DNA配列を決定する技術の進歩に伴い推定遺伝子配列情報が急速に増加している。一方で、遺伝子機能に関する情報は配列のみからはわからない場合もあり、未だに機能未知遺伝子が数多く残されている。そのような遺伝子の機能に関する情報は、表現型を対照と比較して違いが見られたときに得られる。従って、手がかりがない機能未知遺伝子の機能を推定するには様々な生命現象への影響を高感度に検出できる表現型に着目することが重要になる。
我々はこれまでに、500のシアノバクテリア変異株についてクロロフィル蛍光の誘導期曲線を定量的に解析し、変異による影響を広い範囲を対象として鋭敏に検出できることを示した。現在、これらの情報をデータベースで公開している。また、変異や薬剤の作用によって失われた機能を予測できる可能性を前回の年会で報告している。更に多くの変異株を測定することでより多くの変異株についての情報が得られ、また、遺伝子機能予測の精度の向上にもつながるだろう。
データベースの拡充に向け変異株のクロロフィル蛍光の測定しており、現在までにおよそ150の変異株を新たに測定した。この中には光合成、窒素代謝、炭素代謝に関連した機能機知遺伝子の変異株が多く含まれている。どのような遺伝子において、クロロフィル蛍光の誘導期曲線から遺伝子機能を推定でき、どのような遺伝子ではこのような解析が適さないのかについて報告する。

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シアノバクテリアの一種であるアナベナは、光独立栄養生育の他に、暗条件下でも有機物添加により従属栄養生育も可能である。一部のシアノバクテリアに関しては過去の電子顕微鏡等を用いた研究により、従属栄養生育の場合のチラコイド膜形態や色素タンパク質構成が独立栄養生育の場合と大きく異なることが知られてきた。顕微蛍光スペクトル分析ではチラコイド膜の微細形態の変化がどのように進行するのかを微小領域ごとの蛍光スペクトルで分析可能となるので、さらに詳細にチラコイド膜の性質・形態変化を理解することが可能になると期待される。我々の用いる2光子励起ライン走査型蛍光スペクトル顕微鏡では、ほぼ回折限界の分解能で、細胞各部の全ての蛍光スペクトルを2nmの波長分解能で得ることができる。この装置を用いてチラコイド膜の栄養環境依存性を調べた。先ず、繰り返し3次元走査に対して、アナベナの耐性を調べた。蛍光像と蛍光スペクトルの強度で見る限り、一つの糸状連結細胞について蛍光スペクトル像を数十の断面で計測することが十分可能であった。そして、従属栄養生育した細胞のチラコイド膜において現れる特異的微細構造部位について蛍光強度分布と蛍光スペクトルを精確に取得することができた。

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シアノバクテリアの多くは窒素固定能を持ち、その一部は植物等に共生して宿主に窒素源を供給している。特に、糸状性で窒素固定能・細胞分化能を持つNostoc属のシアノバクテリアは様々な植物・藻類・菌類と共生関係を結ぶことが知られ、多様な宿主との共生能の獲得は生理・生態・進化学的に興味深い。しかし、その機構や進化史はよくわかっていない。
発表者らは近年、共生の初期段階で重要なホルモゴニア（分化細胞の一つ。運動性を持ち、分散や植物との共生に重要。環境の変化により一時的に形成）に着目し、モデル生物N. punctiformeを用いた分子遺伝学的実験により形成制御遺伝子を同定し、その挿入変異体は植物共生能も欠くことを示した（第48回年会）。
本研究では、Nostoc-植物共生の進化を調べるため、自由生活性・共生性のNostocの分子系統解析を行った。その結果、共生能の獲得は多系統的であり、また、Nostocと宿主植物の系統は対応していない可能性が示された。一方、コケ植物を宿主とした共培養実験からは、ホルモゴニア形成能と共生能は必ずしも対応しないことが示唆された。
Nostoc-植物共生の多角的な検証は、その背景の解明や応用に重要な手がかりを与えるだろう。

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リン酸化はタンパク質の機能を調節する代表的な翻訳後修飾であり、植物を含めた多くの生物種で広範囲の生命現象の制御に関わっている。あらゆる生命現象をタンパク質レベルで理解するにあたり、個々のタンパク質のリン酸化制御の有無、更にリン酸化制御を受ける場合のリン酸化部位の情報は、非常に重要な直接的な手掛かりとなり得るが、植物細胞内で実際にリン酸化制御を受けているタンパク質およびタンパク質上のリン酸化部位の情報は非常に限られていた。
近年の目覚ましい質量分析関連技術の発達は、タンパク質上のリン酸化部位の同定を比較的容易にしたものの、細胞粗抽出液のように非常に複雑な試料に含まれるタンパク質集団のリン酸化状態を網羅的に解析するためには、未だ乗り越えるべき課題が数多くある。
今回の研究では、植物材料用にリン酸化ペプチドの精製・濃縮法の改良・最適化を行うことにより、はじめて植物の細胞粗抽出液に含まれるタンパク質集団のリン酸化状態を大規模に解析することに成功し^1）、これまでにシロイヌナズナで4,000程度、イネでは5,000以上のリン酸化部位を同定した。
本発表では、我々が取り組んでいるリン酸化プロテオミクスについて、これまでに得られた結果を交えて紹介する。
1）Mol Syst Biol. 2008;4:193. Epub 2008 May 6.

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植物細胞において液胞は細胞体積の約8割を占めるオルガネラであり、膨圧形成、無機イオンや代謝産物の蓄積、不要となったタンパク質の分解など細胞内恒常性の維持に重要な役割を果たしている。その機能から液胞内にはさまざまな物質が存在すると考えられる。我々は、植物細胞より液胞をインタクトな状態で単離し、CE-MSとFT-ICR-MSを用いて、液胞に含まれる物質について網羅的な解析と物質の同定を進めてきている。その結果、これまで液胞には存在しないと思われていた有機リン酸化合物の存在が示された。代謝物質の解析とともに、シロイヌナズナ培養細胞（Deep株）より単離した液胞を用い、液胞膜と液胞内のプロテオーム解析も同時に進め、液胞内で同定されたタンパク質と代謝産物との関係について考察した。また、液胞膜のプロテオーム解析より同定された機能未知膜タンパク質について、過剰発現させた細胞を作製し、形質転換細胞より単離した液胞内に存在する物質について、野生型の液胞と比較解析を行った結果についても報告する。

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液胞は植物の成長や浸透圧調節等に重要なだけでなく、有機酸・二次代謝物など植物代謝産物の貯蔵にとっても重要なオルガネラである。しかしながら実際に液胞に蓄積している代謝物の多様性や細胞質液胞間の代謝物輸送制御機構は明らかにされてはいない。本研究では液胞膜輸送タンパク質改変による細胞代謝機能制御研究のための基本情報として、シロイヌナズナ培養細胞DEEP株の単離液胞の代謝物組成解析を行った。代謝物組成の比較対象としてDEEP株全細胞の代謝物組成解析も並行して実施した。代謝物情報はLC-FTICR-MSを用いてESIポジティブ、ネガティブイオンモードで取得した。代謝物の構造推定を進めるために多数の成分に関してMS/MSスペクトルを取得するよう分析条件の改良を試みた。この結果、単離液胞・全細胞抽出物からポジティブモードで各々736成分、876成分（共通195成分）、ネガティブモードで713成分、989成分（共通117成分）が検出された。m/z値分布を見ると、低分子量側（m/z=500以下）では全細胞画分中に見られる成分数が多い傾向があった。また核酸代謝関連化合物・アミノ酸代謝関連化合物の液胞または全細胞画分への偏在が見出された。この基本情報を基に液胞膜タンパク質遺伝子形質転換体における代謝物プロフィールの解析を行なっている。本研究は一部科学技術振興機構・CRESTの支援をうけて実施された。

