【目的】DNAの後天的修飾にはDNA塩基のメチル化とヒストンにおける化学修飾の2種類が存在し，様々な遺伝子の発現制御に関与している。演者らは，ニワトリ性腺において生殖細胞の分化に伴い生殖細胞特異的タンパク質（Ddx4，Dnd1，Dazl）の発現が変化することを報告した（2010）。このことは生殖細胞の分化に伴い，遺伝子の発現が変化している可能性を示唆している。そこで本研究では，生殖細胞特異的遺伝子，未分化細胞および肝細胞のマーカー遺伝子の転写開始点上流域に存在するCpGサイトのメチル化状態を解析することにより，ニワトリにおける遺伝子の発現調節とメチル化との関連性を調べることを目的とした。【方法】成熟ニワトリから射出精液および肝臓を採取した。精子をパーコール密度勾配法により精製し，肝臓とともにゲノムDNAの抽出を行った。各サンプルのゲノムDNAについてバイサルファイト処理を行い，目的の領域をPCRにより増幅した。増幅したDNA断片のサブクローニングを行うことで各サンプルあたり12クローンを準備し，シークエンス解析を行った。【結果】分化した体細胞組織である肝臓では，Ddx4，Dnd1，Dazlの転写開始点上流域（+1～-500bp）において多数のCpGサイトのメチル化が認められた。これに対し，精子では生殖細胞特異的遺伝子の転写開始点上流域におけるメチル化CpGサイトの割合は低いことが確認された。このことから，ニワトリにおいて遺伝子転写開始点上流域におけるメチル化の状態が遺伝子の発現状態を反映しており，また精子においては生殖細胞特異的遺伝子がタンパク質への翻訳を受けない状態で存在している可能性が示唆された。また，精子における遺伝子転写開始点上流域の低メチル化状態が分化の途中で発現様式が変化するとされる生殖細胞特異的遺伝子に限定されているかということについて，生殖細胞において分化の有無に関わらず基本的に発現してない遺伝子のメチル化状態を比較することにより詳細な解析が行えるものと考えられる。

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［緒言］哺乳動物の生殖細胞の発生過程において，ヒストンおよびDNAのエピジェネティックな修飾が著しく変動することが知られており，それらの修飾を調整する遺伝子を欠損させたマウスの多くが不妊の表現型を示すことから，生殖細胞の正常な発生においてエピジェネティックな修飾が極めて重要な役割を果たしていることが示唆される。我々は第105回日本繁殖生物学会大会においてヒストンH3K36me2の選択的脱メチル化酵素Fbxl10の欠損により加齢に伴い重篤な精子形成不全が誘発されることを報告している。本研究ではFbxl10のホモログであるFbxl11/Kdm2aの生殖細胞特異的欠損マウスを作成し精子形成における同遺伝子の果たす役割について解析した。［結果および考察］生殖細胞特異的にKdm2aを欠損したオスマウスは，100%不妊となった。そこで，出生後から性成熟に至る期間の精巣を免疫組織学的に解析したところ，生後8週までにほぼすべての精細管から減数分裂期以降の精母細胞ならびに半数体の精娘細胞が失われるという精子形成不全の表現型を確認した。興味深いことに，PLZF陽性精原細胞およびGFRA1陽性精原幹細胞は精母細胞や精娘細胞を全く含まない異常な精細管においてむしろ対照区と比較して増加しており，高い体細胞分裂活性（Ki67陽性）を示していた。一方，FACSを用いた解析からPLZF陽性精原細胞はKdm2a欠損マウスの精巣において増加するもののc-Kit陽性の分化型精原細胞の割合には変化が見られなかった。さらに，Kdm2a欠損マウスの精巣よりThy1陽性の未分化精原細胞を分取して体外培養に供したところ，体外においても自己複製能を示した。以上の結果より，Kdm2aが精原（幹）細胞の増殖を調整するとともに，自己複製から分化へと性質を転換する上で極めて重要な役割を果たしていることが示唆された。

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【目的】減数分裂の初期に相同染色体同士が対合するが，その際，シナプトネマ複合体（SC）が本質的な役割を演じる。近年，SC構成タンパク質遺伝子7種類が明らかにされたが，減数分裂開始期におけるこれらの遺伝子の発現動態は詳しくは調べられていない。一方，若齢マウス精巣の組織学的観察から，生後8～11日齢にてSC形成が開始するのではないかと考えられた。そこで本研究では，若齢マウス精巣組織および成マウス主要組織におけるSC構成タンパク質遺伝子発現の時期特異性および組織特異性を明らかにすることを目的とした。【方法】C57BL/6N系マウスの2，5，8，11，15日齢幼若雄個体および60日齢成雄個体から精巣を，60日齢の成雄および成雌マウスから主要器官を，それぞれ採材し，液体窒素中にて急速凍結保存した。それぞれの組織から全RNAを抽出し，オリゴdTプラーマーを用いた逆転写反応によって生成したcDNAを鋳型としてリアルタイムPCR法を行い，した。また，精巣組織をホモジナイズして組織抽出物を調製し，SDS-尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離した後，抗マウスSYCP1抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。【結果】まず，Sycp1，Sycp2，Sycp3，Syce1，Syce2，Syce3，Tex12およびActbの各々を特異的に増幅するリアルタイムPCR用プライマーを設計した。精巣および各種器官における発現をActbを内部標準として相対定量した結果，これら7種類の遺伝子の発現はともに，精巣では2日齢では検出限界値付近を示し，5～15日齢では日齢とともに増加した。また，いずれも精巣組織特異性が高い事が確認された。ウェスタンブロット解析では，SYCP1は11日齢以降にて検出され，60日齢では更に強いシグナルが検出された。これらの結果から，マウ精巣において生後8日齢から11日齢の時期にSC形成が開始することが示唆される。

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【目的】リラキシン関連因子（RLF）はinsulin-like peptide 3 (INSL3)とも呼ばれ，ブタ精巣で発見されたrelaxin/insulin gene familyの一つで，受容体LGR8を介して作用するが，成体での役割はよくわかっていない。これまでに我々はブタ精巣よりnative RLFの単離と構造決定に加え，RLFは性成熟に伴い発現・分泌が増加し，血中のほか精細管内に輸送され，生殖細胞で発現する受容体に結合し，生殖細胞のパラクリン因子として機能することを明らかにしてきた。しかし，生殖細胞でどのような機能を発揮するのか不明であった。本研究では，RLFの能動免疫処理を施して内因性RLFの中和化を図り，ブタ造精機能に及ぼす影響を調べた。【方法】供試動物にはDuroc種の雄豚6頭を用いた。免疫区(3頭)にはN末端に卵白アルブミン（OVA)を結合させたヤギRLF-B鎖ペプチドを，一方，対象区(3頭)にはOVAを投与した。初回免疫は生後7週齢に開始し，24週齢まで追加免疫を行った。抗体価はRLFの結合率として表した。また，精液採取は24～28週齢に行い，精液性状を調べた。さらに，28週齢で精巣を摘出してTUNEL法によるアポトーシス検出とCASP3およびXIAPの遺伝子発現をｑPCRで調べた。【結果】抗体価は生後18週齢で最大値を示し，その後は恒常値を保っていた。次に，精液性状を調べた結果，免疫区では正常精子率が低く，死滅精子率と未成熟精子率が高かった。一方，精液量と精子活力には差を認めなかったが，精子濃度は免疫区で有意に低下していた。免疫区の精巣では，精細管にダメージが見られ，TUNEL法により生殖細胞のアポトーシスの頻度が約4倍上昇していることがわかった。さらに，Casp3の遺伝子発現が有意に増加し，XIAPは減少していた。【結論】RLFの中和化は生殖細胞のアポトーシスを増加させ，精子濃度の減少をもたらすことがわかり，RLFは精子形成の維持に関与していることが示唆された。

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【目的】ウシでは人工授精による受胎率の低下が顕著であり，精子の品質低下がその原因の一つである可能性がある。受胎性に関連する精子側の要因として精子の運動性があるが，この分子機構は十分に解明されていない。精子の運動性維持には鞭毛全体に亘るATPの供給が必須であるが，ミトコンドリアは鞭毛中片部にしか存在しないため，鞭毛先端に亘るATP供給機構は不明である。そこで，ATP合成酵素であるアデニル酸キナーゼ（AK）の検討を行った。【方法】ウシ精子のAK活性は，AKの特異的阻害剤Ap5Aを用いて測定した。AKが精子運動能に及ぼす影響は，除膜再活性化の実験系でAp5Aを用いて確認した。牛精子におけるAKの局在は，抗AK1抗体を用いた免疫ブロット法および免疫染色法によって検査した。AK1発現蛋白質は，大腸菌を用いて作製した。【結果】ウシ精子のAK活性の測定法を確立し，AK活性はAp5A濃度依存的に阻害されたことを確認した。ウシ精子をTritonX-100を含む液で処理すると，AK活性の約1／3が沈殿に確認され，約2／3が上清に確認された。除膜再活性化の実験系では，ADPを用いた鞭毛運動の再活性化はAp5A濃度依存的に阻害されたが，ATPを用いた鞭毛運動の再活性化はAp5Aによって阻害されなかったため，AKがウシ精子でADPからATPへの変換反応に介在し，鞭毛運動に重要であることが推察された。AKファミリーのAK1特異的抗体を用いてウシ精子における局在を調べたところ，ウシAK1はウシ精子のTritonX-100可溶性画分に多く存在した。また，免疫染色の結果から，鞭毛全体に亘ってウシAK1が存在することが確認された。また，発現ウシAK1にはAK活性が確認されたため，少なくともウシAK1は，鞭毛部位全体に亘ってATP供給機構に関与し，鞭毛運動に影響を与える分子であることが示唆された。これらのことから，アデニル酸キナーゼ活性を含めたATP合成系の検査は，ウシ精子の品質を評価するうえで有効な手段になることが推察された。

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【目的】先体反応は，精子が卵子と融合するために必須の形態的，生理的変化であり，受精における重要な反応である。先体反応は主に透明帯との結合により誘起されると考えられているが，プロジェステロン（P）やその他の化学物質によっても誘起される。本研究では，ウシ精子の先体反応における卵丘細胞の関与の解明を目的に，卵丘卵母細胞(COCs)，卵丘細胞（C），卵母細胞（O）とのインキュベーションによりウシ精子の先体反応を調べた。【材料および方法】ウシ精子は黒毛和種雄ウシの凍結精液を融解，洗浄後，20×10⁶ sperm/mlに調整し供試した。培地は0.3%BSA添加BO液（BO）を基本培地とし，以下の実験を行った。実験1：精子は，BO，Heparin - caffeineを添加したBO（H），PレセプターのアンタゴニストであるRU-486を添加したH（RU）の各培地で処理後，それぞれの浮遊液にCOCsを加え，38.5℃，5%CO₂でインキュベートした（BO-COC区，H-COC区，RU-COC区）。対照区の精子はBO，Hで4時間，またはHで3.5時間インキュベーション後，P（2 µg/ml）を添加し0.5時間インキュベートした（BO区，Hep区，P区）。実験2：精子は，BO，Hで処理し，それぞれの浮遊液にCOCsからピペッティングにより分離したCまたはOを加え，インキュベートした（BO-C区，BO-O区，H-C区，H-O区）。生存精子の受精能獲得と先体反応は，4時間のインキュベーション後，ヘキスト33258- クロルテトラサイクリン（HO-CTC）染色により検査した。【結果】実験1：H-COC区の先体反応誘起率はBO-COC区，RU-COC区より有意に高く，P区と同程度であった。実験2：H-C区は，BO-C区，BO-O区より有意に高い先体反応誘起率を示した。H-C区は，H-O区との比較では，有意な差はなかったが，高くなる傾向がみられた。以上のことから，ウシ精子における先体反応は卵丘細胞により誘起され，それは卵丘細胞から分泌されるプロジェステロンが関与している可能性が示唆された。

