【目的】一般的に哺乳類卵母細胞の質（発生能）は個体の老化と共に低下するが，老化がどのように卵子の発達に影響しているかは十分には理解されていない。卵母細胞は，周囲の卵丘細胞と密接に関わりながら発達する。一例として，卵母細胞は，卵丘細胞から供給される解糖代謝産物を基質としてエネルギー代謝をしているが，卵丘細胞における解糖活性や解糖系酵素（PFKPやLDHA等）の発現は卵母細胞が分泌する増殖因子（卵シグナル）に依存している。このような卵母細胞と卵丘細胞間の双方向的なコミュニケーションは，卵母細胞が正常に発達するのに必須である。そこで，本研究では，老化個体環境内においてこの双方向コミュニケーションが正常に機能していない可能性について，卵丘細胞におけるPfkpとLdhaの発現を指標として検討した。【方法】C57BL/6N系統の若齢マウス（2ヶ月齢）と加齢マウス（7，10ヶ月齢）より卵丘細胞を採取し，PfkpとLdhaの発現量をqRT-PCRで比較した。さらに，3週齢マウスより採取した卵丘細胞を，2，7，10ヶ月齢の卵母細胞とそれぞれ共培養し，卵丘細胞におけるPfkpとLdhaの発現量をqRT-PCRで比較した。【結果】10ヵ月齢の卵丘細胞におけるPfkpとLdhaの発現量は，それぞれ2ヶ月齢に対して約50％，45％の低下が認められた。卵母細胞との共培養下において，2ヶ月齢の卵母細胞は卵丘細胞におけるPfkpとLdhaの発現をそれぞれ約9.8倍，5.6倍に上昇させたが（p<0.05），7，10ヶ月の卵母細胞では有意な上昇は認められなかった。これらのことから，老齢マウスでは，卵シグナルが減弱しており，老化することにより，卵母細胞と卵丘細胞間のコミュニケーションの機能が低下することが示唆された。

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【目的】コヒーシンは，姉妹染色分体の接着に主要な役割を果たすタンパク質複合体である。最近，そのサブユニットの1つRAD21の減数分裂特異的なパラログとしてRAD21Lが発見された。RAD21Lをノックアウトしたマウスでは，雄は完全な不妊，雌は加齢に伴い不妊となることが報告されている。減数分裂におけるコヒーシンの異常は，先天性疾患や不妊の一因となると考えられるため，その発現や制御機構を調べることは重要である。しかし，機能的な雌雄差が報告されているにも関わらず，既報の減数分裂におけるコヒーシンの発現解析のほとんどが精母細胞を対象としており，卵母細胞における報告は少ない。したがって本研究では，胎児期から新生児期の卵母細胞において，RAD21LおよびRAD21の詳細な発現時期を明らかにすることを目的とした。【方法】実験には胎齢12.5から生後0.5日齢のC57BL6/J系統のマウスを用いた。卵巣の凍結切片を作製し，1％パラホルムアルデヒドで固定した。切片を抗RAD21L抗体あるいは抗RAD21抗体で免疫染色し，両者の発現パターンを比較した。その際，減数分裂期に特有なシナプトネマ複合体の構成分子であるSYCP3に対する抗血清で共免疫染色し，減数分裂期の細胞を識別した。核をDAPIで対比染色した後，サンプルを封入し，共焦点レーザ顕微鏡を用いて観察した。【結果】RAD21L は，シナプトネマ複合体のaxial elementが形成されるレプトテン期以前の減数分裂初期の段階から核内に存在し，シナプトネマ複合体の形成とともにその軸上に集積した。そしてシナプトネマ複合体の形成が完了したパキテン期の中頃から徐々に消失することが明らかとなった。一方RAD21は，体細胞では常に核内に発現していたが，減数分裂期の卵母細胞では発現が確認されなかった。この結果は雄における発現時期と同様であった。それゆえ，RAD21L欠損による雌雄差は，雄におけるRAD21Lの役割を卵母細胞では他の分子が相補できることによるのかもしれない。

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【目的】卵巣内で発育中の卵母細胞を体外に取り出して発育させるには，卵母細胞−顆粒膜細胞間の物理的な結合を維持しなければならない。直径約95 µmのウシ卵母細胞−顆粒膜細胞複合体をエストラジオール17β（E2）およびアンドロステンジオン（A4）を同時添加した培養液中で14日間培養すると，卵母細胞は直径約120 µmへと発育し，高率に成熟能力を獲得した（第105回大会）。本研究では，培養液へのE2およびA4の添加が卵母細胞と顆粒膜細胞の結合に及ぼす影響を，透明帯を貫通する突起（Transzonal projection, TZP）の数を指標に調べた。【方法】直径0.5～0.7 mmのウシ初期胞状卵胞から直径90～100 µmの卵母細胞を含む卵母細胞−顆粒膜細胞複合体を採取した。4%ポリビニルピロリドン，4 mMヒポキサンチン，5%ウシ胎仔血清を添加したαMEM中で，複合体を14日間培養した。培養液にはさらに，100 ng/ml E2およびA4を単独で，または10 ng/ml E2およびA4を同時（E2+A4）に添加した。培養後，卵母細胞をFITC標識ファロイジンで染色後，共焦点レーザー顕微鏡で卵母細胞の横断面像を撮影し，TZPの数を数えた。【結果および考察】E2またはA4添加培養液中では，培養期間を通して卵母細胞は顆粒膜細胞に包まれていた（無添加：28%，E2：68%，A4：52%，E2+A4：75%）。無添加区のTZP数は，培養後，減少したが，E2またはA4添加によって減少は防がれた。特にE2およびE2+A4区では，TZP数は培養前と同等であった（培養前：94.8，E2：98.2，E2+A4：85.0 本／卵母細胞）。また，これらの培養液中で発育した卵母細胞の平均直径は体内で発育した卵母細胞と同等となった。本研究結果から，培養液へのE2およびA4添加は，TZPを維持することにより卵母細胞の裸化を防ぎ，卵母細胞の発育を支持することが示唆された。