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植物細胞に含まれる多種多様な化合物の濃度は，細胞間において生物学的な差が存在する．また，細胞内の各オルガネラにおいても化合物は異なった局在性を示すと考えられている．しかし，各細胞や各オルガネラに含まれる化合物の量が極めて少ないため，これらを直接確認することは困難である．我々は巨大な単一細胞であるオオシャジクモ節間細胞を用いて，単一細胞・単一液胞におけるメタボローム解析を行った．メタボローム解析にはイオン性化合物の網羅的な解析に優れたCE-MS（キャピラリー電気泳動/質量分析装置）を用いた．その結果，55種の化合物が同定され，それらの一細胞毎の濃度が明らかになった．また，オオシャジクモ節間細胞からは液胞内液を容易に単離することができるため，各細胞における液胞と細胞質（液胞外空間）への化合物の局在性を調べることができた．その結果，化合物は主に液胞に存在するものと細胞質に存在するものに二分された．さらに，様々な光条件下における細胞中の化合物の局在および濃度を調べた結果，化合物種によって異なる挙動を示すことが分かった．今後，オオシャジクモ節間細胞における二次代謝産物の解析を，LC-MS（液体クロマトグラフィー/質量分析装置）を用いて行う予定である．

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【目的】植物はさまざまに分化した組織から構成されている。各部位の機能にあわせて、多様な二次代謝産物が作り分けられていることは古くから知られているが、その詳細は明らかではない。そこで、本研究ではメタボローム解析技術を用いて、シロイヌナズナ各部位の二次代謝物プロファイルを取得し、データベース化する事を目的とした。
【方法と結果】シロイヌナズナ(Col-0)を公共マイクロアレイデータ群(AtGenExpress Development)と同一の条件で生育し、32部位をLC-Q-TOF/MSを用いて代謝物プロファイルデータを取得した。得られたデータマトリクス中、約100成分にアノテーションを付与し、全2522ピークの蓄積プロファイルを可視化したデータベースを作成した。このうち保持時間2.06分m/z 138のピークはtyrosine が脱炭酸して生合成されるtyramineであると同定された。tyramineは蕾、茎頂、めしべで多く蓄積していたが、これと遺伝子発現プロファイルデータとの比較から、tyramineとよく似た発現パターンを示す芳香族アミノ酸脱炭酸酵素ホモログをtyramine生合成遺伝子候補として見いだした。本データセット(Development LC/MS)は理研PSCで進行しているAtMetExpressプロジェクトの一部である。

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脂質は比較的疎水性の高い物質の総称であり，構造的には多様な化合物群から構成される．我々はこのような植物に蓄積する脂質群のLCMSによる一斉分析を基盤とした脂質メタボロミクス（リピドミクス）解析系を構築した．これを用いて，シロイヌナズナの遺伝子破壊株の脂質プロファイルの解析を行った．新規の脂質代謝関連遺伝子を見出すため，既知の脂質代謝関連遺伝子との遺伝子共発現に基づいたネットワーク解析を行い，標的遺伝子の絞りこみを行った．その結果，ある新規遺伝子のT-DNA挿入変異体は特異的にsulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) を蓄積しないことを見出した．詳細な脂質組成の解析を行った結果，この変異体は野生株と比べてphosphatidylglycerolの蓄積量が増加すると共にmonogalactosyldiacylglycerolの蓄積がやや減少することも示された．大腸菌組み換えタンパク質を用いてタンパク機能の解析を行った結果，この遺伝子の組み換えタンパク質はUDP-glucoseの合成反応を触媒することがわかった．また，蛍光タンパク質を用いて細胞内移行性を調べた結果，このタンパク質は葉緑体に局在することが示された．これらのことから，この遺伝子はUDP-sulfoquinovoseの前駆体であるUDP-glucoseの葉緑体内での合成に関与することが示された．

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概日時計中心振動体の構成要素の相互作用に関する包括的な理解のために、我々はシロイヌナズナの野生型 (WT) および2種類の概日リズム消失植物体 [Arabidopsis Pseudo Response Regulator (PRR) genes PRR9, PRR7, PRR5 三重変異体 (d975) およびCIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) 過剰発現体 (CCA1-ox)] に対して、ガスクロマトグラフィー－時間飛行型/質量分析計 (GC-TOF/MS) を用いた比較メタボロミクス手法による特徴づけを行った。植物体は明暗条件および連続明条件下で生育し、経時的代謝物群測定をした。その結果、d975 およびCCA1-oxは形態学的な表現型に似ているにも関わらず、代謝物フェノタイピングにより両者を区別することができた。詳細な代謝プロファイリングは、d975がTCA回路中間体および適合溶質、抗酸化物質（ビタミン類）といった幅広い代謝産物の蓄積量の劇的な上昇により特徴づけられることを示した。さらに、マイクロアレイによる遺伝子発現データとの統合による考察から、遺伝子PRR9/7/5はカロテノイド-ABAおよび葉緑体生合成経路、ビタミンE合成経路の遺伝子群に対して負の制御を行っていると考えられた。

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水田で生育するイネは、アンモニアを主要な窒素源として利用する。グルタミン合成酵素（GS）は、アンモニアをグルタミンに変換する反応を触媒する。イネにおいてサイトゾル型GS（GS1）をコードする遺伝子は3種類存在するが、遺伝子破壊株解析により、OsGS1;1がイネの正常な生長および登熟に重要な機能を有することが判明した。しかしながら、本遺伝子欠損株が示す顕著な生育阻害と窒素同化および代謝制御機構に関わるOsGS1;1の機能は未だ明らかにされていない。そこで我々は本遺伝子欠損株を用いて代謝物および転写物プロファイリングを行い、本問題の解明を試みた。ガスクロマトグラフ―飛行時間型質量分析計による代謝物プロファイリングの結果から、アンモニア添加水耕液で栽培した欠損株は葉身内の可溶性糖類が異常蓄積するのに対し、アミノ酸類の蓄積量は著しく低下することが判明した。また、根においては葉身で観測されたプロファイルとは全く異なる代謝プロファイルを示した。代謝物相関解析により、欠損株が新たに獲得した代謝ネットワークを発見した。更に、転写物プロファイリングの結果を代謝変化、代謝物相関の変化と統合することにより、OsGS1;1が葉身内で糖類とアミノ酸の量的バランスを保つことで地上部の正常な生育を維持するのに重要であること、地下部においてもアンモニア同化に対して重要かつ特異的な機能を有することを明らかにした。

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トマトは、エチレンの生成と受容により成熟が進むクライマクテリック果実であり、成熟に伴い様々な代謝物変動が起こることが知られている。しかし、果実成熟中、エチレンがどの代謝物生成系に対してどのように作用するのかについては、カロテノイドなど限られた代謝物について分かっているだけである。本研究では、エチレン生成ならびに受容変異体トマト果実を用いて、野生株と代謝プロファイリングを比較することにより、エチレンの制御を受ける代謝成分を網羅的に調べることを目的とした。サンプルには、野生株（cv. Rutgers）とそのエチレン生成変異株（nor, rin）、エチレン受容変異株（Nr）を同条件下で生育し、野性株のMature green（MG）段階とRed ripe（RR）段階に該当する受粉後期日で各株から果実をサンプリングし、分析に用いることとした。糖・アミノ酸などの一次代謝物は、TMS誘導体化後GC-MSで分析を行い、約100の成分について標準品との比較により同定を行い、解析を行った。二次代謝物については、LC-MS分析により測定し、我々がすでに作成した約800のトマト代謝物アノテーション情報を利用して解析を進めた。その結果、一次代謝、二次代謝系いずれにおいても、成熟中、エチレンの関与によって変動する代謝物群、関与しない代謝物群に判別することができた。その詳細について、発表する予定である。