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Sperm are compromised structurally and functionally due to cold stresses. The objective of current study is to investigate the effect of cold shock at pre-freeze (no cooling time) and post-thaw (thawing at 4°C) on structure and function of buck sperm. Semen was collected from three Beetal bucks (replicates=5) by artificial vagina, pooled and diluted with Tris-citrate egg yolk glycerol extender. It was divided into two aliquots (A, B) comprising of four sub-aliquots i.e. A1-A4 and B1-B4 respectively. A1-A4 were placed at 4C at 0, 2, 4 and 8hr respectively without cooling (pre-freeze cold shock). Aliquots of B were placed at 4C at 0, 2, 4 and 8hr of equilibration after cooling (control). Each sample was cryopreserved conventionally. A1-A4 samples were thawed at both 4°C and 37°C. Each sample was evaluated pre-freeze and post-thaw for motility, membrane integrity, live ratio and acrosomal integrity. Data were analyzed using PROC GLM procedure of SAS. Pre-freeze motility was less (P<0.05) about 23, 35, 43 and 50‰ and membrane integrity was also 20, 32, 24, 34‰ less (P<0.05) at 0, 2, 4 and 8hr of equilibration respectively in A group than B. Post-thaw (4°C) revealed higher motility in A2 group while plasma and acrosomal integrity were higher (P<0.05) in A4 group (equilibration 8hr) than A1-A3. Post thaw (37°C) motility and acrosomal integrity was 44, 53 and 36‰ higher in control group than cold shocked group at 2, 4 and 8 hr of equilibration. It is concluded that buck sperm becomes highly compromised with increase in pre-freeze and post-thaw duration of cold shock. Pre-freeze cold shock makes the buck sperm less resistive to cryo-induced stress which is manifested after thawing.

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栄養状態は脳内のセンサーを介して性腺機能を制御していると考えられる。我々は後脳の脳室を裏打ちする上衣細胞がエネルギーレベルを感知するセンサー細胞であるという仮説のもとに研究を行い，これまでに延髄弧束核（NTS）から視床下部室傍核（PVN）に投射するノルアドレナリンニューロンが低エネルギーによるパルス状LH分泌の抑制を仲介することを示した。本研究では，後脳上衣細胞からNTSのノルアドレナリンニューロン，さらにPVNにいたる神経経路の存在を明らかにすることを目的とした。成熟雄ラットにおいて，トランスシナプティックな神経トレーサーである小麦胚芽レクチン（WGA）を第4脳室（4V），またはPVNに投与し，48時間後に灌流固定し，凍結切片を作製した。得られた脳切片を抗WGA抗体で染色するとともに，上衣細胞のマーカーであるvimentinあるいはノルアドレナリンの合成酵素であるdopamine-β-hydroxylase (DBH)抗体を用い，二重免疫組織化学を行った。WGAを4Vに投与した個体では，4Vおよび中心管の上衣細胞においてWGA免疫陽性細胞が認められ，上衣細胞に取り込まれていることが示された。このような個体ではさらにNTSのDBH陽性ニューロン，PVNの大細胞領域および小細胞領域においてもWGA免疫陽性が観察された。一方，WGAをPVNに投与した個体では，NTSのDBH陽性ニューロン，および中心管の上衣細胞特異的にWGA陽性が認められた。以上の結果から，後脳の中心管の上衣細胞からNTSのノルアドレナリンニューロンへは神経連絡があり，さらに同ニューロンを介し，PVNへ低栄養のシグナルを伝達していることが示唆された。

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Kiss1遺伝子にコードされるキスペプチンは，性腺刺激ホルモン放出ホルモン分泌を介して生殖機能を制御することで注目を集めている。Kiss1 ノックアウト（KO）ラットは，雌雄両性で性腺刺激ホルモン分泌が欠如し，生殖機能を持たない。これに加え，KOラットのオスは，オス型性行動を示さず顕著なメス型性行動を示す。本研究では，KOオスラットにおけるオス型性行動の欠如が，生成熟後のキスペプチンの欠如によるかどうかを検証するため，精巣除去テストステロン負荷KOラットのオスにおいて，キスペプチンの側脳室投与を行った。その結果，マウント，挿入，射精といった一連のオス型性行動は復活しなかった。このことはキスペプチンが発達期においてオス化および脱メス化に必要である事を示している。キスペプチンの発達期における役割を明らかにするため，種々検討を行った。Kiss1 KOラットのオスが発達期にテストステロンを分泌しているかを明らかにするため，胎生18日および出生後2時間の個体から採血したが，KOラットのオスは野生型のオスと同様の血漿中テストステロン濃度を示した。また，Kiss1 KOラットの出生日にエストラジオールベンゾエート（EB, 150 µg）を皮下注射したところ，メス型性行動は両性ともに示さず，野生型と同様に新生児期のエストロジェンにより，性行動の脱メス化が起こることがわかった。以上の結果から，キスペプチンは性行動のオス化および脱メス化に不可欠であり，胎児あるいは新生児の精巣からテストステロンが分泌されて以降，エストロジェンに変換されて効果を現すまでのいずれかの過程において機能を有することが示唆された。

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【目的】Kiss1遺伝子にコードされるキスペプチンは哺乳類の繁殖機能を第一義的に制御する神経ペプチドとして注目されている。一方，コンベンショナルKiss1ノックアウト (KO) マウスの一部では，野生型と同じサイズの卵巣を有したり，排卵を伴わないものの性周期が回帰する例が確認されており発達期におけるキスペプチン欠損に対する何らかの補償作用が生じ，性腺機能が維持される可能性が示唆されている。そこで本研究ではタモキシフェン（TAM）誘導性にCre-loxPシステムが機能する遺伝子改変マウスを用いて，inducibleにKiss1遺伝子のKOするモデル系を確立し，生殖機能におよぼすキスペプチンの役割について検討した。【方法】Kiss1遺伝子がloxP配列で挟まれており，かつ全身でCreリコンビナーゼと変異型マウスエストロジェン受容体の複合体 (CreER) を発現するCreER/Kiss1^flox/flox マウスを作出した。生後23日で腹腔内にTAMを投与し，生後40日から60日において膣垢観察による性周期の検定を行った。その後卵巣除去を行い，2週間後に脳を採取し，免疫染色による弓状核キスペプチン免疫陽性細胞数を検討した。【結果】CreER/Kiss1^flox/flox マウスにおいて，TAMを1回投与した個体では弓状核におけるキスペプチン免疫陽性細胞数は最大でコントロールの20%程度まで減少し，2回投与した個体では全く確認できない個体もあった。生後40日から60日における性周期の回帰数が，コントロール群で3，4回確認されたのに対し，TAM 1回投与，2回投与において0~2回しか確認できなかった。また，TAM投与群における発情休止期の割合は，コントロール群に比べ増加した。以上の結果から，性成熟後の弓状核のキスペプチン発現が卵胞の成熟に関わっており，性周期の回帰にとって重要であることが示唆された。

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下垂体は，前葉，中葉，後葉から構成されている。下垂体前葉は，生殖など多くの生命維持に必須なホルモンを産生し，分泌されたホルモンは血管を介して標的器官へと運ばれる。下垂体前葉には，ホルモン産生細胞以外に，S100タンパク質を発現する濾胞星状細胞 （FS細胞）を含む一群の非ホルモン産生細胞が存在している。我々は，FS細胞の一部で下垂体特異的転写因子PROP1と幹/前駆細胞マーカーSOX2が共存関係から，FS細胞は不均一な細胞集団であり，その起源も多様である可能性を示唆した。そこで，本研究では，S100陽性細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラットを用いて，胎仔期下垂体とGFP陽性細胞の関係を免疫組織化学により解析した。 E15.5の下垂体内にGFP陽性細胞は確認されないが，周囲の間葉系のPRRX1陽性細胞と共にGFP陽性細胞が，下垂体に侵入する像が確認された。E18.5になると，侵入したGFP陽性細胞（SOX2陰性）の一部はPRRX1陽性であった。さらに，血管系，間葉系，神経堤細胞のマーカーとの共染色を行うと，血管内皮細胞マーカーISOLECTIN B4，血管内皮細胞前駆細胞マーカーNESTIN，ペリサイトマーカーDESMIN，間葉系細胞マーカーVIMENTIN，神経堤細胞マーカーP75などの陽性細胞の一部にGFPが観察された。以上のことから，胎仔期にPRRX1陽性の間葉系細胞以外にも非下垂体由来のGFP陽性細胞が下垂体前葉に侵入し，やがて，下垂体の血管形成に関わる各種の細胞へと分化していることが示唆された。一方，下垂体中葉では，E19.5においてGFP陽性細胞が初めて観察され，それら多くにSOX2の共存が確認された。 これまで生後に出現するとされてきた下垂体のFS細胞は，既に非下垂体起源のFS細胞として胎仔期に侵入し，それらの一部は血管網の形成に関与していることが，本研究により示された。

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【背景と目的】下垂体は，生体の変化に応じて多種のホルモンを合成・分泌して多くの生体機能を調節しているが，組織の発生・分化と維持に関わる機序については，依然として未知の部分が多い。近年，下垂体の幹・未分化細胞は前葉と中葉が接している細胞層であるMarginal Cell Layer（MCL）に局在していることが明らかになり，この場所が幹細胞ニッチであることが示唆された。今回，我々はこのニッチに着目し，コクサッキウイルスとアデノウイルス受容体CAR（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor）を指標とした解析を行った。【方法と結果】ラット下垂体の胎仔期11.5日齢（E11.5）から成体60日齢（P60）までについて，幹・未分化細胞マーカーSOX2，E-cadherin，分裂マーカーKi67，上皮-間葉転移（EMT）マーカーVimentin，各ホルモン，CARの抗体を用いて，免疫組織化学を行った。その結果，CARは，ラット胎仔期E11.5–12.5の口腔上皮の陥入する将来のMCLにのみ存在していた。その局在様式は，E13.5の原基ラトケ嚢から成体P60まで維持され，幹・未分化細胞マーカーSOX2とE-cadherinとがほぼ共存し，ホルモン産生細胞には存在せず，CAR陽性細胞の一部は分裂能を持つことが確認された。胎仔後期からは，実質層にもCAR陽性細胞が観察された。CARは幹・未分化細胞に存在することから，実質層における幹細胞ニッチの存在が示唆された。また，Vimentinの染色像から，生後直後の時期にMCL 付近におけるCAR陽性細胞がEMTにより実質層へと移動してCAR陽性細胞のクラスターが増加することを確認した。【考察】以上のことから，CAR陽性細胞は幹・未分化細胞であり，MCLに局在して幹細胞ニッチの形成に関与すること，生後直後では，MCL 付近のCAR陽性細胞の移動により実質層の幹細胞ニッチを形成し，その後の細胞供給に関与すると考えられる。