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【目的】牛卵子の体外発育培養 (IVG) 中の性ステロイドホルモン産生能と卵子核成熟能の関係を明らかにするため，卵子-卵丘細胞-顆粒層細胞複合体 (OCGC) をアンドロステンジオン (A) 添加培地で培養し，以下の実験を行った。【材料と方法】OCGCを4日間IVGし，形態が正常なOCGC (生存群) と顆粒層細胞が卵子から遊走あるいは卵細胞質が変性しているOCGC (死滅群) のエストロジェン(E)およびプロジェステロン (P) 産生を比較した。次に，生存群のIVG培地に0あるいは0.5 ng/ml FSHおよび0，10あるいは50 ng/ml骨形成タンパク質 (BMP) 4 を添加して6実験群を作製し，さらに8日間培養してE・P産生およびIVG後のOCGC生存率，卵子直径および核成熟能について検討した。【結果】IVG4日目に形態的に正常と判定されたOCGCでは死滅群に比べてE産生が高く，P産生は低かった。生存OCGCのE産生量は，全実験群においてIVG8日目まで増加し，12日目には低下したがP産生はIVG期間を通して増加した。BMP添加に拘らず，FSH添加はE産生を低下させ，P産生を増加させた。50-ng BMP添加によりE・P産生は共に低下したが，10-ng BMP添加ではE産生は低下せず，P産生のみ低下させた。IVG12日後のOCGC生存率はFSH添加によって高くなり，FSH無添加+50-ng BMP添加で低くなった。卵母細胞の直径はFSH添加+50-ng BMP添加の場合に最小となった。IVG卵子の核成熟率はFSH無添加+10-ng BMP添加で低くなったが，他群では70–80%で同等であった。【考察】牛OCGCのIVGでは，生存OCGCは発育中の卵胞に近いEおよびP産生能を示すがIVG期間延長と共に退行卵胞様のE/P比低下が認められた。しかし，培地にFSHと共にBMP-4を10 ng/ml添加することで，OCGCの生存性を高めると共にE/P比を高く維持することが示された。

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【目的】アンチセンスモルフォリノオリゴ (アンチセンスMO)を用いた遺伝子ノックダウン法では，アンチセンスMOとMO導入試薬Endo-Porterを培養液に添加するだけで遺伝子発現を阻害することが期待される。しかし，Endo-Porterを用いたマウス初期胚へのMO導入例は報告されていない。そこで本研究では，マウス初期胚へのMO導入条件を検討した。【方法】2細胞期卵を用いてMO導入条件を検討した。はじめに，培養液に蛍光標識コントロールMO (10 µM)，Endo-Porter (6 µM)，BSA (3 mg/ml，60 µg/ml)を添加し，BSAがMO導入量へ及ぼす影響を検討した。次に，蛍光標識コントロールMO (10 μM)，BSA (60 µg/ml)，Endo-Porter (0，2，6，18 µM)を添加し，Endo-PorterがMO導入量へ及ぼす影響を検討した。蛍光顕微鏡により観察し，蛍光強度から導入量を比較した。【結果】蛍光標識コントロールMOを添加して培養した2細胞期卵は，BSAおよびEndo-Porter添加量に関わらず，培養3時間以内に細胞質において蛍光が検出された。胚盤胞期に到達した培養72時間後では，60 µg/ml BSAを添加して培養した場合，3 mg/ml BSAを添加した場合と比較して細胞質において強い蛍光が検出された。また，Endo-Porter添加量に依存して，細胞質において強い蛍光が検出された。しかし，18 µM Endo-Porterを添加した場合，胚発育が抑制されることが判明した。以上の結果より，60 μg/ml BSAおよび6 µM Endo-Porterを添加して培養した場合，MO導入量が最も多いことが判明した。また，このMO導入条件は初期胚の発育にほとんど影響を与えなかった。現在，ノックアウトマウス初期胚の表現型が既に判明しているOct4について，このMO導入条件に基づいてアンチセンスOct4 MOを導入し，その影響を検討している。

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【目的】受精直後は，ヒストンの修飾やDNAの脱メチル化などエピジェネティックなリプログラミングが起こり，その後の胚発生に影響を与える重要な時期である（Saitou et al., 2012）。しかしながら，受精直後の雌雄ゲノムのリプログラミングの分子機構について十分に理解されていない。これまで，我々は受精後のプロテアソーム活性を一過性(1–9hpi)に阻害すると，その後の着床前発生と胚性ゲノムの活性化（zygotic gene activation, ZGA）の開始が遅延することを明らかにしている（Shin et al., 2010）。本実験では，初期胚における転写制御機構へのUPSの関与について明らかにすることを目的に，プロテアソーム活性阻害剤MG132の処理がRNAPIIの細胞内局在に与える影響について検討した。【方法】過剰排卵処置を行ったICR系マウスを用いてHTF培地にて体外受精を施し，cyclin B1の分解後（媒精1時間後），MG132を5 μMで添加したKSOM培地下で8時間培養した。それらの胚を供試し，PT，TP処理後RNAPII抗体を用いて染色した。【結果および考察】MG132を受精直後の一過性に処理した胚は，RNAPIIの核内へ局在は未処理区と同様に認められたのに対し，クロマチンへの結合の遅延が認められた。また，MG132処理胚では，未処理区と比較してRNAPIIのCTD領域のリン酸化（Ser-2，Ser-5）も遅延していた。これらの結果から，UPSの受精直後のエピジェネティック・リプログラミングへの関与が示唆された