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zinc fingerドメインをコードするある遺伝子群は様々な種で特定の系統的クラスターを形成する。タバコにおいては、これらに関して、細胞骨格系に関与している、あるいは転写因子として細胞壁関連の代謝に関与しているなどの報告があるが、未解明な部分が多い。そこで、未だ報告のないシロイヌナズナにおいて、これらの遺伝子の一つに関して、代謝産物の側面から解析を行った。
RNAiラインをシロイヌナズナ培養細胞T87を材料としてデキサメタゾン（DEX）誘導型ベクターにより作製したところ、DEX誘導により生育が抑制されるという表現型を示した。DEX誘導後、経時的にサンプリングしてガスクロマトグラフィー質量分析器により代謝産物を分析し、代謝産物変動のネットワーク解析を行ったところmyo-inositol含量の顕著な減少が見られた。更に、フーリエ変換赤外分光光度計においても、特に糖成分の顕著なピークが現れる領域において経時的な変化が認められ、細胞壁成分が影響を受けている可能性が示唆された。また、T87における過剰発現体の解析では、myo-inositol含量の増加が認められ、myo-inositolを添加していない培地でも、添加した時と変わらない生育量を示した。これらの結果から、この遺伝子がmyo-inositolを含む糖代謝に関与している可能性が示唆された。

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我々はこれまでに FT-ICR/MS (フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置) を用いたメタボロミクスプラットフォームを整備してきた．FT-ICR/MS は超高分解能を有し，得られる精密質量値から元素組成式を推測することが可能である．これらの特性を活かしメタボロミクスプラットフォームをさらに発展させるため，元素組成式中の元素数比をプロットする van Krevelen diagram を用いた新規のメタボローム解析手法の確立を目指している．本発表では，化合物の元素組成変化に着目した新規解析手法がメタボロミクス研究において酵素反応による代謝物変動を解析する上で有効であり，遺伝子の機能解明にも応用可能であることを示す．
van Krevelen diagram を用いたメタボローム解析により機能未知アシルトランスフェラーゼおよびシトクロム P450 遺伝子の機能解明を試みた．これらの遺伝子のノックアウト植物を用いて FT-ICR/MS による代謝物分析を行い，得られた精密質量から元素組成式を推測した．メタボロミクスデータを van Krevelen diagram 上で解析し，これらの遺伝子が関与する代謝活性および代謝経路を予想した．さらに組み換えタンパク質を作製し，新規メタボロミクス解析手法から導かれた仮説を酵素反応解析により実証した．

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タデ科ギシギシ属エゾノギシギシRumex obtusifolius L.は世界各地の田畑や牧草地などに多く見られる多年生草本であり、駆除が困難な強害雑草として知られている。日本では、明治期に北海道にて移入が確認された後、数十年の間にほぼ全国に分布を拡大し、特に問題視されている。
タデ科ギシギシ属の植物は、シュウ酸含有量が高い。シュウ酸の過剰摂取は動物にとって有害である一方で、植物においてシュウ酸は重要な役割を果たしていると考えられる。というのは、シュウ酸は防御分子である過酸化水素合成の基質の1つであるため、傷害などのストレス応答との関与が推測されている。また、シュウ酸を根圏へ放出することで土壌中の金属イオンとキレートを形成し、金属イオンの毒性を打ち消すという報告がある。
本研究ではエゾノギシギシのシュウ酸代謝を明らかにするため、CE-MSを用いてギシギシ属植物の葉の代謝物量を測定し種間比較を行った。その結果、エゾノギシギシは他種よりもシュウ酸を高蓄積した。また、シュウ酸を高蓄積する植物ほどアミノ酸を多く含む傾向が見られた。さらに、地上部を切除し暗条件で育成したエゾノギシギシの葉および茎のメタボローム解析を行った。その結果、暗条件では茎の主要代謝物であるクエン酸が葉のシュウ酸の高蓄積に関与する可能性が示された。

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ムジナモは水生食虫植物で、二枚貝のような形の捕虫葉と呼ばれる葉を持ち、挟み込むように虫を捕まえる。（閉合運動）
虫が捕虫葉内の感覚毛に触れると活動電位が生じ、それが中央域の内側表皮細胞に存在する運動細胞の急激な膨圧減少を引き起こし、閉合運動につながるとされている。
本研究では、この閉合運動の機構をイオン輸送の観点から検討した。これまでに、1) EGTA処理した個体で閉合運動が阻害されるが、時間がかかる事、2) 複数の Ca²⁺チャネル阻害剤でも明確な阻害が見られない事、3) Ca²⁺依存性K⁺チャネルの阻害剤であるtetrandorineや、動物細胞において細胞内Ca²⁺濃度の上昇を引き起こすPAO、筋小胞体からのCa²⁺放出を阻害するTetracaine が閉合運動を阻害する事は報告済みである。これらの事から閉合運動にはCa²⁺が重要な役割を果たしており、その機構として小胞からのCa²⁺放出が重要である可能性が示唆された。
今回、新たに電気生理学的解析により、中央細胞の興奮性はTetrandrineやTetracaineでは影響を受けないが、PAOによって消失する事が明らかになり、刺激の伝搬におけるCa²⁺の重要性が示唆された。また現在、それら阻害剤が感覚毛の興奮性に及ぼす影響についても解析を行っており、刺激の受容におけるCa²⁺の役割も合わせて報告する。

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シロイヌナズナADO/FKF/LKP/ZTLファミリーに属するLKP2は、青色光受容部でありタンパク質間相互作用に関わるLOV domain、SCF複合体の構成因子としてユビキチン-プロテアソーム系を介したタンパク質分解に関与するF-box motif、タンパク質間相互作用に関わるkelch repeatの3つの領域から構成されている。これまでに、LKP2遺伝子を過剰発現させた植物では、明所下で胚軸が徒長すること、長日条件下で花芽形成の時期が遅れること、連続明・連続暗所下で概日リズムが失われることが示されている。私達は、LKP2が作用する因子を明らかにする目的で、マイクロアレイ解析を行ない、LKP2過剰発現植物で発現が変化する遺伝子の探索を行なってきた。解析の結果、LKP2過剰発現植物では野生型に比べ複数の植物ホルモン応答性遺伝子やストレス応答性遺伝子の発現量が2倍以上に上昇していた。LKP2過剰発現植物ではストレス耐性が変化している可能性が考えられ、ストレス応答性遺伝子の発現と、ストレス耐性の変化について解析を行なった。

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根は水分の多い方向に伸長する能力を有する。この現象は水分屈性と呼ばれ、植物の水獲得に寄与すると考えられる。その分子機構を解明するために、我々はシロイヌナズナの水分屈性欠損突然変異体miz を単離し、これまでにmiz1の変異原因遺伝子を同定した。miz1突然変異体の根は水分屈性の欠損だけでなく、光屈性の低下を示す。また、MIZ1 は機能未知のタンパク質をコードしており、その発現を制御する要因は不明である。そこで本研究では、MIZ1 の発現に対する水分勾配および光刺激の影響を明らかにするために、これらの刺激がMIZ1 の転写とタンパク質局在に及ぼす影響を解析した。明所芽生えの根において、MIZ1 の転写は根冠と維管束でみとめられた。一方、MIZ1タンパク質は、根冠、伸長領域の皮層および維管束にみられた。これらの発現パターンは、水分勾配刺激を与えても変化はしなかった。一方、黄化芽生えでは、根冠でのMIZ1 の発現がみられなかった。しかしながら、伸長領域の皮層でのMIZ1の局在に、黄化芽生えと明所芽生えで違いはなかった。MIZ1 の発現が根冠でのみ光によって制御されていたことから、根冠のMIZ1 は光依存的に発現制御されることが分かった。以上の結果は、これまで知られている重力屈性に加えて、光シグナルが水分屈性に干渉しており、その調節を根冠のMIZ1 が担うことが示唆された。

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植物の環境ストレス応答において、転写抑制因子群が重要な役割を担っていることが知られている。酵母の塩感受性株を相補する遺伝子として単離されたZAT10/STZは、C₂H₂型ジンクフィンガーファミリーに属しており、特定の遺伝子の発現を抑制していると考えられる。今回、我々は、ZAT10に近縁な2つの遺伝子（AZF1、AZF2）の機能解析を行った。DEX誘導性プロモーターによりAZF1またはAZF2を過剰発現した植物のマイクロアレイ解析を行ったところ、多くの共通した遺伝子の発現が抑制されていることが示された。これらの植物はDEX処理により矮化し、また、AZF1/AZF2プロモーター：cDNAを導入した植物は、根の成長抑制を示した。一方、azf1azf2二重変異体では、塩ストレス条件において根の伸長促進が見られた。AZF1/AZF2プロモーター：GUSやAZF1/AZF2プロモーター：cDNA-GFP融合遺伝子を導入した植物では、根や子葉においてGUS活性やGFPの蛍光が確認された。以上の結果より、AZF1とAZF2は機能的に相補しており、環境ストレス下における植物の成長制御に関与している可能性が示唆された。現在、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現系により、AZF1とAZF2の直接の標的遺伝子を同定するとともに、これらの転写因子が結合するシス配列の解析を進めている。