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下垂体は生体機能の維持に必要なホルモンを産生する内分泌組織であり，その発生・分化や機能維持は，多数の転写因子の時空間的な発現が担っている。我々は，胎仔期から成熟後までの下垂体前葉の幹・前駆細胞に注目して解析を進めている。幹細胞マーカーであるSOX2や下垂体特異的転写因子PROP1が発現する幹・前駆細胞の解析過程で，それらの細胞の一部に転写因子PRRX1あるいはPRRX2が共存する事を見出し，両因子の組織内局在や機能について研究を展開している。解析方法としては，自作のPRRX1とPRRX2の特異抗体を用いた免疫組織化学と，両遺伝子の転写開始点のプロモーター活性の分析を行った。その結果，PRRX1は胎仔期に外部から下垂体前葉侵入する間葉系細胞と，下垂体内の幹・前駆細胞に存在した。ホルモン産生細胞の分化に関わるPROP1とPIT1との共存率を調べてみると，PROP1陽性細胞にはE16.5 では約10％，E20.5では約90％と急激にPRRX1の共存が増加したが，PIT1との共存は稀であった。一方，PRRX2は胎仔期に組織外から侵入する間葉系細胞の一部に，一過性に観察されるのみで，生後ではmarginal cell layer（幹細胞ニッチとされている）に存在するPROP1陰性/SOX2陽性細胞に陽性シグナルが観察された。PRRX2は出生後に中，後葉のSOX2陽性細胞にも観察されており，PRRX2は分化度の低い細胞での役割が示唆され，同族の2因子は発現細胞や分化への寄与が異なると考えられた。同時に，Prrx1とPrrx2が発現する下垂体由来の株化細胞TtT/GFを用いて，分化に関わる各種の転写因子によるプロモーター制御を調べてみると，両者を制御する因子と共に，Prrx2のみを制御する因子としてKLF6を見出した。以上のことから，PRRX1とPRRX2は，分化度の異なる下垂体幹・前駆細胞で機能しており，両者の発現制御の様式は異なると考えられる。

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【目的】ケモカインは，Gタンパク質受容体を介して作用する分泌性低分子（7-16kDa）サイトカインである。これまでに，神経組織，免疫組織，内分泌組織などでの発現が報告され，細胞の移動，遊走，分化，増殖などに関与することが明らかとなっている。我々は，下垂体前葉ではCXCケモカイン（CXCL）12とそのレセプターであるCXCR4が，非ホルモン産生細胞である濾胞星状細胞（FS細胞）で発現し，FS細胞の移動，接着を誘導することを報告している（Horiguchi et al. 2012）。しかし，それ以外のケモカインの発現に関しては不明である。そこで本研究では，下垂体前葉におけるCXCLおよびそのレセプター（CXCR）の発現を網羅的に解析し，発現細胞の同定を明らかにすることを目的とした。【方法】オス成体ラット下垂体前葉から得られたRNAを用い，CXCLおよびCXCR遺伝子発現をRT-PCRにて解析し，さらに発現細胞をin situ hybridizationおよび免疫組織化学により同定した。【結果】新たにCXCL10の発現が下垂体前葉で観察され，その発現細胞はFS細胞であった。CXCL10レセプターであるCXCR3は，ACTH産生細胞で発現していた。これは，FS細胞から分泌されるCXCL10がパラクライン的にACTH産生細胞へ作用することを示唆している。さらに，FS細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラットを用いて，CXCL10を発現するFS細胞をin vitroにおいて観察したところ，CXCL10を発現するFS細胞と発現しないFS細胞とが存在し，両者には形態的な差異が観察できた。長らくFS細胞は下垂体前葉に存在するS100βタンパク質を発現する細胞と認識されてきたが，本結果は，S100βタンパク質発現細胞は，均一な細胞群ではなく，不均一な集団である事を示している。今後，CXCL10のACTH産生細胞への機能やCXCL10を発現するFS細胞のさらなる特徴を明らかにして行きたいと考えている。

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【背景・目的】Neuronatin (NNAT)は新生仔の脳で発見されたタンパク質である。その後，膵臓や下垂体でも発見されている。下垂体において，組織特異的転写因子PROP1がホルモン産生細胞の分化を支配しており，PROP1機能低下を示すAmesマウスにおいてNnatの発現がPROP1の制御下にあることが報告されている。NNATの機能については，膵臓のβ細胞におけるホルモン分泌や，神経系細胞の分化などへの関与もあるが，下垂体における機能はその局在も含めてほとんど進展していない。本研究では，下垂体のNNATの機能を解明するため，まずこの組織での発現変動，分布，細胞内局在を解析した。 【方法】ラット胎仔期から成熟期の下垂体のRNAと組織を用いて，リアルタイムPCR解析と，NNAT抗体を用いた免疫組織化学を行った。 【結果・考察】ラット胎仔期（E13.5）から成熟期下垂体におけるNNATの発現をリアルタイムPCRで解析した。NNATは既にE13.5で発現しており，E20.5まで増加して高レベルを維持したが，出生後P15にかけて急激に低下し，その後は低レベルであった。免疫組織化学では，E11.5の下垂体原基の一部にNNAT陽性反応が確認され，E13.5にはロストラルチップを除く全ての細胞が陽性であった。それらは幹細胞マーカーSOX2とPROP1が発現している細胞である。共存している細胞の数は，発生の進行に伴い減少し，一方でホルモンと共存する細胞が観察された。しかし，中・後葉のNNAT陽性細胞の数は発生に伴い顕著に減少し，前葉は出生後，ごく僅かとなった。また，小胞体にNNATが存在するとの報告の確認のため，小胞体マーカーPDIの抗体との2重染色を行ったところ，一部のシグナルは重なるものの，NNATが他の細胞内小器官にも存在することが観察された。以上の結果から，NNATは下垂体幹・前駆細胞で発現を開始し，小胞体を含む複数の細胞内小器官で機能していることが判った。

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The nuclear receptor Rev-erbα has been identified as a link between circadian rhythms and metabolic processes. In addition, heme has been proved as a ligand of Rev-erbα. However, little is known about the function of Rev-erbα in ovarian circadian oscillators. In the present study, we characterized the function of Rev-erbα in mature granulosa cells (GCs) using its ligands. Immature Per2-dLuc transgenic rats were injected with eCG to prepare GCs. Per2-dLuc oscillations were measured by real-time monitoring system. Gene expression levels were examined by RT-qPCR. Heme (10 μM) significantly decreased the amplitude of Per2 oscillations in GCs with LH syncronzation compared with the Cont group. In addition, heme treatment signigicantly reduced the mRNA levels of core clock genes across 24 h. GSK4112 (GSK; agonist) and SR8278 (SR; antagonist) were used to further dissect the function of Rev-erbα. Both of them (10 μM, 2 h shock) elicited the precense of Per2 oscillations, although the period and amplitude did not shown a significant defference. Interestingly, GSK significantly induced a phase advance shift compared with SR treatment. Moreover, either GSK or SR were found to significant lengthen and shorten, respectively, the period of Per2 oscillations of GCs after LH synchronization compared with DMSO treament. LH plus DMSO treatment (Cont) entrained all examined genes (Bmal1, Per2, Rev-erbα, Dbp, and Cox2) with robust rhythmic expression, whereas both GSK and SR were found to impair the rhythmic expression of examined genes. These finding indicate that Rev-erbα plays an important role in ovarin circadian oscillators.

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【目的】哺乳類の視床下部には性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）ニューロンやキスペプチンニューロンなど繁殖制御に重要な神経細胞が多く局在する。これらのニューロンの詳細な機能を解明するためには細胞レベルでの解析が必要であるが，家畜の視床下部由来の細胞株は存在しない。そこで本研究では，シバヤギ胎仔の視床下部初代培養細胞を不死化して，神経由来細胞株を樹立することを試みた。【方法】細胞の不死化はSV40 large T抗原遺伝子（T-Ag）の導入により行った。胎齢120日雌シバヤギ胎仔の視床下部弓状核を切り出して初代培養を行い，翌日T-Agを組み込んだレンチウイルスベクターを添加した。ウイルス感染72時間後から2週間，G418を培地に添加して，遺伝子導入された細胞を選抜した。得られた細胞集団のクローニングを行い，各細胞クローンからRNA抽出とcDNA合成を行った。各細胞クローンにおける神経細胞マーカー（Neuron Specific Enolase, NSE）およびグリア細胞マーカー（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）の発現をRT-PCRにより解析し，NSE陽性かつGFAP陰性のものを神経由来細胞株とした。内部標準としてGAPDH，不死化の指標としてT-Agの発現解析も行った。【結果および考察】シバヤギ胎仔視床下部初代培養細胞へのウイルス感染により，十分な増殖能を有する細胞集団を得ることに成功した。この細胞集団から得た57個の細胞クローンはすべてT-Agを発現しており，T-Agの導入が不死化を誘導したことが示唆された。マーカー遺伝子の発現解析により，57個の細胞クローンのうち36個が神経細胞由来であることを特定した。今後，本研究で得た神経由来細胞株における繁殖関連神経ペプチド等の発現解析を実施することで，反芻家畜の繁殖制御メカニズムをin vitroで解析可能な細胞株が得られると期待される。

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【背景】過排卵誘起では非下垂体由来のeCGやhCGが頻用される。これらは下垂体の卵胞刺激ホルモン(FSH)，黄体形成ホルモン(LH)様の活性を持つが，効果の差異，投与個体での抗体惹起，感染因子のリスクなどの問題が存在する。一方，下垂体由来のFSHやLHも相互の夾雑の問題がある。本研究では，純度が保証される組換え体マウスFSH(rec-mFSH)の作製を行い，過排卵誘起活性を調べた。【方法】マウスFSHのαとβサブユニットcDNAを単一のベクターに組み込んだ遺伝子をCHO細胞に導入して，安定的にrec-mFSHを発現する細胞株を樹立し，培養上清として回収して，時間分解蛍光法による濃度測定，顆粒膜細胞を用いたアロマターゼ活性測定による力価の算出を行うとともに，過排卵誘起を検討した。【結果】rec-mFSHは培地1mlあたり1933ngで生産されており，力価は11.19 IU/µgであった。過排卵誘起では，7.5 IUで単発投与した群では過排卵は起こらなかったが，同量を12時間おきに5回投与した群と，賦形剤(polyvinylpyrrolidone(PVP))と共に1回および2回投与した群では過排卵が確認できた。特に，5回の頻回投与とPVP添加の2回投与では頻用されているeCGとほぼ同等の排卵数が得られることが確認された。【考察】頻回投与やPVP添加の投与により満足できる排卵数が得られたことは，持続的な卵胞発育がrec-mFSHによって引き起こされたことを示しており，また，PVP添加は体内での短い半減期を改善する効果をもたらしたと考えられる。賦形剤の使用によりrec-mFSHの必要量を減じることが帰来される。本研究により，過排卵誘起の活性を有するrec-mFSHの生産系が確立され，さらに，賦形剤の有用性が示唆された。今後，現在進めている組換え体マウスLHをrec-mFSHと組み合わせて，マウスのゴナドトロピンを用いたマウスの性腺機能調節機構の研究を展開する予定である。

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【目的】哺乳動物の卵管は配偶子および初期胚の輸送経路であり，輸送には卵管平滑筋の収縮弛緩運動が関与する。Endothelin (ET) は血管平滑筋収縮因子として知られており，ウシ卵管においても ET-1の産生ならびに平滑筋収縮作用が確認されている。本研究では，哺乳動物の卵管平滑筋収縮弛緩運動の制御機構を明らかにする目的で，ウシ卵管におけるETs の発現と発現調節因子について検討した。【方法】1) 排卵周期を通したウシ卵管組織膨大部および峡部におけるET-1，ET-2，ET-3およびET 変換酵素 (ECE) 1，2のmRNA発現量を解析した。2) ウシ卵管膨大部組織におけるETs およびECEsの局在を免疫組織化学的に解析した。3) ウシ卵管培養上皮細胞に黄体形成ホルモン(LH)，Estradiol-17β (E2)，Progesterone (P4) を添加し， 4h後のET-1，-2，-3および ECE1，2 のmRNA発現量の変化を解析した。【結果】1) 膨大部のET-1発現は，排卵日において黄体形成期および卵胞期よりも有意に高かった。ET-2発現は，排卵日および卵胞期において退行期よりも高い傾向が認められた。また，排卵日の ECE2 発現は卵胞期より高い傾向が認められた。2)上皮細胞にのみ ETs および ECEs の局在が認められた。3) 膨大部上皮細胞における ET-1 発現は， E2 によって増加傾向を示し， ET-2 は増加した。峡部におけるET-2 発現は， LH によって増加し， P4 によって増加傾向を示した。また，膨大部における ECE1 発現は LH，E2 および P4 によって刺激され， ECE2 発現は E2 および P4 に刺激された。以上より，ウシ卵管上皮細胞ではLH やE2，P4 の作用を受けて ECEが増加し，ET-1，-2 の合成が刺激されて卵管平滑筋の収縮弛緩運動に関与しているものと推察された。