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【目的】受精卵における母性から胚性への移行時期（maternal to zygotic transition，MZT）は，生殖細胞の融合から全能性の細胞である初期胚を生む重要な事象である。この移行時期には，胚性遺伝子の活性化（Zygotic gene activation，ZGA）と呼ばれる胚性ゲノムの転写と同時に，多くの母性mRNAや母性タンパク質の分解が起きている（Schier AF, Science, 2007）。最近，我々は，ZGA制御にユビキチン・プロテアソーム系（ubiquitin-proteasome system, UPS）が関与すること明らかにし（Shin SW et al., JRD, 2010），さらに胚性20Sプロテアソーム会合に関与する新しいシャペロンタンパク質ZPACを同定した（Shin SW et al., Biology Open, 2013）。その研究の中で，受精後24時間の2細胞期胚ではプロテアソーム活性が有意に高くなることを明らかにしている。このことから，UPSは，MZT時期の2細胞期において，何らかの重要な役割を担っていると考えられた。そこで，我々は2細胞期胚におけるUPSが果たす役割を調べるため，2細胞期胚におけるプロテアソーム阻害剤MG132の一過的な処理がその後の胚発生に与える影響について調べた。【方法】体外受精卵において，第一分裂時期から第二分裂時期を同定した。次に，その期間における可逆的プロテアソーム阻害剤MG132の短時間の一過性処理が胚発生に影響を及ぼす時間を調べ，最も感受性の高い時期を決定した。【結果及び考察】その結果，19~25 hpiと30.5~36 hpiにおけるMG132の一過性処理が，2細胞期以降の胚発生を遅延させることが認められた。マウス初期胚のDNAアレイ解析による報告（Hamatani T et al., Dev Cell, 2004）によると，これら時期はZGA IIとZGA IIIと一致していることから，UPSがZGAの転写制御に関与する可能性が示唆された。

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【目的】ブタ卵母細胞や初期胚には，他の哺乳類と比較して多量の脂肪小滴が含まれている。この多量の脂肪小滴の役割は完全には解明されていないが，脂肪小滴の除去によりブタ卵母細胞や初期胚の凍結保存後の生存率は向上する(Nagashima et al., 1994)。近年，ライブセルイメージングによって，細胞を生きたまま長期間観察することが可能となった。またGFP融合蛋白質などを利用したライブセルイメージングでは，目的の分子が特異的に可視化されるため，その動態を経時的に観察することができる。しかし，ブタ卵母細胞に含まれる多量の脂肪小滴は，蛍光の検出を困難とする。本研究では，脂肪小滴を除去したブタ成熟卵母細胞を準備し，活性化刺激後の発生を調べるとともに，この系を用いてライブセルイメージングを試みた。【方法】直径4~6 mmの卵胞から卵核胞期のブタ卵母細胞を採取し，成熟培養した。第二減数分裂中期の卵母細胞を遠心分離した後，脂肪小滴を顕微操作により除去した。その後，電気刺激による活性化とCytochalasin B処理により，単為発生2倍体を作出し，PZM-3培地中で培養した。実験1では，24時間ごとに胚発生を観察し，胚盤胞への発生を調べた。実験2では，脂肪小滴を除去した卵母細胞に，核小体に特異的な蛋白質NPM2 - EGFPとヒストンH2B-mCherryのmRNAを顕微注入し，ライブセルイメージングによって核小体と染色体の動態を共焦点顕微鏡を用いて経時的に観察した。【結果】実験1：脂肪小滴を除去したブタ単為発生2倍体胚の胚盤胞への発生率と，未処理胚の発生率との間に有意差はみられなかった。実験2：NPM2-EGFPとヒストンH2B-mCherryのmRNAを顕微注入し，経時的に観察した結果，脂肪小滴を除去した胚では未処理胚よりも，核小体とクロマチンの局在と動態を明瞭に観察することができた。ブタ胚においても，マウス胚と同等のライブセルイメージングが可能となった。