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イネには約100種類のNAC型転写因子が存在し、環境ストレス誘導性NACが多数含まれるサブファミリーも存在する。これまでに、このサブファミリーに含まれるOsNAC6が、乾燥や塩等の環境ストレス耐性や病害耐性に関わることを明らかにしてきた。OsNAC5はOsNAC6に最も近いイネNAC遺伝子で、それぞれイネ以外の単子葉作物にも相同遺伝子が存在している。マイクロアレイ解析等からOsNAC5は塩誘導性が特に強いことが示された。また、イネの培養細胞を用いたトランジェント発現実験から、OsNAC5にはC末端付近に転写を活性化する領域があることが明らかになった。さらに、OsNAC5-sGFP融合遺伝子をイネプロトプラストに導入する実験から、OsNAC5は核に局在することが示された。OsNAC5 を過剰発現したイネは塩土壌に対して強い耐性を示した。一方、マイクロアレイを用いた解析から、OsNAC5を過剰発現したイネにおいてLEA遺伝子を含む多数のストレス誘導性遺伝子の発現が増加していることが確認された。さらに、イネ培養細胞を用いた転写活性化実験において、LEA遺伝子のプロモーターはOsNAC5によって活性が増加することが示された。これらの結果から、OsNAC5はLEA遺伝子を含む多くのストレス誘導性遺伝子を制御する転写活性化因子であることが明らかになった。

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シロイヌナズナのDREB2タンパク質は、高温・乾燥・塩などのストレス応答に関与する転写因子であり、多くの環境ストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域に存在するDRE/CRT配列に特異的に結合することでそれらの遺伝子の転写を活性化する。イネにおいてDREB2タイプの遺伝子は5種類存在し、OsDREB2ファミリーを形成している。その中でOsDREB2Bは他の単子葉植物におけるDREB2ホモログと似た遺伝子配列を持っている。培養細胞を用いたトランジェント発現解析より、OsDREB2BはOsDREB2ファミリー内の他の遺伝子と比べて高い転写活性化能を示すことが明らかとなった。OsDREB2Bは2種類の転写産物を持ち、その配列から一方のみが機能タンパク質をコードすると考えられるが、その転写産物は低温・高温・乾燥・塩などの様々なストレス条件下で蓄積していた。また、OsDREB2Bタンパク質は細胞内で核に局在していた。さらにOsDREB2Bを過剰発現させたシロイヌナズナでは、乾燥や高温ストレス誘導性の遺伝子の発現が上昇していた。これらの結果からOsDREB2BはDREB2タイプの転写因子として働くと予想された。現在、OsDREB2B過剰発現イネを用いてイネにおけるOsDREB2Bの標的遺伝子の解析を行っており、それらについても合わせて報告する。

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DnaKはHSP70としても知られており、分子シャペロンの中でも重要な役割を果たす。私たちは、死海から単離した耐塩性ラン藻 Aphanothece halophytica のDnaK(ApDnaK)は淡水性ラン藻のDnaKよりも、塩ストレスなし、塩ストレス下のいずれにおいても高いフォールディング活性をもつことを報告した。またApDnaK遺伝子を導入したタバコは、野生型タバコよりも塩ストレス、および高温ストレスに耐性であることを明らかにした。今回、ApDnaK遺伝子を導入したイネを作出し、形質転換タバコおよびイネのストレス耐性および生産量について検討した。
耐塩性ラン藻の分子シャペロンApDnaKを過剰発現したタバコは塩・高温ストレスに耐性を示すだけでなく種子収量も増加した。同じ遺伝子を過剰発現したイネは高温・塩ストレスに耐性を示すだけでなく、通常の生育条件で野生型のイネよりも早い成長と収量の増加が見られた。これらの結果は、ApDnaKによるフォールディング活性の増加がストレス耐性、収量増加、バイオマス増加に寄与していることを示唆している。これらの結果について報告する。

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甜菜はアカザ科の植物で、根に高濃度のスクロースとベタインおよびラフィノースを蓄積する。スクロースおよびベタインは葉で合成されるが、それらの合成・輸送・蓄積の制御機構は明らかではない。そこで、今回、幼少期の甜菜における適合溶質の合成・輸送・蓄積機構について検討した。甜菜はストレスを加えない条件でもベタインを2～5 mmol/gFW蓄積する。1ヶ月間成育させた甜菜を、第1～4葉、茎、根に分け、各部位における適合溶質およびイオンについて調べた。ベタインはコリンの2段階の酸化反応により葉緑体で生合成されるが、その最初の反応を触媒するコリンモノオキシゲナーゼ（CMO）が律速酵素と言われている。CMO の発現量を抗体で調べたところ、ストレスを加えないときでもCMO蛋白質は葉で検出された。NaClによる塩ストレスを加えると、各部位でCMOとベタインは著しく増加した。甜菜からベタイン・プロリン輸送遺伝子をクローニングした。塩ストレスに伴うベタインの合成・輸送蛋白質をコードする遺伝子の発現について調べた結果を報告する。

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プロリン(Pro)は植物では塩・乾燥などのオスモティックストレス下において細胞内に大量に蓄積し、浸透圧調節を行う適合溶質として機能している。双子葉植物においてProは、グルタミン酸(Glu)とオルニチンから合成されるが、ストレス時にはGluからのPro合成が主経路となり、Δ¹-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) が律速酵素であると考えられている。本研究ではイネを用いて、P5CSに着目して研究を行った。まず、P5CS過剰発現株を作製したところ、得られた過剰発現株の細胞内のPro含量は野生株と比較して6倍以上を示した。次に野生株とP5CS過剰発現株から調製したプロトプラストを用いて塩処理(NaCl CaCl2)を行ったところ、400mM NaCl処理では6時間後においてプロトプラストの生存率に有意な差が認められた。200mM NaCl処理では17時間後において生存率の差が認められた。またCaCl2に関してもNaCl処理と同様に400mM と200mM CaCl2処理ではそれぞれ6時間後と17時間後に生存率の差が認められた。また、100mM NaClを含む固形培地で2ヶ月間カルスを生育させたところ、 P5CS過剰発現株と野生株の生長に有意な差が認められた。本研究により、P5CSの塩ストレス耐性への関与が示唆された。

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ニコチンアミド補酵素群（NAD(P)(H)）はエネルギー伝達など細胞機能に不可欠な因子であり極めて重要な役割を担っているが、その生合成制御についての知見は乏しい。シロイヌナズナにおいてNADはde novo経路とsalvage経路から合成される。NaMN合成後に2つの経路は合流し、共通経路においてNaADへ変換された後にNADが合成される。これまでに我々のグループでは、共通経路を触媒するNMNATおよびNADS遺伝子を同定し、さらに転写解析およびプロモーターGUS解析によってNADが生合成される組織・細胞を同定してきた。本講演では孔辺細胞におけるNAD生合成について報告する。シロイヌナズナ表皮ではアブシジン酸に応答して一過的にNADレベルが減少し、遅れてNMNAT活性が上昇することを見出した。このときNMNATの転写レベルは変化しなかった。また、NADSは転写・酵素活性共に変化しなかった。以上の結果から、NADレベルはNMNAT活性によって一定に保たれると推測された。孔辺細胞プロトプラストを用いた実験結果から、この応答は孔辺細胞特異的であることが明らかとなった。NMNAT変異体では気孔閉鎖が制限され乾燥耐性が低下するのに対して、NMNAT過剰発現体では気孔閉鎖が促進され乾燥耐性が付与されることを確認した。以上の結果から、NAD生合成と気孔運動との関連が示唆された。