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【目的】馬の繁殖現場において,プロジェステロン（P4），エストラジオール（E2），テストステロン（T）の血中濃度は，発情周期，妊娠状態，精巣機能の診断などに必須の情報である。これまでのホルモン測定には，ラジオイムノアッセイ（RIA）やエンザイムイムノアッサイが用いられてきたが，結果を得るまでに時間を要することが難点であった。近年ヒトの医療で使用されているPATHFAST(三菱化学メディエンス株式会社)は，全血を用いて蛋白質ホルモンとステロイドホルモンを26分で測定可能である。PATHFASTを用いて馬の血中ホルモン濃度を測定できれば，馬の繁殖現場で極めて有用である。今回は，馬の血中ステロイドホルモン濃度の測定にPATHFASTが使用可能か否かについて検討した。【方法】研究には，雌雄サラブレッド種を用いた。P4測定には，黄体期雌馬3頭，E2測定には，妊娠馬5頭，T測定には，雄馬6頭を使用した。いずれの馬からも全血と血清を採取した。全血は，PATHFASTにて，血清はPATHFASTとRIA法にて測定した。【結果】P4，T，Ｅ2ともにPATHFASTで測定した全血と血清の値に正の相関関係が認められた。また，PATHFASTで測定した血清とRIA法にて測定した血清の値に正の相関関係が認められた。PATHFASTで測定した値がRIA法に比べて高い傾向を示した。【考察】本研究の結果から，馬血中P4，T，Ｅ2濃度共にPATHFASTで測定可能であることが明らかとなった。しかし，PATHFASTで測定した血中ホルモン濃度は，RIA法による結果よりも高い傾向を示したことから，測定値の評価に際しては，PATHFASTによって測定した馬の各種生理的状態における各種ホルモン濃度の基準値の設定が必要である。

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【目的】未成熟卵のガラス化保存は遺伝資源の保存において重要な技術であるが，加温後の受精能および発生能は著しく低下する。我々は前回大会において，カルシウム(Ca)無添加，エチレングリコール(EG)添加保存液でガラス化保存したICRマウス未成熟卵は，加温，体外成熟(IVM)および体外受精(IVF)後に高い生存性と発生能を有することを明らかにした。本研究では，このプロトコールを用い，ガラス化保存したC57BL/6Jマウス未成熟卵の体外発生能について検討した。【方法】過剰排卵処置したC57BL/6J雌マウスの卵巣から未成熟卵を採取した。ガラス化保存は，採取した未成熟卵をCa無添加PB1に7.5% EGおよび20% ウシ胎子血清(FCS)を添加した平衡液に3分間平衡させた後，Ca無添加PB1に30% EG，20% FCSおよび0.5 M Sucroseを含むガラス化保存液に1分間平衡させ，クライオトップにより行った。加温未成熟卵のIVMは5% FCSおよび10 ng/ml epidermal growth factor (EGF)を添加したMEMαにより14時間培養した。未成熟卵はIVM終了後にC57BL/6J雄マウスの凍結融解精子を用いてIVFした。媒精終了後に成熟率および生存率，6時間後に前核期胚率，24時間後に2細胞期胚率，96時間後に胚盤胞率を調べた。【結果】ガラス化保存およびIVMした未成熟卵の成熟率は89.6%を示した。IVF後の発生率において前核期胚は55.2%，2細胞期胚率は55.2%，胚盤胞率は51.7%を示した。以上の結果より，C57BL/6Jマウス未成熟卵はPB1にCa無添加，EG添加保存液によりガラス化保存することで，加温，IVMおよびIVF後にICRマウス未成熟卵と同様な高い生存性と胚盤胞への発生能を有することが明らかとなった。

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【目的】演者らは，ウシ卵核胞（GV）期卵母細胞のガラス化法を開発してきたが，依然として受精後の発生能が低い。そこで，卵丘細胞除去（裸化）による凍結保護剤の浸透性の向上，および裸化による物理障害軽減のため，細胞骨格安定剤Taxol処理によってガラス化法の更なる改良を試みた。【方法】裸化による凍結保護剤の浸透性の変化を調べるため，ウシ卵巣より採取した卵丘-卵母細胞複合体（GV-COCs），および卵丘細胞をピペッティングにより一部または完全に除去した卵母細胞を，40%エチレングリコールおよび18%フィコール-70，0.3 Mスクロース添加PB1（EFS40）に暴露し，浸透圧による収縮から再拡張までに要した時間を計測した。また，裸化およびTaxol処理が卵母細胞の受精能および発生能に与える影響を調べた。採取後のGV-COCsは，対照区および裸化区，裸化-Taxol区の3区に分け，各処理後にガラス化保存し，体外成熟・受精・発生を行った。Taxol処理は1.0 µg/ml Taxol溶液中で1時間培養した。ガラス化保存は，卵母細胞をEFS10，20，40にそれぞれ5分，4分，1分間暴露後，液体窒素に投入した。【結果】再拡張時間を計測した結果，GV-COCsは23分00秒だったのに対し，一部および完全裸化卵はそれぞれ16分14秒および15分28秒と短縮され，裸化によって凍結保護剤の浸透性を向上できることが示唆された。加えて，一部および完全裸化卵は同程度だったことから，以下の実験は一部裸化卵を用いた。体外受精率は，対照区および裸化区，裸化-Taxol区でそれぞれ21.6%および 40.0％，13.2％と裸化区が最も高く，胚盤胞は裸化区でのみ得られた（2.2％）。 加えて，Taxol単独処理では受精率および胚盤胞率が65.4％および3.8％だったことから，ウシGV期卵母細胞のガラス化保存において，裸化およびTaxolは単独処理で受精能および発生能を向上し得るが，複合処理ではマイナスに作用することが示唆された。

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【目的】我々は既にマウスおよびブタ胚のガラス化保存において，中空糸法により高い生存性が得られることを報告した。本研究は，中空糸法の融解条件が胚生存性に及ぼす影響を検証することを目的とした。 【方法】過排卵処理したBDF1マウスから採取した2細胞期胚を実験に用いた。既報(Matsunariら，2012)に従い，7.5% DMSO，7.5% エチレングリコール(EG)を含む平衡液中で，セルローストリアセテート製中空糸内に10個の胚を収容した。5–7分の平衡後，中空糸を15%DMSO，15%EG，0.5M sucroseを含むガラス化液に1分間維持し，その後液体窒素(LN)中に投入した。3種の融解条件を比較した。通常法：LNから取り出した中空糸を37.5℃に温めた融解液(1M sucrose含)に素早く投入した。加温盤法：中空糸を37.5℃に温めた加温盤上に約3秒静置して融解し，その後室温の融解液に投入した。空気中法：中空糸を室温の空気中に5秒間保持して融解し，その後室温の融解液に投入した。融解液投入以降の凍害保護剤の段階的希釈および洗浄は常温で行った。胚の生存判定は培養および移植試験により行った。 【結果】通常法，加温盤法，空気中法および非ガラス化区の胚盤胞形成率には，有意差は見られなかった(105/110, 95.5% vs. 107/110, 97.3% vs. 94/100, 94.0% vs. 109/110, 99.1%)。各区のガラス化胚を発情同期化したレシピエント雌に移植した結果，妊娠率はいずれも100% (4/4；非ガラス化区のみ2/2)であり，移植胚の胎仔への発達率は，55/80(68.8%)，56/80(70.0%)，55/80(68.8%)，35/40(87.5%)であった(有意差なし)。 【考察】一般にガラス化法においては，超急速な融解条件が必須と考えられている。中空糸ガラス化法では，比較的緩除な条件で融解が行われた場合にも，胚の生存性が高く保たれることが明らかとなった。

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常染色体優性遺伝病にみられる「非浸透」や「表現度の差異」といった現象は古典遺伝学では言葉だけ定義され，その本質的な原因は他の遺伝子，環境要因や偶然による確率的な現象であると説明されてきた。しかし優性遺伝病の原因究明，治療法の確立や病態モデル動物の作製といった医学レベルの実用面を考えたときにこのような確率論的な解釈のみでは不十分である。DNAのメチル化のようなエピジェネティックな遺伝子発現制御は同一個体であっても組織や細胞ごとに異なり，エピジェネティック異常は疾患を引き起こす。ブタはマウスよりも生理学，解剖学，病理学的にヒトと似ているため大型動物モデルとして注目されており，ヒトへの応用を考えた場合ブタで遺伝子発現メカニズムを研究する利点は大きい。本研究はブタにおいて常染色体優性遺伝病であるマルファン症候群の原因遺伝子Fbn1の遺伝子発現制御がエピジェネティックな機構によるものかどうかを調べるために転写開始点近傍のDNAメチル化解析とアンチセンス非コードRNA（ASncRNA）の発現解析を行った。ブタの成体肝臓と胎仔繊維芽細胞（PFF）のバイサルファイト処理したDNAを鋳型としてFbn1の転写開始点近傍領域をPCRで増幅し，メチル化状態の比較を行った。その結果，転写開始点上流と下流に肝臓で高メチル化，PFFで低メチル化状態の領域が存在していた。さらに同じ組織からRNAを抽出してRT-PCRを行い，メチル化状態と相関してFbn1のmRNAが肝臓で低発現，PFFで高発現であることが明らかになった。これにより，Fbn1遺伝子の発現がエピジェネティックな制御を受けていると考えられ，「非浸透」や「表現度の差異」といった現象に分子的な説明ができる可能性を示した。DNAの脱メチル化に関わる可能性のあるASncRNAもmRNAと同様の発現状態を示していた。将来的にはFbn1を始めとした優性遺伝病原因遺伝子についてASncRNAを用いたエピゲノム改変により，疾患の治療や予防などに応用できると考えられる。

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Myostatinをコードする遺伝子Mstnは，TGF-βスーパーファミリーのGDFファミリーに属し，骨格筋の分化を制御する。分化後の筋細胞から分泌されたMyostatinは，筋組織の幹細胞であるサテライト細胞の増殖抑制や，筋芽細胞から筋管への分化抑制等の作用を通じて，骨格筋組織の発生と再生を抑制する。Mstn変異または欠損の動物は筋肥大が顕著であり，畜産において家畜の筋肉量増加を目的とした研究などで注目されてきた。しかし，Mstn欠損または機能不全の家畜動物は，体格の違いによって繁殖が困難なことや，飼糧が大量に必要であることなどの問題がある。また，Mstn欠損は脂肪形成を抑制するため，日本で重要とされる食肉としての品質にも問題があると考えられる。Mstnの骨格筋特異的な機能を畜産において有効に利用するためには，遺伝子の欠損や完全な不活性化ではなく，発現量を微調節することが必要であると考えられる。遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化は，転写因子の結合を阻害し，発現を抑制する。このDNAメチル化は，可逆的な化学修飾であるため，DNAメチル化状態の改変によって遺伝子発現を調節できる可能性がある。また，改変する度合いによって遺伝子の発現量を調整できると考えられる。そこで，ブタ主要組織におけるMstn転写開始点近傍のDNAメチル化状態とmRNAの発現をバイサルファイト法とRT-PCR法を用いて解析した。その結果，Mstn転写開始点近傍は骨格筋でのみ低メチル化状態であり，mRNAの発現も骨格筋特異的であった。この結果から，Mstnプロモーター領域のDNAメチル化状態とmRNAの発現は逆相関していることが明らかとなり，Mstnはプロモーター領域のDNAメチル化状態の変化によって発現調節されることが示唆された。