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【目的】シトクロムcオキシダーゼ（COX）はミトコンドリア内膜に存在し，酸素を消費する電子伝達系の終末酵素である。COXは，酵素の活性中心を構成する3種のミトコンドリアゲノム由来サブユニットと，活性の調節などに関わる10種の核ゲノム由来サブユニットの計13種類で構成されている。我々は，マウスおよびウシ胚において，ミトコンドリアゲノムおよび核ゲノムに由来するCOX mRNAの発現パターンを明らかにしてきた。本研究では，これまで報告例の無いブタ胚におけるCOX mRNAの単一胚レベルでの解析を試みるとともに，COX mRNAの発現とミトコンドリア呼吸機能との関係を調べた。【方法】雌ブタ（デュロック）にPMSGとhCGによる過排卵処理を行った後，人工授精を行い，5日目または6日目に外科的に胚を採取した。得られた桑実胚および胚盤胞の形態を観察し，受精卵呼吸測定装置を用いて酸素消費量を測定後，RT-PCRにより13種のCOX mRNAを単一胚において検出した。本研究ではNucleoSpin RNA XSカラム（タカラバイオ）を用いて単一胚からRNAを抽出し，QuantiTect Whole Transcriptome Kit（QIAGEN）を用いてcDNAを約2,000倍に増幅した。【結果】ミトコンドリアゲノム由来のCOX1, COX2およびCOX3 mRNAは，全ての胚において検出された。一方，核ゲノム由来のCOX mRNAは，桑実胚ではほとんど発現がみられなかったが，初期胚盤胞ではCOX4，COX5a，COX5b，COX6aおよびCOX6b，拡張胚盤胞では全サブユニットのmRNAが検出された。また，良好な形態を示す胚ではCOX mRNAの発現量と酸素消費量がともに多く，COX mRNAの発現と胚の品質との関連が示唆された。本研究では，単一のブタ胚においてCOX全サブユニットmRNAの検出に初めて成功するとともに，「胚の個性」を遺伝子レベルで示すことができた。

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【目的】ブタ初期胞状卵胞から採取した発育途上にある卵母細胞は，体外で発育培養後，成熟培養すると第二減数分裂中期(MII)へと成熟するが，成熟過程において卵丘の膨潤化は起こらない(Cayo-Colcaら，2011)。本研究では，ブタ卵母細胞の発育過程で起こる卵母細胞の成熟能力の獲得および卵丘の膨潤化能力の獲得に及ぼすエストラジオール17β(E₂)の作用を調べた。また，発育・成熟培養後の卵母細胞を発生培養し，発育培養期間のE₂の胚発生への影響を調べた。【方法】直径1.2～1.5 mmのブタ初期胞状卵胞より，発育途上の卵母細胞を含む卵丘細胞−卵母細胞複合体(COCs)を採取し，0～10⁻⁴ MのE₂を添加した体外発育培養液中で5日間発育培養した。その後，成熟培養し，卵母細胞の体外成熟能力および卵丘の膨潤化能力を調べた。さらにMIIに成熟した卵母細胞をPZM-3培養液中で6日間体外培養し，胚発生能力を調べた。【結果】5日間の発育培養によって当初113.6±0.6 µmであった卵母細胞の平均直径は，125.1～129.5 μmに達した。E₂を10⁻⁷，10⁻⁶，10⁻⁵，10⁻⁴ Mの濃度で添加した培養液中で発育させた場合，その後の成熟培養によって，それぞれ，58，47，74，49%の卵母細胞がMIIへと成熟した。また，E₂無添加の培養液中で発育培養したCOCsでは，成熟培養中に卵丘の膨潤化は起こらなかったが，10^–7，10^–6，10^–5，10^–4 Mの濃度でE₂を添加すると，それぞれ，44，48，79，55%のCOCsで，卵丘の膨潤化が起こった。さらに，体外で発育・成熟培養し，MIIに成熟した卵母細胞を発生培養すると，発育培養液へのE₂添加(10⁻⁵ M)，無添加において，それぞれ20%，7%が拡張胚盤胞へと発生した。以上の結果から，ブタ卵母細胞の発育過程において，E₂は卵母細胞の成熟能力および卵丘の膨潤化能力，胚発生能力の獲得を促進すると考えられる。

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【目的】国内では牛海綿状脳症（BSE）の全頭検査が実施されているため，研究に用いるウシ卵巣はBSE検査の結果が出るまで一定時間保存しなければならない。卵巣内の卵子は保存時間の延長に伴って発生能や生存率が低下すると考えられるが，詳細は明らかになっていない。そこで本研究では，長時間保存した卵巣から回収した卵子におけるミトコンドリア呼吸機能を調べ，卵巣の保存時間が卵子の品質に及ぼす影響を詳細に解析した。【方法】食肉処理場で採取したウシ卵巣を20度の生理食塩水中で，6時間，30時間，54時間，78時間保存し，卵丘細胞−卵子複合体（COC）を採取した。卵丘細胞が2層以上付着したCOCを用いて成熟培養および体外受精を行い，体外受精胚を作製した。卵子のミトコンドリア呼吸機能を解析するために，COCおよび卵子の酸素消費量は受精卵呼吸測定装置 (HV-405)，ATP含量はBacTiter-Glo microbial Cell Viability Assay kitを用いてそれぞれ測定した。【結果】体外培養による卵子の成熟率（MII期）は，6時間および30時間保存ではそれぞれ40%および67%であったが，54時間および78時間保存ではそれぞれ15％および11％に低下した。一方，胚発生能は6時間保存において2細胞期胚および胚盤胞の発生率はそれぞれ81％および23％であったが，30時間保存ではそれぞれ39％および3％と急激に低下した。さらに，54時間および78時間保存した卵巣から採取した卵子からは全く体外受精卵は得られなかった。各保存時間のCOCおよび卵子の酸素消費量は保存時間の延長に伴い徐々に減少した。また，卵子のATP含量は6時間保存卵子と比べて30時間および54時間保存した卵子において急激に減少し，78時間保存卵子ではATPはほとんど検出できなかった。以上の結果から，卵子のミトコンドリア機能は卵巣の保存時間の延長に伴い急激に低下し，卵子の品質低下の一因になっている可能性が示された。