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植物の代謝に関与する遺伝子の多くは、多重遺伝子族として存在している。例えば、シロイヌナズナには、272のcytochromeP450遺伝子、107の配糖化酵素遺伝子が存在すると報告されており、その構造のみから機能を推定することは困難である。
フラボノイド配糖化酵素遺伝子の網羅的機能同定を目的に、既知のフラボノイド代謝関連遺伝子をクエリーとして、遺伝子共発現解析を行ったところ、アントシアニン代謝系遺伝子と相関の高い配糖化酵素遺伝子（UGT3）を見出した。その一次構造から、UGT3は、フラボノイド配糖体の糖部分の水酸基を配糖化する酵素であることが示唆された。UGT3のエキソン部分にtransposonが挿入された変異体（ugt3変異体）は、野生型と比較して顕著な表現型は認められなかったが、高シュクロース存在下で育てた場合、ugt3変異体は、野生型とは異なるアントシアニン蓄積様式を示した。組換えタンパク質を用いたin vitroでの活性測定により、UGT3はcyanidin 3-O-glucosideに対してキシロース転移活性を示した。また、UGT3はUDP-xyloseに特異的に認識し、他のUDP-sugarは利用できなかった。すなわち、UGT3はアントシアニン・キシロース転移酵素をコードしていることが判明した。

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植物は浸透圧ストレスを受けると、ストレス耐性の獲得に関わる遺伝子群を働かせることで柔軟に適応している。これまでに、浸透圧ストレス下において代謝や膜輸送に関与する遺伝子の発現が変化し、糖やアミノ酸などが植物細胞中に蓄積することが示されている。本研究では、シロイヌナズナの単糖トランスポーターにおいて最も大きなファミリーを形成しているが、詳細な解析は未だ行われていないERD6-like familyについて解析を行った。乾燥ストレス初期で発現が誘導される遺伝子としてすでに単離されているERD6をERD6A、相同遺伝子をERD6Bと名付けた。ノーザン法により、乾燥、高塩、低温処理によりERD6AとERD6BのmRNAの蓄積が増加することが確認された。特にERD6Aはストレスの初期に、ERD6Bはストレスの後期に発現量の増加が見られた。次に、ERD6AおよびERD6BのプロモーターにGUS遺伝子を繋いで組織特異的発現、またcDNAにGFPを繋いで細胞内局在を調べたところ、ERD6Aは表皮、ERD6Bでは木部柔細胞において発現し、ともに液胞膜に局在することが確認された。これらの結果から、ERD6AおよびERD6Bはともに浸透圧ストレスで誘導され液胞膜に局在するが、発現する時間や組織に違いが見られ、植物におけるストレス下での役割が異なっていることが示唆された。

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マメ科のスペインカンゾウ (Glycyrrhiza glabra) はトリテルペノイド配糖体のグリチルリチンを生合成し、根やストロンに蓄積する。今までにその生合成経路に関しては多くの研究がなされてきたが、蓄積機構に関する知見は殆ど得られていない。そこで本研究では、グリチルリチン生産能を有しないスペインカンゾウ由来の培養細胞を用いて、グリチルリチン輸送の分子レベルでの解析を目的として、細胞レベルでの輸送活性及び、液胞輸送の生化学的解析を行った。細胞レベルでの解析の結果、グリチルリチンの輸送能がカンゾウに特異的なものであること、アグリコンであるグリチルレチン酸やアニオン輸送体阻害剤で輸送が阻害されること、膜のプロトン勾配が重要な役割を担っていることが示唆された。次にショ糖密度勾配遠心法で分離した膜ベシクルを用いてin vitroでのグリチルリチンの輸送について検討した。その結果、グリチルリチン輸送活性はATP依存性であった。液胞膜に富む画分についてより詳細な解析を行ったところ、pH変化により、輸送活性は変化しなかった。さらに阻害剤の効果について検討したところ、P型ATPase阻害剤であるバナジン酸とグリチルレチン酸により顕著な輸送活性の低下が見られた。現在、輸送体のエネルギー源や基質特異性などについて、更に詳細な解析を行っており、それらも合わせて報告したい。

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ホウ素は植物の生育に必須であるとともに、過剰に蓄積すると害をおよぼす元素である。低ホウ素条件時のシロイヌナズナの根においては、排出型ホウ酸トランスポーターBOR1がホウ素の導管へのローディングにおいて重要な役割を担う。私たちは、GFP融合タンパク質を用いた解析により、BOR1は低ホウ素条件時に根の様々な細胞において求基側（中心柱側）の細胞膜に極性をもって局在するが、比較的高濃度のホウ素供給によりエンドソームに移行し液胞において分解されることを明らかにしている。一方、BOR1のホモログの一つでありホウ素過剰時に根からのホウ素排出に働くことが示唆されているBOR4は、ホウ素濃度条件に関わらず根端の表皮細胞において遠心側（土壌側）の細胞膜に極性をもって局在する。そこでBOR1とBOR4の異なった細胞内輸送のメカニズムを明らかにするため、両タンパク質のキメラや点変異導入タンパク質を用いた解析を行った。その結果、BOR1の配列中の比較的大きな細胞質側ループ領域、さらにはその領域中の複数の輸送シグナルが求基側極性局在とエンドサイトーシス系分解に必要であることが明らかになった。各種小胞輸送阻害剤を用いた解析結果と合わせ、BOR1とBOR4の細胞内輸送の経路とメカニズムについて議論したい。

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高等植物にとって、ホウ素（B）は必須元素であると同時に、過剰量では害を及ぼす。シロイヌナズナホウ酸トランスポーターBOR1はホウ素欠乏条件では、根の様々な細胞で中心柱側の細胞膜に局在し、ホウ素の導管への濃縮に寄与する。一方、ホウ素十分条件下では、BOR1はエンドサイトーシスを介して液胞で分解されることを報告している(Takano et al., 2006)。このような、ホウ素濃度依存的なBOR1の分解制御機構により、植物体に必要な一定量のホウ素の取り込みが保持されていると考えられる。しかしながら現在まで、細胞内においてこの分解制御機構に関与する因子は報告されていない。
これまでの当研究室における解析から、BOR1一次構造上に分解制御に重要な輸送モチーフが見出されている。本研究では、輸送モチーフとの相互作用によってBOR1分解制御を担う候補因子として、細胞内小胞輸送機構に働くAP複合体に着目し、逆遺伝学的アプローチにより機能の解析を行った。AP複合体はシロイヌナズナを含む異なる生物種間で良く保存されている。AP-3複合体を形成するサブユニットの一つβ3アダプチンに対するシロイヌナズナ・オーソログ遺伝子のT-DNA挿入変異体では、明らかなBOR1の分解抑制がみられた。
以上の結果を含め、BOR1分解機構とその生理学的意義について論議したい。

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シロイヌナズナ花茎重力屈性変異体として単離されたzig-1変異体は重力屈性及び形態に異常を示す。我々は高等植物において重力感受等の高次機能に関わる小胞輸送の分子基盤を明らかにする事を目的として、zig-1の表現型を抑圧するzig suppressor(zip)の単離解析を行っている。zip4はzig-1の示す花茎の重力屈性及び、形態異常を部分的に抑圧する劣性変異体である。マッピングの結果、Adaptor protein complex-3 (AP-3)のμ3サブユニットホモログ遺伝子のスプライシングサイトに点突然変異が見つかった。4つのサブユニットからなるAP複合体は、輸送小胞のコートタンパクとして機能する事が酵母や動物細胞で知られており、中サブユニットであるμタンパク質は、N末にβ結合ドメイン、C末にカーゴ認識ドメインをもち、複合体の中でカーゴの選別に関わるとされている。相補性試験の結果、AP-3のμ3がzip4の原因遺伝子と同定された。また、T-DNA挿入変異体でもzip4と同様にzig-1表現型の抑圧効果が見られた。以上の結果から、AP-3のμ3の機能欠損変異がzig-1を抑圧したと考えられる。現在、AP-3の他の構成サブユニットやAP-1～4のμサブユニットについてzig-1との遺伝学的関係を解析中である。