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【目的】卵巣内に存在する卵胞の数の動的変化を把握することは卵巣機能の客観的な評価となり，雌の生殖能力を診断する上で極めて重要である。現在，卵巣内の卵胞の観察には超音波画像診断（エコー）が用いられている。しかし，エコーは超音波の空間分解能がおよそ110 µmであることから，大型卵胞の画像化には有効であるが，小型の前胞状卵胞の画像化は不可能である。そこで我々は，超音波に比べて高い解像度を有し，組織表層領域の画像解析を可能とする低コヒーレンス光干渉を利用した光干渉断層画像化法（オプティカル・コヒーレント・トモグラフィ：OCT）に着目した。本研究では，OCTを用いてマウス卵巣に存在する各発生ステージの卵胞の非侵襲画像化と定量解析を試みた。【方法】B6C3F1系雌マウス（1.5日及び25.5日齢）から卵巣を採集した。採取した卵巣をリン酸緩衝液（PBS）で湿潤状態を保ち，OCTにより卵巣の画像観察を行った。OCTで計測された構造を特定するために，OCT観察後のマウス卵巣をブアン液で固定し，定法に従い組織切片を作製した後，卵巣内の各発生ステージの卵胞の数的変化を解析した。【結果】OCTにより25.5日齢の卵巣を解析した結果，卵胞腔が認められる胞状卵胞様の構造が観察された。さらに，取得したOCTの3次元データを50 µm間隔で平均化し画像を再構築した結果，直径50 µm程度の卵胞様構造が多数観察された。一方，1.5日齢の卵巣には卵胞様構造は認められなかった。組織切片観察の結果，25.5日齢の卵巣では，原始卵胞から一次卵胞及び二次卵胞を経て，卵胞液腔を有する成熟卵胞が観察された。一方，1.5日齢のマウス卵巣には直径約20 µmの原始卵胞のみが存在した。本研究の結果，OCTシステムは直径50 µm程度の前胞状卵胞を非侵襲的にイメージングできることが明らかになった。今後は，OCTシステムの空間分解の向上を図り，原始卵胞のイメージングと各発達段階の卵胞の定量化を行い，OCTシステムの卵巣機能診断の有用性を検証する。

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【目的】人類は宇宙で繁栄できるだろうか。これまでの研究から，両生類や鳥類の胚は宇宙でも発生できることが確認されている。しかし，肝心の哺乳動物を用いた繁殖実験はすべて失敗に終わっている。これは動物を宇宙で飼育することが困難なことや，宇宙飛行士にとって初期胚を使った実験は難しすぎることが原因だと思われる。我々が行った疑似微小重力発生装置を用いた実験でも，マウス胚は無重力環境下で発育できない可能性を示していた（Wakayama et al. Plos One 2009）。だがシミュレーションでは本当のことはわからない。宇宙での本当の実験が不可欠である。【方法】我々は2009年にJAXAが公募していた国際宇宙ステーション「きぼう」第二次後期利用実験計画に，フリーズドライにしたマウス精子を宇宙で長期間保存し，生殖細胞への宇宙放射線の影響を調べるというテーマで応募した。この方法ならロケットの打ち上げ時と回収時を常温で行え，また宇宙飛行士は容器を運ぶだけなので難しい技術の習得も時間も必要ない。これらの利点が評価され，我々のテーマは2010年に「打ち上げ候補」として採択された。次に我々は1．実際の打ち上げを想定した温度変化を与えても生まれることの確認，2．振動・衝撃が加わっても精子の保存が可能な容器の決定3．エックス線やガンマ線照射を行い，生まれる限界放射線量を決定，4．詳細な実験計画とその評価方法の技術的確立など膨大な量の実験を行い，2012年についに打ち上げ決定となった。実験ではBDF1やB6など4系統のマウスそれぞれ3−4個体からフリーズドライ精子を作成し，宇宙ステーションと地上（コントロール）でそれぞれ3か月間，1年間および2年間保存する。回収後，精子のDNAダメージ度の測定や顕微授精による産仔作出を試み，生殖細胞への宇宙放射線の影響を明らかにする。現在，打ち上げ用として最も出産率の高い試料を選定中である。【結果】2013年8月4日，種子島からH2Bロケット4号機で打ち上げ予定。

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【目的】一般精液性状が正常にもかかわらず人工授精での受胎率が極めて低い精子を産生する黒毛和種雄個体（低繁殖能力雄個体）を検出するため，当センターでは，凍結精液を人工授精した過剰排卵処理雌での体内受精由来の移植可能胚率を指標として利用している。本研究ではより簡便に低繁殖能力雄個体を検出するための試みとして，凍結精子の先体の形態と移植可能胚率の関連を検討した。また，これらの検査結果とチロシンリン酸化（pY）型SPACA1の分布状態との関係も検討した。【方法】通常の検査で異常の認められない黒毛和種雄14頭の凍結精液を試験に供した。既存の検査としてFSH 20 A.U.を漸減法で投与して過剰排卵処理を施した雌に凍結精液を人工授精した後，発情開始後7.5日目に非外科的に胚を採取して移植可能胚率を算出した。精子先体の形態観察では，PFA固定した精子をFITC標識PNAで染色し，先体の損傷度に従って7段階（PNA-I:正常，II:軽度損傷，III～VII:重度損傷）に分類した。先体pY型SPACA1の分布状態については，メタノール固定した塗抹精子に抗リン酸化チロシン抗体を用いた間接蛍光抗体法を施し，精子を3段階（pY+:多，±:少，−:無）に分類した。【結果】PNA- IおよびPNA-I+IIの割合と移植可能胚率の間のスピアマン順位相関係数はそれぞれr=0.88，0.81であった(P<0.01)。pY+の割合と移植可能胚率の相関係数はr=0.72であった(P<0.01)。pY+の割合とPNA-IおよびPNA-I+IIの割合の間の相関係数はそれぞれr=0.80，0.79であった(P<0.01)。以上の成績から，凍結保存後の精子先体における形態の正常性およびpY型SPACA1の分布状態の検査を黒毛和種での低繁殖能力雄個体の検出に利用できることが判明した。また， pY型SPACA1の分布異常が精子先体の低耐凍性に関与している可能性が示唆された。

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【目的】自然交配した小型ポニー（n=3)の妊娠鑑定および分娩日予知のための基礎研究として，妊娠後期の血中ステロイドホルモン（エストロン，プロジェステロン，プレグネノロン，コルチゾル）について抽出法および無抽出法による試料をELISA法で測定した。【方法】妊娠個体は分娩約100日前から分娩直前まで定期的に，また非妊娠個体や妊娠喪失個体についても採血して測定した。エーテル抽出法では血漿阻害因子や代謝産物は除去される。無抽出法では代謝物も反応し，また阻害因子のため誤差が生じる。エストロンは胎児性腺，プロジェステロンは胎盤，プレグネノロンは胎児副腎，コルチゾルは胎児および母体副腎が主な由来であると考えられ，母体血中では胎盤による代謝産物がこれに加わる。【結果】エーテル抽出法では，エストロンとプロジェステロンは変動しながら徐々に低下した。プレグネノロンとコルチゾルの濃度は比較的高く，変動しながら同程度の濃度を維持した。プレグネノロンは非妊娠個体では低かった。無抽出法では，エストロンは非常に高く，分娩5日前から低下する傾向が，プロジェステロンは15～5日前から上昇する傾向が見られた。【考察】小型ポニーの妊娠鑑定用ホルモンとしてはエーテル抽出法によるプレグネノロン，分娩日予知用ホルモンとしては無抽出法によるエストロンの測定が有効ではないかと推察された。またホルモン動態について，文献上サラブレットと一致するものと異なるものがあった。さらに，エーテル抽出法と無抽出法の結果が大きく異なる事が示された。

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【目的】ウシを含む雌個体の発情発来時には，一過性に体温が上昇することが知られており，LHサージによる排卵との関連が調べられている。演者らは腟内に留置したデータロガーによる連続体温計測並びに直腸温度の定期計測によって深部体温と腟内温度の両方で発情時の体温上昇パターンを明らかにしている。しかし，深部体温や腟内温度の長期連続計測には労力や衛生的な問題があり，非侵襲的な体温情報取得の必要がある。発情時や疾病時の体温情報を非侵襲的に得るための手法として赤外線サーモグラフィー(Infrared　Thermography:IRT)が注目されている。そこで本研究では，発情に伴う体表面温度変化を計測し，計測部位による温度データ取得の可否および，非発情，発情時の温度変化を捉えることを目的とした。【方法】九農研内で飼養されている黒毛和牛繁殖雌牛群について，1～2周期にかけての発情を乗駕行動，外陰部充血腫脹ならびに頸管粘液の電気インピーダンス (EI) 値を元に確認した。体表面温度の計測にはIRTを用い，発情期および非発情期の牛について外陰部および頭部側面の二か所で距離と角度を同一にして撮影し，赤外線画像を得た。画像データは計測ソフトウエアを用いて温度表示範囲を統一表示後，計測領域内の最高温度値を体温値とした。【結果】乗駕行動，発情粘液の漏出とEI値の低下によって発情を確認した個体では，外陰部周辺の表面温度最高値は非発情期の個体と比べて有意(P<0.01)に高かった。また，頭部についても温度最高値が得られた眼球白目部分の温度平均は発情期の個体で有意（P<0.05）に高かった。撮影対象部位の体毛に覆われた部分では発情，非発情の違いは検出できなかった。加えて，日中，太陽光に照らされた個体では，太陽光の輻射熱が優位になることで正確な体温情報を得ることは困難であった。本結果から，適切な撮影部位の選択および輻射熱の影響を考慮することで，IRTによる非侵襲的な体温情報を得ることが可能であることが示唆された。

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【目的】夏季の暑熱環境下は，牛において受胎率の低下および発情の微弱化による供用率を低下させ，受胎頭数の大きな低下を招くことから，その解決が急務である。本研究では，鈍性発情の発生要因として季節との関連性に焦点をあて，暑熱と発情行動との関連性を調べ，発情微弱化の原因を臨床内分泌学的手法により検索した。【方法】46頭の黒毛和種繁殖牛を用いた。観察および発情発見器具を用いて発情の有無を調べた。また，一部の牛では乗駕許容（ST）センサーによりST行動を検知し，季節との関連性を調べるとともに，発情前後の生殖器の変化を直腸検査および超音波画像により追跡し，合わせて血中ステロイドホルモンを測定し，発情兆候との関連性を比較検討した。【結果】暑熱期（7/1–9/9），移行期（9/19–10/17），冷涼期（10/23-/11/9）におけるST行動の発現率を調べた結果，暑熱期に有意（P<0.0.5）に低下した。一方，ST行動の様相は季節間に差は認められなかったことから，暑熱ストレスは牛群のST発現率を低下させるが，発情牛のST行動には負の影響を及ぼさないと考えられた。なお，ST牛の発情強度はST開始時に最も強く，時間経過とともに有意（P<0.01）に低下した。鈍性およびST発情牛における黄体退行時の黄体ホルモン推移を調べた結果，日数と黄体ホルモンとの交互作用に有意（P<0.05）な差を認めた。すなわち鈍性発情牛では黄体退行に伴う黄体ホルモンの低下が緩慢に推移した。一方，発情前後の発情ホルモンの推移，発情時のステロイドホルモン濃度ならびにE₂β/P比は両区で差を認めなかった。以上のことから，暑熱環境では鈍性発情の発現率は有意に増加し，緩慢な黄体退行は鈍性発情の原因となることが明らかとなった。一方，暑熱環境下で発現するST行動は他の時期と同等であることが示された。