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The improvement of in-vitro growth culture (IVG) system for bovine oocytes derived from early antral follicles (EAFs, 0.5 to 1 mm) is required for production and research purposes. In experiment 1, growing oocytes (95 μm in diameter) collected from EAFs were submitted to 12-day IVG. After IVG, oocytes with normal appearance were submitted to 0-, 10- or 20-h pre-IVM with 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) followed by 22-h IVM (0-, 10- and 20-h pre-IVM group, respectively). Diameter and nuclear maturation (M II) rate of IVG oocytes were examined after IVM. Mean diameters were similar in all group (about 115 μm), but they were smaller than that of in-vivo grown oocytes derived from antral follicles (2 to 8 mm). M II rate in 10-h pre-IVM group (90%) was higher than those in 0-h (55%) and 20-h pre-IVM groups (73%), and similar to that of in-vivo grown oocytes (94%). In experiment 2, IVG oocytes in 0-, 10- and 20-h pre-IVM groups were submitted to IVF and their developments were examined. Cleavage (80%) and blastocyst rates (41%) in 10-h pre-IVM group were higher than those in 0-h (46 and 13%, respectively) and 20-h pre-IVM groups (63 and 26%, respectively), and similar to that of in-vivo grown oocytes (83 and 42%, respectively). To clarify the cause of difference in maturational and developmental competences, mitochondrial activity of IVG oocytes was examined by JC-1 staining after 0-, 10- and 20-h pre-IVM. Mitochondrial activity of IVG oocytes after 10-h pre-IVM was higher than those after 0- and 20-h pre-IVM. In conclusion, 10-h pre-IVM culture with IBMX improves maturational and developmental competences of bovine IVG oocytes, and it seems to be related to the activation of mitochondria.

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【目的】哺乳動物の初期胚や始原生殖細胞（PGC）では，ヒストン修飾やゲノムワイドなDNA脱メチル化に起因してエピジェネティックリプログラミングが起きる（Saitou et al., 2012）。これまで我々は，初期胚と生殖細胞で特異的に発現する新規遺伝子として同定したGonad-specific expression gene（GSE）（Mizuno et al., 2006）が，受精卵の雄性前核で起こる能動的DNA脱メチル化に関与することを明らかにしている（Hatanaka et al., 2013）。しかし，PGC形成時のDNA脱メチル化でGSEタンパク質が果たす役割は明らかではない。そこで本研究では，GSEがPGCのDNA脱メチル化機構へ関与するかを明らかにするために，PGC形成過程でのGSEの発現プロファイルを検討した。【方法】マウスのPGC形成過程であるE7.5からE11.5の胚を供試してウェスタンブロット解析を雌雄でそれぞれ行った。次に，PGCのDNA脱メチル化時期でのGSEタンパク質の細胞内局在を明らかにするために，E9.5からE12.5の生殖腺の細胞を解離し，透過処理により細胞内の遊離タンパク質を除去後，免疫細胞化学染色を行った。また，5mCから5hmCへ変換が行われている細胞でGSEが発現しているか，及びPGCの能動的DNA脱メチル化に関与する酵素と共局在するかを明らかにするために免疫細胞化学染色により検討を行った。【結果】雄では，GSEはE7.5と比較してE9.5からE11.5にかけて発現量が有意に増加し，雌ではE7.5と比較してE10.5で発現量が有意に増加した。さらに，ほぼ全てのPGCでGSEが発現し，クロマチンに結合していることが認められた。また，5mCから5hmCの変換を示唆する細胞でGSEは発現し，PGCの能動的DNA脱メチル化に関与している酵素ともGSEは共局在した。以上の結果から，GSEはPGC形成過程におけるDNA脱メチル化に関与していることが示唆された。

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This study was conducted to establish the method for preserving chicken primordial germ cells (PGCs) that enables long-term storage in liquid nitrogen for preservation of species. The purpose of this study is to clarify the effects of fetal bovine serum (FBS) or chicken serum (CS) treatment on viability of cryopreserved PGCs in Korean Native Chicken (Ogye). PGCs separated from a germinal gonad of an early embryo of 5.5–6 day (stage 28) are suspended in a freezing medium containing a freezing and protecting agents (e.g. DMSO or ethylene glycol). After the tube was preserved in liquid nitrogen for 1 month at least, the viability of PGCs after freeze-thaw via 0, 5, 10 and 15% EG plus FBS treatment were 22.36, 40.12, 42.96, 64.36 and 55.36%, respectively. Viability assays were conducted on both the frozen group (~20ml cell suspension), and on the control group (~20mL cell suspensions of 100 PGCs in modified buffer). 0.4% Trypan blue solution (10 mL) was then added to each drop of PGCs suspension and the mixture incubated for 2 min at room temperature. These values of the 0, 5, 10 and 15% DMSO plus FBS treatment were 21.6, 30.36, 36.42, 50.39 and 48.36%, respectively. The viability of PGCs after freeze-thawing was significantly higher for 10% EG plus FBS treatment than for 10% EG+FCS treatment (p<0.05) (64.36% vs 50.66%). This study established a method for preserving chicken PGC that enables systematic storage and labeling of cryopreserved PGC in liquid N at a germplasm repository and ease of entry into a database. In the future, the importance for this new technology is that poultry lines can be conserved while work is being conducted on improving the production of germline chimeras.