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小胞輸送は，オーキシンの極性輸送，重力屈性，細胞分裂など植物の生命機能において重要な役割を果たしている．小胞輸送の制御に関わるRabファミリーは，真核生物に広く保存されている低分子量GTPaseで，輸送小胞の標的膜への繋留・融合を制御していることが知られている．なかでもRab5グループは，他の生物のRab5と高い類似性を示すRHA1，ARA7と植物に特異的なARA6の3つのメンバーから構成されている．これらのシロイヌナズナのRab5メンバーが，植物個体レベルで持つ生理的意義を明らかにするために，変異体の表現型解析を行った．rha1，ara7，ara6の単独の変異体は野生型と同様に生育したが，rha1ara7二重変異体は単離できなかった．このことから，RHA1とARA7は重複した機能を持つと考えられる．さらに，野生型とのクロスポリネーション解析により，このara7rha1変異体は雄性配偶体致死となることが明らかになった．そこで，これらの変異が花粉の形成や花粉管の発芽・伸長等のいずれの過程に損傷を引き起こすのかを調べるため，変異体より花粉を採取し，光学顕微鏡，電子顕微鏡での観察を行った．その結果，変異体の花粉内部に異常なカロースの沈積などの異常が生じている様子が観察された．また，この変異体の花粉管の発芽・伸長など機能面の解析結果についても報告する．

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シロイヌナズナのゲノム中にはRab GTPaseをコードする遺伝子が57個存在し，そのうち26遺伝子がRab11グループ(RabA1~RabA6)に分類される．一方で，酵母・動物ではRab11グループに属する遺伝子はごく少数であることから，植物においてRab11グループは独自の進化を辿り多様化したことが考えられる．我々は，植物におけるRab11グループの機能を解明すべく，RabA1サブグループに着目し，細胞内局在の解析を行った．GFP/Venus融合タンパク質を各遺伝子自身のプロモーターで発現させた植物体を作製して観察したところ，Venus-RabA1a，GFP-RabA1b，GFP-RabA1c，GFP-RabA1dは植物体全体で，GFP-RabA1eは根毛で，Venus-RabA1fは花粉管でそれぞれダイナミックに動くドット状のオルガネラに局在していた．GFP-RabA1eについて詳細に観察したところ，GFP-RabA1eは，Ara7，Ara6（エンドソームマーカー）やErd2（ゴルジ体マーカー）とは共局在せず， Syp42・Syp43（TGNマーカー）とは一部共局在していた．また，GFP-RabA1eは，伸長途中と考えられる根毛の先端にも局在が観察された．これらの結果から，RabA1eが，TGNから細胞膜への分泌経路において機能し，先端成長に関与していることが示唆された．

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RABはGTP結合型とGDP結合型をサイクルすることにより分子スイッチとして機能する．なかでもRAB5は，複数のエフェクター分子を介し，エンドソームの動態や膜組成の制御などさまざまなエンドソーム機能に関与することが動物で明らかになっている．陸上植物には植物特異的RAB5（シロイヌナズナではARA6）と真核生物に共通の保存型RAB5（シロイヌナズナではARA7とRHA1）の2種類が存在するが，動物のRAB5エフェクターのホモログは保存されておらず，植物が独自のエンドサイトーシス機構を進化させてきたことが窺える．一方，保存型RAB5の機能欠損は配偶体致死となることから，その機能の重要性は明らかである．我々は，保存型RAB5の機能発現機構を明らかにするため， ARA7のエフェクター候補を酵母ツーハイブリット法により探索した．その結果、リン脂質結合能を有する EREX1（Endosomal Rab Effector with pX-domain）を単離した．詳細なRABメンバーとの相互作用をさらに検討したところ，EREX1はARA7・RHA1とのみ相互作用を示したことから，これが保存型RAB5特異的なエフェクターであることが示唆された．シロイヌナズナにはEREX1のホモログとしてEREX2, EREX3が存在する．今回は，このEREXグループの解析結果について報告する．

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RAB5は真核生物に広く保存された低分子量GTPaseであり，エンドサイトーシス経路において多様な役割を担うことが知られている．陸上植物には，保存型RAB5に加え，植物固有型RAB5であるARA6グループも保存されており，我々はシロイヌナズナにおいて保存型RAB5とARA6の二種類のRAB5が協調し，花成や細胞分化，根の形態形成などの現象を制御することを明らかとしてきた．このようなRAB5の機能は様々なエフェクターとの相互作用を介した下流現象の制御により発現されていると考えられている．しかし，これまで報告されている動物のRAB5エフェクターのホモログは植物には見いだされないことから，植物は独自のRAB5エフェクターを用いてこれらの現象を制御していると考えられる．そこで，植物固有型RAB5であるARA6に注目し，エフェクターのスクリーニングを行った．これまでに，活性型ARA6と特異的に相互作用を示す7つのエフェクターを単離し，plant-unique RAB5 effector (PUF)と名付けた．現在注目しているPUF3は，ARA6エンドソーム上で共局在し，活性化状態依存的にARA6エンドソームに局在する因子である．また，PUF3は脂質親和性ドメインであるPHドメインを持ち，PI4Pに特異的に結合する．本大会では，PUF3-ARA6の相互作用の生体内での役割について報告したい．

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Rab5はエンドソームに局在し，エンドソームの融合のみならず多様な現象を制御する分子スイッチとして機能することが知られている．Rab5をGDP型からGTP型へと活性化するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）には，Vps9ドメインと呼ばれる活性部位が広く保存されている．シロイヌナズナにおいても，Vps9ドメインを持つVPS9aが，全てのRab5 GTPase（ARA6，ARA7，RHA1）を活性化する。VPS9aはVPS9ドメイン以外には既知のドメイン構造が予測されていない．このドメイン構造の予測されないC末端側の領域を欠失した変異型VPS9aでは，動物のRab5のオルソログと考えられるARA7やRHA1に対しては野生型と同等の活性を示すのに対し，植物特異的なARA6に対しては活性の上昇が確認された．このことからVPS9aのC末端側の領域は，植物特異的なARA6に特化した制御に関与することが示唆された．現在，VPS9aのC末端側の領域が担う機能について，さらに詳細な解析を行っている．

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植物は病原菌の感染を認識し、ファイトアレキシンの生産を含む様々な抵抗性反応を誘導する。我々は、イネにおけるジテルペン型ファイトアレキシンの一種であるモミラクトン類の生合成に関与する5つの遺伝子（OsCPS4、OsKSL4、CYP99A2、CYP99A3、OsMAS）が第4染色体上でクラスターを形成していること、キチンエリシター処理によりこれら5つの遺伝子が同調的に発現誘導されることを見出した。このような同調的発現の機構を明らかにするため、まず、上記5遺伝子のうちOsKSL4遺伝子について詳細な発現制御機構の解析を行い、そのエリシター誘導的発現にbZIP型転写因子のOsTGAPが直接関与することを明らかにした。また、OsTGAPのTos17挿入変異株であるostgap変異株においてOsKSL4だけでなくその他の4種の遺伝子の発現が野生株と比較して顕著に低下していること、OsTGAP過剰発現株においては逆にエリシター処理により5種のモミラクトン生合成酵素遺伝子の発現が野生株と比較して顕著に増加することが明らかになった。これらの結果はOsTGAPがOsKSL4のみならず他の4種の遺伝子の発現も制御することを強く示唆するものである。