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【目的】ウシでは排卵直後に新たな卵胞波が形成され，これは第1卵胞波と呼ばれるが，この第1卵胞波が繁殖生理や受胎性に与える影響はよく分かっていない。そこで，今回，第1卵胞波主席卵胞が黄体と同一卵巣内に共存するまたは共存しないということが，受胎率にどのように影響を与えるかを検討した。【方法】試験1では，帯広畜産大学畜産フィールド科学センターにおいて，2008年3月～2009年6月に，人工授精後1日以内に排卵が確認され，排卵後5から9日の間に黄体と第1卵胞波主席卵胞が確認された，経産泌乳牛（71頭）および未経産牛（43頭）のデータを用いた。全授精頭数に対する受胎頭数（総受胎率），経産泌乳牛授精頭数に対する受胎頭数（経産受胎率），未経産牛授精頭数に対する受胎頭数（未経産受胎率）を調べた。また，黄体が存在する卵巣に第1卵胞波主席卵胞が共存する牛（共存群：54頭）の受胎率および共存しない牛（非共存群：60頭）の受胎率を調べた。試験2では，2010年3～7月に，経産泌乳牛（14頭）を用い，排卵確認日から3，6および12日目に採血と超音波画像診断装置を用いて卵巣の観察を行い，血中プロジェステロン（P4）濃度および黄体と第1卵胞波主席卵胞との共存および非共存を確認した。【結果】総受胎率57.0％，経産受胎率47.9％，未経産受胎率72.1％であった。非共存群（72.2％）が共存群（40.4％）に比べ有意に高い受胎率を示した（P＜0.01）。また経産牛と未経産牛別で検討したとき，双方とも非共存群で有意に高い（P＜0.05）受胎率を示した（経産牛；非共存群：62.1％ vs 共存群：27.6％，未経産；非共存群：84.0％ vs 共存群：55.6％）。血中Ｐ4濃度は排卵確認日から3日目において非共存群で有意に高く（P＜0.05），6および12日目では差はなかった。【考察】人工授精後における，同一卵巣内での第1卵胞波主席卵胞と黄体共存の有無は，その後の受胎性に大きく関与することが示され，その要因の1つとして主席卵胞が黄体と共存することで黄体のＰ4産生能に影響を与えることと示唆された。

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【背景】黒毛和種雌ウシの分娩後の繁殖性を予測するバイオマーカーに関する報告は少ない。抗ミューラー管ホルモン（AMH）は卵巣予備能に，インスリン様成長因子1（IGF-1）は卵胞発育に関わっている。本研究では，分娩前後の黒毛和種雌ウシの血液中のAMH，IGF-1の動態を明らかにし，分娩後の繁殖性のバイオマーカーとしての有用性を検討した。 【材料と方法】1農場で飼養されている黒毛和種雌ウシ12頭(4–13産，平均6.8産)を供試した。通常はフリーバーン牛舎で，分娩前7日から分娩後28日は分娩房で飼養し，分娩後4カ月間は子牛による自然哺乳とした。発情発見後に人工授精(AI)を行ったが，分娩後63日までにAIされなかった牛は排卵同期化により定時AIを行った。分娩の-9週(-9w)，-4週(-4w)，-2週(-2w)，分娩後6日以内(0w)，分娩後2週(2w)，4週(4w)に採血し，血中AMH，IGF-1，プロジェステロン(P₄)濃度を測定した。分娩後，1週間間隔で超音波検査を行い，黄体の確認と血中P₄濃度が1ng/ml以上だった週を発情回帰とした。分娩後の繁殖性として，初回AI日数，初回AIの受胎性，受胎までのAI回数，空胎日数を記録した。 【結果】平均血中AMH濃度は，-9wの0.10 ng/mlと-4wの0.07 ng/mlが-2wから4w (0.05–0.06 ng/ml)よりも，平均血中IGF-1濃度は，-9wから0w (79.0–115.4 ng/ml) が2wと4w (それぞれ56.9，55.2 ng/ml)よりも，有意に高かった。血中AMH濃度は各週のすべての間で有意な相関 (r = 0.65–0.96)がみられ，血中IGF-1濃度は-9wと-4w，0wと2wおよび4w，2wと4wに有意な相関(r = 0.66–0.86)がみられた。各週の血中AMHおよびIGF-1濃度と発情回帰，初回AI日数，受胎までのAI回数，空胎日数との相関は，0wの血中IGF-1濃度と空胎日数(r = –0.63)に有意な相関がみられた。また初回AIで受胎した牛は不受胎だった牛に比べ0wのIGF-1濃度が有意に高かった。 【結論】本研究では，黒毛和種雌ウシにおいて，分娩後6日以内の血中IGF-1濃度が分娩後の繁殖性の有用なバイオマーカーとなる可能性が示唆された。

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【背景と目的】近年，牛の受胎率は漸減傾向にあり早期胚死滅が不受胎を招く大きな要因の一つとなっている。そのため，早い時期での胚生存性の評価指標あるいは妊娠診断法が求められている。一方，子宮内での生存胚の存在下では，黄体退行因子である子宮からのプロスタグランジンF_2α分泌を抑制し，妊娠を維持していることは知られている。そこで本研究では，従来法よりも早期の胚生存判定法を確立することを目的とし，妊娠初期牛へのオキシトシン(OT)負荷がその後のプロスタグランジン動態に及ぼす影響について調べた。 【方法】黒毛和種妊娠(P区)および未授精牛(NP区)を用い，発情後8，12，14および16日(発情日を0日とする)にOT負荷試験を実施した。100IU OT投与前30分から投与後180分まで計17回の頻回採血を行い，血中プロスタグランジン代謝産物(PGFM)濃度を測定した。PGFM濃度は，OT投与前の平均値を基底値とし，投与前後の濃度を基底値に対する百分率に換算し，その動態を比較検討した。また，OT負荷試験日の黄体面積およびプロジェステロン(P4) 濃度についても比較検討した。 【結果と考察】PおよびNP区において，発情後日数にかかわらずOT投与後にPGFMの一過性の上昇が認められた。発情後8～14日では，PおよびNP区は同様なPGFM動態を示したが，発情後16日においては，P区はNP区と比較して有意(P<0.01)に低い動態を示した。一方，黄体面積およびP4濃度は発情後16日において両区間に有意な差は認められなかった。また，P区については妊娠30日で受胎を確認し，現在も妊娠継続中で一部はすでに正常に分娩した。以上の結果から，妊娠初期にOT負荷を実施しても妊娠維持に影響はなく，発情後16日での生存胚の存在下において，OT負荷試験後のPGFM産生は抑制されることが示された。発情後16日でのOT負荷試験は胚の早期生存判定の新たなツールと成り得る可能性がある。

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The aim of this study was to examine the ovarian follicular growth dynamics, treated with pFSH multiple fractionated injections 4 times per day using Micro syringe and improve this administration method in Holstein cows. Donors were divided into two groups and synchronized by injection of PGF2∞. Group 1(Study), was treated with a total 30 AU of pFSH (progressive reduction dose) 4 times per day, superovulation treatment were initiated from days 10 to 13 (n=7). Group 2 (Control), was treated with a total 30 AU pFSH twice a day as a traditional method (n=8).Trans-rectal ultrasonograpy performed to monitor ovarian follicles size, and classified in to 3 groups as small follicles (<5 mm), medium (5–10 mm), and large (>10mm). The number of small follicles were significantly (P<0.01) decreased in group 1, from days 10 to 13 than group 2. The number of medium follicles was lower in group 2. Thus, the number of large follicles was increased from D 11 to D13 in Group 2. Embryo collections and measurement of corpus luteum (CL) were done on day 6.The mean number of CL were 19.6 and 9.1 meanwhile, large unovulated follicles were 1.1 and 2.8 respectively in group 1 and group 2. In conclusion the result of this study indicated that follicular growth dynamics and formation of CL were induced in superovulated cows, those treated with multiple injections than treated with twice a day. Multiple injection of pFSH could be useful for follicular growth dynamics in Holstein cows.

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【目的】牛の子宮内膜炎は，繁殖成績の低下をもたらすだけでなく繁殖障害による淘汰にもつながる重要な子宮疾患であり，乳用牛を中心に多くの研究が進められているが，黒毛和種における知見は少ない。そこで，黒毛和種経産牛における分娩後の腟粘液および子宮環境の変化を経時的に調査するとともに，繁殖性との関連について検討した。【方法】正常に分娩した50頭の黒毛和種経産牛を対象に，分娩後2週から6週まで1週ごとに採材した（延べ206頭）。腟検査はメトリチェックを使用し，腟粘液をスコア（MCS）0～4の5段階に分類した。子宮内膜細胞診はサイトブラシを用い，採取した子宮内膜スメアをスライドガラスに塗抹して染色した標本を顕微鏡下で観察，全細胞数に占める多形核好中球の割合（PMN%）を算出した。また，分娩後，人工授精を施した供試牛の受胎成績とMCS，PMN%との関連について検討した。【結果】腟検査では，分娩後2週目ではMCS≧2の個体が全体の57%を占めたが4週目では12%に減少し，6週目ではすべてMCS≦1となった。なお，平均MCSは，分娩後2，3週目までは高く推移し，4週目以降は有意に低下した（P<0.05）。子宮内膜細胞診では，分娩後2，3週目ではPMN>8%の個体が全体の27%を占めたが，6週目では3%まで減少した。平均PMNは，分娩後2，3週目までは高く推移し，4週目以降は有意に低下した（P<0.05）。このことから，黒毛和種においては，分娩後4週目までにはほとんどの牛で子宮環境が回復することが明らかとなった。一方，繁殖性との関係では，分娩後2週目のMCSと空胎日数との間に有意な負の相関が認められ（P<0.05），分娩後早期にMCS，PMNが高いほど受胎率が高くなる傾向が認められた。これらの結果は，黒毛和種において分娩後の腟粘液および子宮環境と繁殖性との関連を示唆するものであり，今後さらに研究を発展させていく必要がある。

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【目的】牛の分娩後の子宮修復を妨げる要因の一つとして病原細菌による感染が挙げられる。乳牛においては分娩後5週までに半数以上の個体において子宮内から細菌が排除されることが知られているが，肉牛，特に黒毛和種に関する報告は少ない。そこで，黒毛和種の分娩後の子宮内環境の動態とその後の繁殖成績との関係を明らかにするために試験を行った。【方法】黒毛和種経産牛51頭（年齢：3.34±1.34歳，産歴：2.25±0.72，平均±SD）を供試した。供試牛は分娩後2週までに子牛を離乳し，同一個体より2週（2W）から6週（6W）の各週でサイトブラシを用いて子宮内膜スメアを採取し，一般細菌の分離を試みた。また，分娩後30日以降に交配（AIまたはET）が行われた個体（25頭）おける，初回交配日数および受胎率と空胎日数を算出した。【結果】初回交配日数は58.1±23.3日（平均±SD），初回受胎率は40.0%，平均空胎日数は82.1±55.1日であった。採材した週毎に算出した細菌分離率は2W（45.2%），3W（52.6%），4W（34.1%）と推移し，その後5W（20.0%），6W（23.1%）と低値を示した。試験期間を通して，主要細菌としてStaphylococcus spp.，E. coli，Acinetobacter spp.，Trueperella pyogenesなどが分離された。2Wに細菌陽性の個体における初回受胎率は22.2%（2/9）であったのに対し，陰性の個体では50.0%（8/16）であった。また，試験期間中のいずれかの週において細菌陽性であった個体における初回受胎率は30.0%（6/20）で，細菌陰性の個体の80.0%（4/5）と比較して有意（p＜0.05）に低かった。【考察】黒毛和種の細菌分離率が分娩後3Wから4Wにかけて減少し始めることから，この時期に子宮内環境の清浄化が進行していることが示唆された。また，分娩後早期における子宮内の細菌の存在がその後の繁殖成績に関係していることが示唆された。