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【目的】マウスにおける最初の細胞分化は桑実期に開始する。私達は，桑実期に発現量が増加するホメオタンパク質EGAM1Nを発見した（Saito et al., Biol. Reprod., 2010）。EGAM1N強制発現はマウスES細胞の未分化状態を安定化することが示されている。そこで本研究では，EGAM1N強制発現がマウスES細胞の細胞分化に及ぼす影響を検討した。【方法】EGAM1N強制発現マウスES細胞株を樹立し，未分化状態維持(+LIF)培養，および4日間のLIF非添加(-LIF)分化誘導，1/10量のLIF (1ng/ml)とレチノイン酸(1 µM)を添加した（+1/10 LIF+RA ）分化誘導を行った。なお，レチノイン酸添加による過剰なアポトーシスを抑制するために，1/10量のLIFを添加した。回収したRNAからcDNAを合成し，T (中胚葉誘導マスター転写因子)，Cdx2 (栄養外胚葉誘導マスター転写因子)，Gata6 (原始内胚葉誘導マスター転写因子)，およびAfp （原始内胚葉マーカー）の発現量を定量した。また，未分化状態維持に関与する転写因子のタンパク質発現量を検討した。【結果】-LIF分化誘導したEGAM1N強制発現株におけるTおよびCdx2の発現量は，有意(P < 0.01)に増加した。また，+1/10 LIF+RA分化誘導したEGAM1N強制発現株では，Cdx2，Gata6，およびAfpの発現が有意(P < 0.01)に減少した。また，コントロールと比較して，-LIF分化誘導においてNANOGタンパク質発現量が減少し，+1/10 LIF+RA分化誘導においては逆にNANOGおよびOCT4発現量が大きく増加した。以上の結果より，EGAM1N強制発現は-LIF分化誘導においてはTおよびCdx2の活性化を介して中胚葉，栄養外胚葉への分化を促進し，+1/10 LIF+RA分化誘導においてはOCT4およびNANOG発現量を増加させることを介して分化を抑制した可能性が考えられる。

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【目的】マウスの胚発生において，線維芽細胞増殖因子4（FGF4）は胎盤形成に関与する，重要な細胞増殖因子である。しかし，主要な産業動物であるブタのFGF4構造遺伝子塩基配列（GenBank XM_003122418）はドラフトシークエンスであるために誤りが存在する可能性が否定できない。そこで本研究では，品種が明らかなブタに由来するFGF4構造遺伝子の全塩基配列を決定した。また，大腸菌によりブタFGF4タンパク質を生産し，細胞増殖促進活性を検討した。【材料および方法】ランドレース種（2頭），デュロック種（4頭）の白血球からゲノムDNAを調製し，FGF4構造遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した配列情報に基づき，N末端側にHisタグを付加し，かつ，分泌シグナルペプチドを除去した成熟型ブタFGF4（HispFGF4）を大腸菌において発現させ，ヘパリンカラムクロマトグラフィーにより精製した。次に，HispFGF4によるブタ胎仔線維芽細胞株PEF SV40細胞の増殖促進活性を検討した。さらに，FGF受容体活性の阻害剤（PD173074）を用いて，HispFGF4の作用経路を検討した。【結果および考察】ランドレース種，デュロック種に由来するFGF4構造遺伝子の塩基配列と，GenBank登録配列（XM_003122418）を比較したところ，サイレント変異は認められたものの，アミノ酸配列は完全に一致した。大腸菌により，推定した一次構造に基づいたHispFGF4を発現することができた。ヘパリンカラムクロマトグラフィーにより分画すると，0.92 M NaClにより溶出された。精製したHispFGF4の細胞増殖促進活性を検討したところ，PEF SV40細胞の増殖が有意（P<0.05）に促進された。PD173074を添加すると，HispFGF4による細胞増殖は有意（P<0.01）に抑制された。以上の結果より，生物活性を有するHispFGF4を生産することができたことが示された。

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【目的】第一減数分裂前期には，三層の軸構造からなるシナプトネマ複合体が形成され，その上で相同染色体の対合や組換えが進行する。減数分裂型コヒーシンサブユニットであるRAD21LやREC8は，シナプトネマ複合体の軸構造 (axial element: AE) の形成に必須であることが示されている。しかし，どのようにこの両者が相同染色体の対合・組換えやシナプトネマ複合体の形成にかかわるか，その詳細なメカニズムや役割分担については不明である。そこで本研究では，これらのことを明らかにするために，第一減数分裂前期におけるRAD21LやREC8のシナプトネマ複合体上のより詳細な局在位置の解析を試みた。【方法】C57BL/6系統マウスの精巣を採取し，コラゲナーゼ処理などにより，細胞を分散させた。精巣由来細胞を2％パラホルムアルデヒドで固定後，RAD21LやREC8に対する抗体と，AEの構成分子であるSYCP3に対する抗体，あるいはDNA修復関連タンパク質であるRAD51やMSH4に対する抗体により，共免疫染色した。サンプルを高解像度の次世代光学顕微鏡システム (3D-SIM) で観察した。【結果】3D-SIMを用いて，対合状態の2本のAEをSYCP3のシグナルとして観察できた。RAD21LやREC8はAE上に非連続的に存在した。第一減数分裂前期のパキテン期において，2本のAE上のSYCP3間あるいは RAD21L間の距離の測定や局在を比較解析したところ，RAD21LはSYCP3と部分的に共局在するが，2本の AEのより内側に存在することが分かった。また，2本のAE間を架橋するような RAD21Lのシグナルも観察されたことから，RAD21Lは，AEの内側で相同染色体から伸びるクロマチンループを接着することにより，対合に関与すると考えられる。さらに，RAD21LやREC8，MSH4やRAD51 の二重免疫染色の解析から得られた結果について紹介し，組換えにおけるRAD21LやREC8の役割について検討する。

