過剰発現株、RNAi株を作出し、表現型の解析を進めている。また、シロイヌナズナにおいて、一部のMADS-box遺伝子はLFYの転写標的として知られているため、ゼニゴケの2つのMADS-box遺伝子とMpLFYの発現をRT-PCRにより調べた。その結果、MpLFYと2つのゼニゴケMADS-box遺伝子はいずれも半数体世代の無性芽、葉状体、生殖器托の3つの器官において発現していることが確認された。胞子体における発現は解析中である。現在、in situハイブリダイゼーション法による詳細な発現パターンの解析などにより、この2つのゼニゴケMADS-box遺伝子とMpLFYの制御関係を調べている。更に、シロイヌナズナlfy変異体にMpLFYを導入し、lfy変異体の表現型が相補されるかを調べている。

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