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【目的】　インスリンシグナルの異常は，母体や胎児の健康維持に多大な影響を及ぼす。妊娠時におけるインスリン抵抗性の増大は，妊娠糖尿病を引き起こすことがあり，胎児の奇形・巨体化のリスクを高めることが知られている。したがって，インスリンシグナルの修飾機構の解析は，妊娠，出産の維持，管理に新たな情報を提供する可能性がある。我々は，インスリンシグナルの修飾機構を解析する過程でインスリン受容体基質（IRS）に結合する因子として，PINCH2を同定した。本研究では，PINCH2の個体レベルでの作用を明らかにする目的で，ヒトPINCH2を全身に発現するマウス（hPINCH2 Tg）の糖代謝能，各臓器のインスリンシグナルを解析した。 【方法】 10–11週齢の雄のhPINCH2 Tgを用いて，糖負荷試験，インスリン負荷試験を行った。さらに，インスリン負荷による肝臓，筋肉，脂肪組織におけるインスリン受容体のチロシンリン酸化量を測定した。 【結果】　糖負荷試験の結果，血中グルコース濃度は正常マウスのものと比較してhPINCH2 Tgでは低下し，この際，血中インスリン値がhPINCH2 Tgで増加することが明らかになった。一方，インスリン負荷によるhPINCH2L Tgの血中グルコース濃度の低下は，正常マウスのものと同様であった。インスリン投与後の肝臓，筋肉，脂肪組織のインスリン受容体のチロシンリン酸化は，正常マウスのものと比較して，hPINCH2 Tgでは増加（肝臓）あるいは減少傾向（筋肉，脂肪組織）を示した。 【考察】　hPINCH2 Tgでは，グルコース依存性インスリン分泌が増加すると同時に，インスリン標的組織におけるインスリン感受性が変化し，これが糖代謝に影響を及ぼしているものと考えられる。

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【目的】　pH環境の変化は，卵の形成・成熟や子の発育など，生殖・発生過程に多大な影響を及ぼす。しかしながらその作用メカニズムは不明である。魚類の卵は，その成熟がpH変化により多大な影響をうけることが知られている。従って魚類を用いた解析は，上記の作用メカニズムの解明に対して，有用な情報を提供するものと予想される。我々はこれまでに，ヒトOGR1ファミリー受容体が細胞外pHの低下を感知して活性化し，種々の細胞応答を引き起こすことを見出してきた。今回我々は，ゼブラフィッシュのゲノム上にヒトOGR1ファミリー受容体遺伝子と相同性の高い遺伝子（zOGR1, zGPR4, zG2A）を見出した。本研究では，これら相同性の高い遺伝子がpH感知性受容体かどうかを明らかにすることを，目的とした。【方法】ゼブラフィッシュOGR1ファミリー相同遺伝子の各cDNAを発現ベクターに組み込み，HEK293細胞に強制発現させた。そして各種レポーター遺伝子を用いて，受容体活性化に伴うシグナル伝達経路の活性化の解析を行った。【結果】ゼブラフィッシュOGR1ファミリー受容体（zOGR1，zGPR4，zG2A）は，細胞外pHの低下を感知して活性化した。各受容体の活性化に伴い，活性化されるシグナル伝達経路は，受容体により異なっていた。受容体の活性化のED₅₀は， pH7付近であった。これはヒスチジンのpKaとほぼ一致する。受容体内のヒスチジン残基がプロトンの感知に関与している可能性がある。

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【目的】哺乳類の繁殖機能の制御に中心的役割を果たす視床下部—下垂体—性腺軸を上位で制御する因子として，近年キスペプチンが注目されている。視床下部弓状核に存在するキスペプチンニューロンには，ニューロキニンBとダイノルフィンAが共在しており，これらのペプチドの作用により性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）のパルス状分泌が制御されることが示唆されている。本研究では，シバヤギを用いて，ダイノルフィンA受容体であるκオピオイド受容体（KOR）の拮抗剤の静脈内投与が，パルス状黄体形成ホルモン（LH）分泌およびGnRHパルスジェネレーター活動の指標となる視床下部弓状核における多ニューロン発火活動（MUA）におよぼす効果を検討した。【方法】実験には卵巣除去—E2代償投与雌シバヤギ（n=5）を用いた。頸静脈に留置したカテーテルを通じて蒸留水（10 ml/h）または新規KOR拮抗剤であるPF−4455242（2.5 µmol/kg/h）を4時間にわたり持続的に静脈内投与した。投与開始4時間前から4時間後まで，6分おきに頸静脈留置カテーテルを通じて採血を行い，得られた血漿中のLH濃度をラジオイムノアッセイにより測定した。また，視床下部弓状核に記録用電極を留置した卵巣除去—E2代償投与雌シバヤギ（n=2）を用いて，PF-4455242または蒸留水の持続投与の前後を通じてMUAの記録を行い，MUAの一過性の活動上昇（MUAボレー）頻度におよぼす影響を検討した。【結果および考察】PF-4455242投与群では，持続投与中のLHパルス頻度が亢進し，投与開始直後から基底LH濃度の上昇が確認された。また，投与前に比較してMUAボレー間隔が短縮していることが確認された。以上の結果より，GnRHパルスジェネレーターの活動が，KORを介してダイノルフィンAにより抑制されることが示唆された。また，末梢に投与された新規KOR拮抗剤は，中枢に作用することにより，GnRHパルスジェネレーター活動を促進することが明らかとなった。

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【目的】エストロジェン受容体（ER）を介したシグナル伝達系は主に雌性生殖器の発生発達や成熟後の機能調節に必須であるばかりか，雄性生殖機能や中枢機能についても重要な役割を演じている。一方で，合成エストロジェン等の化学物質によるERシグナルかく乱は，こうした機能への異常を誘発する危険が指摘され，例として胎生期における合成エストロジェン暴露が乳がん発生リスクを高めることが知られている。そこで，本研究では幼若期雄動物における一時的なERシグナルかく乱が中枢機能および生殖機能に与える影響を検討する。【方法】生後2週齢のC57BL/6雄マウスに合成エストロジェンであるDES（Diethylstilbestrol）をモデル化学物質として1mg/kgにて単回強制経口投与した（溶媒はDMSOおよびコーンオイルを併用した）。生後7週齢から8週齢にかけて，オープンフィールド試験，明暗往来試験，恐怖条件付け学習記憶試験からなるバッテリー式の行動解析を行った後，SMASを用いて精巣上体精子の運動性解析を行い，脳および精巣については形態解析を行った。【結果と考察】中枢機能影響として，行動解析の結果，DES投与群において不安関連行動の逸脱と学習不全，そして海馬依存性が高いとされる空間連想記憶の異常が認められた。一方，生殖機能影響として，精巣上体精子の運動性に異常は認められず，またHE染色による形態観察から精子発生はほぼ正常と考えられた。以上の結果から，幼若期におけるERシグナルかく乱は，雄生殖機能に重篤な影響を及ぼさないものの，中枢機能に異常を誘発する危険が指摘された，今後，異常行動に対応する脳の責任部位を明らかにする必要がある。

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4-Nitrophenol (PNP) isolated from diesel exhaust particles has been identified as an environmental endocrine disruptor. However, we lack knowledge on how PNP exposure affects estradiol and testosterone serum concentrations and the balance between the two. Male rats were injected subcutaneously with PNP (0.1, 1, 10 mg/kg body weight or vehicle) daily for 4 weeks. We assessed reproductive tract alterations, sex hormone balance in the serum and estrogen receptor (ER)-α, -β and androgen receptor (AR) expression in testes. No significant difference was observed in body weight or testes weights of PNP-treated rats compared with the controls, however, the serum concentrations of testosterone in the 10 mg/kg PNP-treated group were significantly elevated. This effect was accompanied by Leydig cells hyperplasia in the testes. Conversely, there was a significant decrease in estradiol concentration and aromatase expression in the testes of the 10 mg/kg PNP-treated group. Furthermore, we observed a significant increase in ERα expression in the testes of the 10 mg/kg PNP-treated group compared with the control group. Conversely, ERβ expression displayed a significant reduction. Moreover, AR expression was significantly increased in the 10 mg/kg PNP-treated group compared with the control group. The existence of AR, ER-α and -β in the testes suggests that estrogens and androgens directly affect germ cells and that differential modulation of AR, ER-α and -β in the testis may be involved in the direct effects of PNP or either the indirect effects of PNP-induced disruption of the estrogen-to-androgen balance or the Leydig cells hyperplasia.

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【目的】一般に季節繁殖動物の雄では，非繁殖期には血中テストステロン(T)濃度が低く精子形成機能が低下する。しかし，冬に交尾期を持つアライグマ(Procyon lotor)では，非繁殖期である夏にT濃度が低いにも関わらず精子形成が活発な個体がいることが報告されている。このことは，T産生と精子形成が異なる機構により調節されている可能性を示している。本研究は，ステロイド代謝酵素(P450scc，P450c17，3βHSD，P450arom) およびアンドロジェン受容体(AR)発現の季節差と個体差を解析することにより，T産生および感受性と精子形成との関連性を明らかにすることを目的とした。【方法】冬期個体(n=4)，夏期に活発な精子形成がみられた個体(n=4)および夏期に精子形成がみられなかった個体(n=6)について，血漿中T濃度をELISA法にて測定した。また，精巣組織切片の免疫染色により上記4酵素とARの発現部位を特定し，3群間での発現強度を比較した。【結果・考察】精巣組織において，P450sccおよびP450c17はLeydig細胞，3βHSDはLeydig細胞およびSertoli細胞，P450aromはLeydig細胞，Sertoli細胞および一部の精子細胞で発現が確認された。夏期個体の平均T濃度は冬期個体に比べ低値であった(夏：0.2ng/ml，冬: 2.3ng/ml)。P450sccおよびP450c17は3群間で発現強度に差は見られなかったが，3βHSDは冬期個体に比べ夏期個体で発現が弱かったことから，T産生には3βHSDの発現変化が関係していることが示唆された。またP450aromおよびARは夏期に精子形成がみられた個体では冬期個体と同程度に発現したが，夏期に精子形成がみられない個体では極めて発現が弱かったことから，夏期の精子形成維持にはP450aromおよびARが関わっており，それぞれ精子の成熟機構および精巣組織におけるテストステロン感受性の維持に関係していることが示唆された。