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【目的】妊娠の成立には,子宮内膜の成熟による胞胚受容能の獲得が重要である。内膜腺細胞は，この成熟過程において着床を促進する白血病抑制因子（LIF）とプロスタグランジン（PG）E2を産生する。これらの産生には，cAMPシグナル経路を介したプロテインキナーゼA（PKA）の活性化が関与するが，PKAとは異なるcAMPシグナル仲介因子のExchange protein directly activated by cAMP (EPAC)の役割については不明である。本研究では，ヒト子宮内膜腺上皮細胞株（EM1）を用い，腺に高発現しているEPACサブタイプ2（EPAC2）と以前，我々がEPAC2により発現制御を受けることを示唆したカルレティキュリン（CRT）の役割を調べた。【方法】EM1におけるEPAC2の発現をsiRNAにより抑制した後，CRTの発現を調べた。EPAC2またはCRTの発現を抑制した後，フォルスコリン，PKAまたはEPAC選択的アゴニストを処置し, LIFとPGE2産生の調節因子であるシクロオキシゲナーゼ（COX）2の発現とPGE2産生を調べた。さらに，EPAC2とCRTの発現と細胞老化との関係について老化マーカーであるSA-ß-Gal活性を指標に調べた。【結果】CRTの発現はEPAC2発現抑制により減少した。フォルスコリンまたはPKAアゴニストによりLIF，COX2の発現及びPGE2産生は上昇したが，EPACアゴニストによる影響はなかった。一方，EPAC2またはCRTの発現を抑制すると，LIFとCOX2の発現上昇とPGE2産生が顕著に抑制された。また，EPAC2またはCRTの発現抑制によりSA-ß-Galの活性が上昇した。【考察】内膜腺細胞においてcAMPによるLIF，COX2発現およびPGE2産生にはPKAを介したシグナル伝達が重要であり，EPAC2によるCRTの発現がこの腺機能の調節維持に関与することが示唆された。

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【目的】精子の凍結保存に代わる保存方法として凍結乾燥が注目されているが，満足のいく発生成績が報告されている動物種は限られている。凍結乾燥を適切な条件下で行うと溶液は多孔質のスポンジ様構造 (凍結乾燥ケーキ) を形成する。しかし，溶液の最大凍結濃縮相ガラス転移温度 (Tg’) よりも高い温度で乾燥を行うと，コラプスと呼ばれる凍結乾燥ケーキの構造崩壊が生じやすい。本研究では，凍結乾燥ケーキに生じたコラプスが凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼす影響について調べた。【方法と結果】示差走査熱量計を用いて測定した，10 mM Tris-HCl，50 mM EGTA，0.5 M トレハロースからなる凍結乾燥バッファーのTg’は，−28℃だった。次に，同バッファーに懸濁した凍結融解ウシ精子を予備凍結したのち，−30℃または0℃に制御した凍結乾燥機中で6時間の乾燥を行った。乾燥温度が−30℃の凍結乾燥ケーキは完全な形状を保っていた一方，Tg’より高い0℃で乾燥した場合にはコラプスが生じていた。続いて，得られた凍結乾燥ケーキの乾燥程度を調べるために含水率およびガラス転移温度 (Tg) の測定を行った。0℃で乾燥した場合の含水率は−30℃の場合と比べて約5倍 (3.6 vs. 0.7%, P < 0.05) だったが，Tgの測定によりいずれも十分な乾燥状態にあることが確認できた。−20℃で一晩保存した凍結乾燥精子を顕微授精 (ICSI) に供したところ，卵割率に差は認められなかった。しかし，胚盤胞発生率については0℃で乾燥した場合の値 (1%：卵割ベース) が−30℃で乾燥したときの値 (14%) よりも有意 (P < 0.05) に低下した。現在さらに，凍結乾燥精子の微細構造やDNA損傷に対する影響を調べている。以上，凍結乾燥ケーキのコラプスはウシ精子に対する乾燥ストレスを増加させ，ICSI後の胚盤胞発生能を低下させることが明らかとなった。

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【目的】マウス生殖工学技術は，遺伝子改変マウスの効率的な作製を可能にする有用な技術である。これまでに私達は，高い生存性および受精能を維持できるマウス未受精卵子の凍結保存技術を開発した。凍結未受精卵子は，融解後，直ちに体外受精に使用できることが利点である。そのため本技術は，突然死した遺伝子改変マウスの雄個体より採取した精子を用いた緊急の体外受精に応用できる可能性がある。そこで本研究では，安楽死させた雄マウスから経時的に精子を採取し，死亡後の経過時間が精子の生存性および受精能に及ぼす影響を検討した。【方法】過剰排卵処理をしたC57BL/6雌マウスより卵子を採取し，卵丘細胞除去後，簡易ガラス化法（Nakao et al. 1997）により凍結保存した。精子は，C57BL/6雄マウスを安楽死後，各時間（0h, 6h, 12h, 18hあるいは24h）に精巣上体尾部から採取した。精子の生存率は，蛍光染色（LIVE/DEAD Sperm Viability Kit）により評価した。また，精子の運動率は，精子運動性解析装置IVOS（Hamilton Thorne, Inc.）を用いて評価した。続いて，体外受精により，各時間における精子の受精能を評価した。すなわち，採取した精子を，0.75mMメチル-b-シクロデキストリンを含有したTYH中で培養後，加温した凍結卵子を含むHTF（還元型グルタチオン含有）に導入することにより媒精を行なった。なお，翌日，二細胞期胚へと発生したものを受精卵とし，受精率を算出した。【結果および考察】安楽死後の個体より採取した精子の生存率は，死亡から6時間以降で顕著に低下した。一方，運動精子率および体外受精は，死亡経過時間にともなって，漸次低下することが認められた。以上の結果より，凍結卵子を用いることで，突然死した雄マウス由来精子から，受精卵を作製できることが明らかになった。また，死亡個体より採取した精子の受精能は，死亡から12時間以降において顕著に低下することが示された。