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白葉枯病は東南アジアおよび日本の西南暖地でのイネの主要病害であり、多くの研究が国際的に行われている。我々は白葉枯病に対する圃場抵抗性を持つ「日本晴」ゲノム内のレトロトランスポゾン Tos17 を増殖させた突然変異集団（ミュータントパネル）から白葉枯病の圃場抵抗性が失われた系統を選抜した。突然変異系統の中のXC20系統は、第9染色体に挿入されていた Tos17 が白葉枯病の圃場抵抗性欠失に関わっていた。挿入された Tos17 の付近には約430bpのタンパク質翻訳領域( xc20 )が存在し、突然変異系統では xc20 mRNAの発現が抑制されていた。XC20タンパク質のアミノ酸配列は、トウモロコシZmSAUR2、コショウupa5と相同性があった。ZmSAUR2はオーキシンで誘導されるカルモジュリン結合タンパク質、upa5は斑点細菌病 Xanthomonas type III effector proteinによって誘導されるタンパク質であった。さらにゲノムライブラリーから単離した xc20 をXC20突然変異系統に再導入した組換え個体は白葉枯病圃場抵抗性の回復が観察された。従って xc20 は白葉枯病の圃場抵抗性に関与する遺伝子であり、その機能が失われることによって抵抗性が失われることが示唆された。

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Pti1aは、イネにおいて真性抵抗性、基礎的抵抗性の発現を負に制御する因子である。Pti1aのキナーゼ活性の耐病性シグナルの制御について検証するため、Pti1aの活性化部位に変異を入れた、Pti1a^T233Aをpti1a変異体に導入し、相補検定を行った。Pti1a^T233A形質転換体はpti1a変異体で認められる擬似病斑形成、防御遺伝子PR1bの発現が抑制され、さらに親和性いもち病菌に対する罹病性が回復した。以上の結果は、pti1a変異体の擬似病斑形成の抑制に、Pti1aの活性化ではなく、Pti1aの存在が必要であることを示している。親和性白葉枯病菌を用いて基礎的抵抗性について解析した結果、Pti1a^T233A相補個体は親和性白葉枯病菌に対する抵抗性が有為に減少した。これらの結果は、Pti1aのThr-233のリン酸化が、基礎的抵抗性を活性化させる重要な機構であることを示している。次に、Pti1aの制御機構の解明を目的に、相互作用因子Pik1の機能解析を行った。Pik1_pro:GUS形質転換イネを用いていもち病菌接種時の応答を解析した結果、病斑およびHR部位周辺で特異的に発現が誘導され、さらに同部位にH₂O₂蓄積が認められた。また、Pik1はH₂O₂処理後10分で一過的にリン酸化されることから、Pik1は病原菌の初期認識にも関与する可能性が示唆された。

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MAPKカスケードは病原体が持つエリシターの認識から、防御応答反応の発動に至るシグナル伝達において、中心的な役割を担うと考えられている。イネでもエリシターによるMAPK活性化が見られていたが、その下流の反応は知られていなかった。我々はエリシターにより活性化されるMAPKK、OsMKK4を見出し、OsMKK4を介したMAPKカスケードが制御する防御応答反応について解析を行っている。
これまでの解析から、活性型OsMKK4タンパク質（OsMKK4DD）によりOsMPK3、OsMPK6が活性化され、防御応答関連の遺伝子群が発現上昇し、活性酸素生成を伴わずに細胞死が誘導されることを見出している。本年度は、OsMKK4DDにより発現制御される遺伝子の解析からフェニルプロパノイド類の合成が推測され、リグニンの蓄積を確認した。また、エリシター処理時やOsMKK4DD 誘導時のosmpk6変異体と野生型との表現型の比較から、OsMPK6が細胞死やファイトアレキシン蓄積に関与することを見出している。OsMKK4DDにより発現が制御される転写因子群について、時系列的な発現変化を追うとともに、osmpk6変異体における発現を野生型と比較し、細胞死、ファイトアレキシン蓄積を調節する転写因子の推定を試みている。

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Pb1は、直接に収量減につながり、また食味や品質低下の原因となるイネの重要病害のひとつとであるイネ穂いもちに対する抵抗性遺伝子として初めて同定された。インディカ品種「Modan」に由来するPb1品種「St. No.1」と日本品種との約11,500 F₂からの組換え系統解析に基づく遺伝地図により、穂いもちPb1領域を25.9kbの5遺伝子に絞り込み、さらに、発現解析及び相補性検定によりPb1遺伝子（P15）を確定した。Pb1遺伝子は、塩基数3,897 、アミノ酸数1,296でイントロンはなく、これまでに単離された真性抵抗性遺伝子と類似したCC-NBS-LRR構造を持つ。イネの生育ステージ別のPb1の発現パターンは、Pb1の特長である成体抵抗性との相関を示した。すなわち、Pb1による抵抗性はイネの生育ステージとともに上昇し、止葉期や出穂期に最高に達するが、Pb1遺伝子の発現もこれと同様のパターンで上昇した。単離されたPb1とその約60kb上流に存在する1アミノ酸異なるPb1'は、タンデムに配列した重複遺伝子であり、それぞれを単独で保有する系統での遺伝子発現解析から、Pb1はPb1'の約150～300倍の発現量を示した。このことからPb1は遺伝子重複により機能が創生された抵抗性遺伝子であると推定された。本課題は農林水産省グリーンテクノ計画(QT-4002)の支援を受けた。

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インド型イネ「Modan」に由来する穂いもち病圃場抵抗性遺伝子Pb1(Panicle Blast1)は、安定で高度な発病抑制効果を示し、収量に影響する「穂いもち」に対して特に高い効果を示す。最近Pb1遺伝子が単離され、Rタンパク質様のCoiled Coil Nucleotide Binding Leucine-Rich Repeat (CC-NB-LRR)タンパク質をコードしていた。Pb1と同様のCC-NB-LRR構造をもつオオムギのうどんこ病抵抗性Rタンパク質MLAは、感染認識後に細胞質から核に移行し、CC領域を介してWRKY転写因子と相互作用することが報告され、タンパク質間相互作用により病害応答シグナル伝達が行われることが示唆された。そこで、イネの数種のWRKY転写因子とPb1との相互作用をYeast two-hybrid法を用いて調べた結果、Pb1はWRKY45と特異的に相互作用し、GST pull-down法でも相互作用が確認された。WRKY45はサリチル酸シグナル伝達経路に属し、植物活性化剤による誘導抵抗性において中心的な役割を果たす転写因子である。MLAが相互作用するWRKY転写因子は転写抑制因子であるのに対し、Pb1と相互作用するWRKY45は転写活性型因子であることから、WRKY45を介したPb1による抵抗性の分子機構は、MLAの場合とは異なることが予想される。

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ホスホリパーゼD(PLD)は植物の防御応答やストレス応答などに重要な機能を有していることが知られている。稲の防御応答におけるPLDの生理機能を解析するために、PLD遺伝子のRNA干渉による遺伝子発現抑制系統を確立し、いもち病菌の感染に対する抵抗性の変化を解析した。その結果、OsPLDβ1とOsPLDδ2の2つの抑制系統のいもち病菌感染に対する抵抗性が、大幅に増加することがわかった。OsPLDβ1抑制系統は病原菌感染の無い状態で過敏感反応を誘導する表現型を示すのに対して、OsPLDδ2抑制系統はWild typeと同様であった。抑制系統における発現遺伝子をDNA-microarrayでWild typeと比較解析した結果、PBZ1などの防御関連遺伝子はOsPLDβ1抑制系統では高発現していたが、OsPLDδ2抑制系統では高発現していなかった。一方、WRKYなどの防御関連転写因子遺伝子はOsPLDβ1とOsPLDδ22つの抑制系統で高発現していた。これらの結果より、OsPLDβ1とOsPLDδ2は部分的に異なったシグナル伝達経路に関与し、稲の防御反応の誘導を負に制御していることが示唆された。

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植物は病原細菌のフラジェリンを認識することにより免疫反応を誘導する。これまで、シロイヌナズナではフラジェリンのN末端部分のflg22に対する受容体としてFLS2が同定されている。しかし、単子葉植物のイネではフラジェリンの受容機構についてはほとんど明らかになっていない。イネにおけるフラジェリンの受容機構を明らかにするためにフラジェリンの様々なドメインを作製し免疫反応誘導活性を調べたところ、イネはフラジェリンのC末端領域を主に認識し、flg22はほとんど認識しないことが明らかになった。そこでまず、flg22に対する受容体の同定を試みたところ、FLS2のイネオルソログであるOsFLS2を同定した。OsFLS2をイネで過剰発現させるとflg22に対する認識能が増加し、シロイヌナズナのΔFLS2変異体に発現させるとflg22に対する認識能が回復した。次にフラジェリンのC末端領域の認識に関与する受容体同定のため、フラジェリン処理後に発現誘導される遺伝子を探索した。これらの遺伝子の中で、受容体となり得る候補遺伝子をΔFLS2シロイヌナズナに過剰発現させたところ、STR1、STR2と名付けた遺伝子がフラジェリン認識能の欠損を相補することが明らかになった。そこで、両遺伝子の欠損イネにおけるフラジェリン認識能について調べたところ、両欠損株ともフラジェリン認識能が著しく低下していることが明らかとなった。