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【目的】Fluorescence in situ hybridization(FISH)法は染色体や間期核におけるある特定の塩基配列や遺伝子を検出するとともに，位置情報を得る手法として有用である。また，動物生産領域において性染色体の検出は性判定を行う有用な技術として知られており，実際に，初期胚や精子ではFISH法による性染色体の同定法は確立されている。しかし，精子発生過程における精細胞分化過程での性染色体動態については不明な点が多い。そこで，本研究ではパラフィン包埋精巣組織切片上における，FISH法の応用による性染色体動態解析を試みた。本手法の高度化から，従来注目されていなかった精子発生過程における性染色体の局在様式や数的異常などの容易な検出が期待できる。【方法】性染色体動態解析方法として，XおよびY染色体に対するFISH法による検出を行った。生後12週齢のC57BL/6雄マウスから摘出した精巣をメタカン液にて固定した後，常法に従い，パラフィン切片を作製し，マウスXY染色体DNAプローブ（X：biotin標識　Y：FITC標識）によるハイブリダイゼーションを行った。その際，精巣組織切片の前処理として抗原賦活化液による熱処理賦活化を行った。尚，Y染色体はシグナル強度を高めるためにanti-FITCとAlexa488 donkey anti-rabbit，X染色体はSterptavidin-Rhodamine，核染色にはHoechst33342を用いてシグナル検出をし，共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。【結果】マウス精巣組織切片上でX 染色体，Y染色体，および細胞核の特異的蛍光シグナルが確認された。すなわち，本研究によってマウス精巣組織切片上の精細胞における性染色体局在動態が明らかとなった。本手法は精子発生過程における精細胞の性染色体局在状態や数的異常などの検出方法としても応用が期待できる。今後，異種への応用や幅広い分野を視野に入れた利用方法について検討したい。

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【目的】ウシの人工授精による受胎率が世界的規模で年々低下しているが，その原因や解決策は見出されていない。しかし，精液生産の現場では，精子の形態や活力には問題はないが，受胎成績の悪い種雄牛の存在が判明し，受胎率低下を加速させる雄側要因の一つである可能性が指摘されている。そのため，このような種雄牛を早期に判定できる検査法の開発が求められている。本研究では，DNAの変性の程度に応じて異なった蛍光色を発するアクリジンオレンジ（AO）蛍光色素を用いた精子核クロマチンの性状解析に基づく新しいウシ精子受精能の評価法を確立し，その有用性を受胎成績の異なるウシ凍結精液で検証した。【方法】人工授精による受胎成績の判明しているウシ凍結精液を使用した。精子塗抹標本を作製し，低pH・非イオン界面活性剤によるDNA変性負荷を施した後，AO蛍光色素で10分間反応させ，蛍光顕微鏡で観察した。1標本あたり1500精子以上をカウントし，緑，黄，赤の蛍光色に分類した。黄と赤はDNA変性を起した精子と判定し，それらの精子の割合を変性率として算出した。【結果】正常精液ではほとんどの精子頭部はAOで緑に染色されたが，受胎成績の悪い精液（低受胎精液）では赤や黄色に染まった精子頭部が多数観察され，多くの精子がDNA変性を起していることが示された。精子核DNAの変性率は低受胎精液では有意に高い値を示し， DNA変性負荷に対して精子核クロマチンの構造安定性が著しく低下していることが判明した。また，本アッセイのアッセイ内変動係数は10.6％，アッセイ間変動係数は12.5％と高い精度を示し，ウシ精子核クロマチンの精度の高い評価法を確立することができた。本法の有用性を受胎成績の異なるウシ凍結精液65検体で検証した結果，受胎成績と精子核DNAの変性率との間には高い負の相関のあることが実証できた。【結論】本法は，コストがかからず，高度な技術を必要としないため，精液生産現場において簡易にウシ精液の受胎性を検査できる効果的な評価法となり得ることが示唆された。

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【目的】Ca²⁺依存性チオールプロテアーゼスーパーファミリーに属すカルパイン(CAPN)は哺乳動物の様々な組織に分布し，細胞骨格リモデリング，細胞周期，細胞分化，アポトーシスおよび細胞膜融合を調節する細胞内カルシウムシグナル伝達機構の制御に関与している。精子ではCAPN 1が鞭毛および頭部に存在し，ヒトではプロジェステロンによる鞭毛運動の活性化に，モルモットではキャパシテーション(CAP)の進行とともに分布を細胞質から細胞膜へと変化させて先体反応(AR)の促進に機能すると報告されている。本研究ではブタ精子における前進運動，CAP，ハイパーアクチベーション(HA)およびARを調節する細胞内カルシウムシグナル伝達機構を明らかにする目的で，ブタ精子に存在するCAPNを検出し，その機能について検討した。【方法】精巣におけるCAPNの発現をRT-PCRおよびウェスタンブロット(WB)により解析した。射出精子でのCAPNの検出はWBおよび間接蛍光抗体法により行った。また射出精子におけるCAPNの機能解析にあたっては，CAPN阻害剤(CI III)の添加が精子の前進運動，CAP，HAおよびARに及ぼす影響を活力検査，WBによるチロシンリン酸化タンパク質の検出およびFITC標識PNA-PI二重染色法より調べた。【結果】精巣では少なくとも3種類のアイソフォーム(CAPN1，2および11)の発現がmRNAおよびタンパク質のレベルで認められた。一方，射出精子においてタンパク質レベルで検出されたアイソフォームはCAPN2のみで，鞭毛のほぼ全長にわたり点状に分布し，CAPに伴う分布の変化は認められなかった。CI III添加に伴う射出精子の前進運動率，タンパク質チロシンリン酸化状態およびAR誘起率での顕著な変化は認められなかったが，HAだけが添加濃度依存的に抑制された。以上の結果から，ブタ精子では少なくともCAPN2が鞭毛に分布して，運動様式の前進からHAへの変化に関与すると推察される。

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【目的】精子の受精，運動能の調節にはカルシウムイオンと重炭酸イオンが大きな作用を示すと考えられている。精子のカルシウムイオンシグナリングはイオンチャンネルの活性化，阻害剤を用いて解析が進められているが，流入したカルシウムイオンがどのように直接精子の受精，運動機構に作用しているのかは不明である。そこで，カルシウムイオンの調節剤となるカルシウム結合タンパク質に着目し，精巣のデータベースから新たにCABS2が同定された。本研究では，カルシウムイオンシグナリングの解明を目的とし，CABS2の解析を行った。【方法】データーベースを用いた解析から精巣特異的に発現するカルシウム結合候補タンパクを複数絞り，CABS2に着目した。作成したCABS2組み換えタンパク質がカルシウム結合タンパク質であるか明らかにするため，SDS-PAGEで泳動し，CBB染色とカルシウム結合タンパク質を染色するStains-all染色を行った。また，RT−PCRにて組織別発現の解析と抗体を作成して免疫組織化学的解析を行い，組織内の発現を解析した。【結果】CBB染色の結果から44ｋDaにて検出され，Stains-allでの染色が観察された。このことから，CABS2はカルシウム結合タンパクであることが示唆された。また，還元剤を含めないと66ｋDaにて検出され，還元剤を含めると44ｋDaにて検出された。これをMALDI-TOF-MSで測定したところ，同一のペプチドであることが確認された。シークエンスからCABS2はcoiled-coil domainを有しており，これが複合体を形成すると考えている。RT-PCRを用いた各組織別発現解析の結果では精巣特異的に発現しており，免疫組織染色の結果から円形精子細胞から発現が始まり，精子鞭毛でも強い発現が観察された。

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【目的】精子の受精や鞭毛運動にカルシウムイオンは重要な働きを担っており，精子内カルシウムシグナリングに関してはCatsperイオンチャネルなど様々なイオンチャネルが関与し精子内へのカルシウムイオンの流入が明らかにされているが，内部に流入したカルシウムイオンが細胞内でどのような経路を介して精子の鞭毛運動の変化や受精に関与しているのかは明らかにされていない。そこで本研究では精子に発現する新規カルシウム結合タンパク質と予想されるEFCAB2に着目し，その局在部位と機能の解析を行った。【方法】マウス精巣のデータベースを用いた解析からカルシウム結合タンパク質であるとEF-motif calcium binding protein 2 (EFCAB2)を予想した。その後，EFCAB2の組換えタンパク質を作製し，カルシウム結合タンパク質を検出するStains-allを用いたスペクトル解析により，EFCAB2のカルシウム結合の有無を調べた。また，精巣内でのmRNAの発現部位を調べるため，In situ hybridizationを行い，タンパク質の局在を調べるために免疫組織染色によりマウス精巣における発現と蛍光免疫染色により精子内での局在部位を明らかにした。【結果】EFCAB2発現タンパク質のStains-allによる染色とスペクトル解析により，EFCAB2がカルシウムを特異的に結合するタンパク質であることが分かった。抗マウスEFCAB2抗体を用いたマウス精巣・精子タンパク質のウェスタンブロッティング解析でEFCAB2は16kDaの単一のバンドとして確認できた。また，精巣内にてmRNAが円形精子細胞に強く検出され，さらに，免疫蛍光染色ではEFCAB2は精巣内の円形精子細胞に発現し，その一部は精子鞭毛に取り込まれていることが明らかになった。さらに，精巣上体尾部精子の鞭毛主部中片部に強いシグナルが観察できた。

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Seasonal poor semen quality has been a well-known problem in boars across the world. Normal spermatogenesis is temperature dependant. Therefore, it is necessary to interpret the mechanism that high ambient temperature lead to poor semen quality in boar and elucidate whether the elevated temperature damaged spermatogenesis in boars’ testis when boars are being exposed to the elevated ambient temperature. Five boars were selected and exposed to elevated ambient temperature. After boars received 3-day heat exposure, semen collection was standardized to 18 continual times with a 3-day interval to determine the variables: semen characteristics, sperm viability, motility parameters, abnormal spermatozoa, composition of seminal plasma and testosterone level in seminal plasma and serum. The total sperm count was lowest by the end of second week. The higher abnormal spermatozoa percentage and lower motile spermatozoa percentage were observed by the end of second week and during week 3, 4 and 5 after heat exposure. Additionally, there was no significant change in semen volume, testosterone levels and concentrations of ions and total protein in seminal plasma before and after heat exposure. The spermatocytes and spermatids present in the testes at the time of heat exposure resulted in a higher percentage of spermatozoa with low motility. These results suggest that poor semen quality was attributed to the damaged spermatocytes and spermatids during a single 3-day heat exposure in hot summer months.

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Aflatoxin, a secondary metabolite of the mold Aspergillus flavus, has been reported to increase mortality, decrease body weight and induce severe oxidative stress in poultry production. Aflatoxin B1 (AFB1), as the most abundant and toxic form of aflatoxins, is hepatotoxic, hepa-tocarcinogenic, and teratogenic. As an essential nutrient, the trace mineral selenium (Se) is known as antioxidant and catalyst to animal biology. However, there is little report about the effect of Se on function of testes in broilers exposed to AFB1. The present study evaluated the protective effects of Se on attenuating the toxicity of AFB1 in broiler testes. Ninety 1-day-old broiler chickens were randomly allotted to 3 groups and treated as follows: basal diet (control), 100 μg AFB1 per 1 kg diet (AFB1), 100 μg AFB1 and 0.3 mg Se per 1 kg diet (AFB1+Se). Blood and testes were collected at day 42. The broilers fed AFB1 had lower levels in average daily gain (ADG), average final weight (AFW), average daily feed intake (ADFI) and liver organ index compared with control group. In serum, the content of glutamic pyruvic transaminase(GPT) and activity of total superoxide dismutase(T-SOD) were both decreased compared with control (P<0.05). There was an increasing trend in the activities of glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) and γ-glutamyl transferase(γ-GT) in AFB1 group compared with control. In testes, catalase(CAT) activity in AFB1 group was much higher than the other two groups. These results suggested that AFB1 could induce oxidative stress in broiler testes. Se could efficiently protect the testis through partly reducing oxidative stress induced by AFB1 in broiler testes.

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