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Plants have evolved PAMP- and effector-triggered innate immunity to fight against pathogen attacks. Rac GTPase, RACK1, RAR1, SGT1 and Hsp90 are characterized as important components for plant defense signaling. However the relationship and molecular functions of these components are largely unknown. Here, we characterized a novel OsRac1 interacting protein, Sti1, which is a well-known component of steroid receptor complex in animal, as a key regulator for disease resistance. We found that suppression of Sti1 dampened resistance, while overexpression of Sti1 enhanced resistance in rice. Interestingly, Stil interacted with Hsp90 and plant PAMP receptor homologs (RLKs). Our results extend the existing tripartite interaction of RAR1, SGT1 and Hsp90 to a protein complex network, termed as "defensome", including Sti1, Rac1, and RLKs. Thus, we hypothesize Stil may function as an adaptor linking PAMP receptors and molecular switch (Rac1) together and contribute to PAMP-triggered innate immunity in rice.

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イネにおいて、低分子量Gタンパク質であるOsRac1は植物免疫反応を制御していることが明らかにされている。これまでにOsRac1の相互作用因子をアフィニティークロマトグラフィー等により単離し、それらにより構成されるOsRac1複合体をDefensomeと命名し研究を行っている。しかし、これらが複合体として存在しているかどうかはいまだ不明である。そこで、本研究は、イネ生体内でOsRac1が複合体として存在しているのかどうかを調べ、その複合体が植物免疫反応に関わっているかを解明することを目的とした。
Mycタグ付加活性型と不活性型 OsRac1形質転換イネ培養細胞から総タンパク質をゲルろ過によって分画したところ、不活性型に比べて活性型でOsRac1が高分子量に存在することが確認された。また、野生型OsRac1にエリシター処理を行ったところ処理後3-8分では高分子量で多く検出され、60分処理し続けると処理以前の状態に近くなることを確認した。これまで明らかにしているDefensomeの構成因子をそれぞれに対する抗体を用いてウエスタン解析を行ったところ、OsRac1の活性に関わらず、常に大きな複合体を形成していた。
以上のことから、OsRac1は活性型になることによりDefensome複合体に合流し、植物免疫シグナルを下流に伝達していくという可能性を示唆している。

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植物の抵抗性遺伝子産物（以下、Rタンパク質）は、病原体を認識する細胞内レセプターとして働くことが知られている。多くのRタンパク質は、ヌクレオチド結合部位(NBS)とロイシンリッチリピート(LRR)をもつNBS-LRR型Rタンパク質に属している。現在、Rタンパク質がどのような複合体を形成し、下流のシグナル伝達系を制御しているかはほとんど明らかになっていない。我々はこれまでに植物免疫の分子スイッチである低分子量GTP結合タンパク質OsRac1がイネのRタンパク質を介した抵抗性反応において重要な役割を果たしていることを明らかにしている。OsRac1の相互作用分子の探索を行ったところ、いもち病菌の抵抗性タンパク質であるPit, Pib, Pi9及び白葉枯れ病菌の抵抗性タンパク質であるXa1を同定した。Pitによって誘導されるいもち病菌に対する抵抗性が、ドミナントネガティブ型OsRac1により抑制された。OsRac1の活性化をイネ培養細胞でモニタリングした結果、Pit活性化型変異体は、OsRac1を活性化することが明らかになった。以上の結果から、NBS-LRR型抵抗性タンパク質は、OsRac1に直接結合してOsRac1を活性化することにより病害抵抗性を誘導することが示唆された。

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被子植物の胚嚢は一般的に厚い胚珠組織に覆われており、直接観察することは困難である。このため、被子植物の受精を支える分子機構は長らく明らかにされなかった。しかし、胚嚢が胚珠組織から裸出しているゴマノハグサ科のトレニアを利用することで、花粉管は助細胞が分泌する花粉管誘引物質によって胚嚢に誘引されることが明らかとなった。その解析の過程で、花粉管に助細胞からの誘引物質への応答能コンピテンシーを与える因子が胚珠組織に存在することが明らかとなり、この因子を“AMOR（activation molecule for response capability ）”と名付けた。AMORは、熱安定性であり、アラビノガラクタンタンパク質（AGP）画分に回収される。しかし、その分子的実体は明らかになっていない。
我々は、花粉管がどのようにして誘引物質への応答能を獲得するかを明らかにするため、AMORの分子的実体とその生成を担う遺伝子を同定することを目指している。これまでに、AMORを多量かつ簡便に回収するための試料の回収法を検討すると共に、AMORの精製法を検討してきた。また、異種植物の栄養器官から精製したAGPsにも、弱いながらもAMOR同様の活性があることを明らかにした。現在、AMORがAGPである可能性や糖鎖の関与について検討しており、最新の結果について紹介したい。

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ACC合成酵素(ACS)はエチレン生合成経路における律速段階を触媒する。ACSは multigene family を構成し，C末端側のアミノ酸配列により1, 2, 3型に分類され，転写調節と翻訳後調節によって制御されている。ACSの翻訳後調節，特にACSタンパク質の安定性にかかわる因子は依然として不明である。そこで安定性にかかわる因子の特定とその働きについて研究を行った。我々はyeast two-hybrid screen法により，シロイヌナズナの2型のACSの一つであるACS5と相互作用するタンパク質としてDnaJタンパク質の1つATJ3を同定した。免疫沈降法により植物体内でもATJ3はACS5と特異的に結合することが確認された。DnaJ family内でATJ3はATJ2ときわめて類似しているので，atj2/atj3変異体を作出して解析を行った。ATJ2/ATJ3を共に抑制すると，黄化芽ばえで見られるようなサイトカイニンや光によるACS5タンパク質の安定性が著しく低下し，エチレン生成量も低下した。atj2/atj3変異体は開花や種子の稔性などの植物の生長にも変化が見られた。以上の結果から，DnaJはACSタンパク質の代謝回転を通して植物の生長に影響を及ぼしていることが明らかとなった。さらに，これらの結果は植物におけるタンパク質代謝回転の制御機構に新たな知見を与えている。

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エチレン生合成の律速段階を担うACC合成酵素 (ACS)は、転写段階だけでなく、翻訳後の制御も受けている。我々はこれまでに、トマト傷害誘導性ACC合成酵素LeACS2が翻訳後直ちにリン酸化されること、細胞内ではほぼ全ての分子がリン酸化型として働くこと、脱リン酸化型の半減期がリン酸化型よりも短いことを明らかにした。これらのことは、ACSの代謝回転速度が脱リン酸化段階で決定されていることを示唆している。この制御機構を明らかにするために、我々はACSの脱リン酸化を担うプロテインホスファターゼの同定を試みてきたが、今回は、エチレン生成量が増加するシロイヌナズナ変異体のうち、プロテインホスファターゼ2Aの調節サブユニットに変異を持つrcn1に着目した。野生型およびrcn1の黄化芽生えをオーキシン処理すると、ACSアイソザイムのうちAtACS4のmRNAが誘導され、ACC含量およびエチレン生成量の増加が確認された。しかし、誘導されたAtACS4のmRNA量が同程度であるにもかかわらず、ACC含量およびエチレン生成量は、rcn1の方が野生型よりも高かった。このことは、両者のエチレン生成量の差異が、AtACS4の代謝回転速度の差異に起因することを示唆している。これらのことを基に、エチレン生合成調節におけるRCN1の役割について考察する。

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