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【目的】ビタミンC（VC）は様々なエピジェネティック調節によってiPS細胞の樹立効率を大きく改善することが報告されている。一方，VCの体細胞クローン胚への影響についてはブタの産仔率を改善すること以外詳細には検討されていない。本研究では，マウス体細胞クローン胚の発生に及ぼすVCの影響を検討した。【方法】B6D2F1マウスの除核未受精卵と卵丘細胞から作出した再構築胚を0–50 µg/ml VCで活性化開始（0時）から24時間処理を行い，胚盤胞形成率及びその細胞数から至適濃度を定めた。次に，再構築胚を0–8時，0–24時あるいは8–15時に至適濃度のVCで処理し，各処理区における胚盤胞形成率，そして前核期におけるアセチル化H3K9レベルを免疫蛍光染色法で検討した。さらにVC処理による産仔率への影響を検討した。【結果】10，25，50 µg/ml VCで24時間処理を行った結果，胚盤胞形成率はいずれの濃度においても7割強と無処理より有意に上昇した。また胚盤胞の総細胞数及びICM細胞数は無処理より有意に増加し，10 µg/mlではTE細胞数も有意に増加したため，以降この濃度で用いた。次に VCの処理時期について検討した。0–24時，8–15時の処理では無処理と比較し胚盤胞形成率が有意に上昇した(69%, 71% vs 36%，P<0.01)が，0–8時の処理では52%と有意差はなかった。ところが，前核期におけるアセチル化H3K9レベルは0–8時のVC処理によってTSA処理(50 nM，0–8時;胚盤胞形成率77%)と同程度まで上昇した。これらのことから，発生のごく初期におけるアセチル化H3K9レベルはクローン胚の発生に影響しない可能性が示唆された。またクローン産仔は無処理胚からは得られなかったが，VC処理(24時間)胚から2%，TSA処理胚から3%の割合で得られた。以上の結果から，VCはTSAとは異なる作用機構によってマウスクローン胚の発生を促進することが示唆された。

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【目的】XistはX染色体不活性化の開始に必須の遺伝子である。マウス初期胚において，Xistは精子由来X染色体でのみ発現を示す(インプリント型発現)。以前我々は，核移植技術を用いて，卵成長の最終期にXistの発現を抑制するインプリントが確立されることを報告した。Xistのインプリントは，胚盤胞期になると内細胞塊で一旦消失し，胚体組織においてXistはランダム型発現を示すようになる。一方，栄養外胚葉(TE)から分化した胚体外組織においては，Xistはインプリント型発現を示す。これは卵子由来のXistのインプリントがそのままTEに引き継がれるためだと考えられているが，証明はされていない。そこで，本研究では着床後のマウス胚における卵子由来のXistのインプリントの消長を検証した。【方法】卵子由来のXistのインプリントを持たない細胞を除核卵子に核移植すると， Xistは異所的発現を示すという性質を利用して解析を行った。着床後のマウス胚の細胞として，ES細胞，栄養膜幹(TS)細胞，および胎齢6.5日胚の胚体外組織細胞を用いて核移植胚を作製した。核移植胚は培養72時間目(morula期)および96時間目(blastocyst期)まで発生させ，RNA-FISHあるいはマイクロアレイによりXistの発現を解析した。【結果】ES細胞核移植胚において，Xistは異所的発現を示した。ES細胞においてXistのインプリントは消失することが知られており，この結果はこれまでの報告と一致した。一方で，TS細胞および胚体外組織細胞の核移植胚においてもXistの異所的発現が見られ，卵子由来のXistのインプリントは胚体外組織においても消失することが明らかになった。以上の結果は，卵子由来のXistのインプリントは着床期に完全に消失し，胚体および胚体外組織のいずれにおいても新たなXistの発現制御機構が確立されることを示唆する。

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【目的】現在マウスゲノム上で同定されている父性メチル化インプリント領域は1番，7番，9番，そして12番染色体の4箇所のみである。本研究では，父性ゲノムを用いない二母性マウス胚と野生型(WT)胚を用いて新規父性メチル化インプリント遺伝子の有無について検証した。二母性胚では7番および12番染色体上の2領域以外の父性メチル化領域はデフォルトの状態にあるため，それ以外の父性メチル化インプリント遺伝子については母性ゲノム様の発現パターンを示すと考えられる。このことから，既知4領域以外に父性メチル化領域が存在していれば，WT胚と比較して二母性胚では発現差がみられると考えられる。そこで，二母性胚とWT胚でマイクロアレイ解析を行い，発現差がみられた遺伝子について多型解析を実施し，発現アリルを決定した。【方法】初めに，胎齢12.5日における，7番染色体のみ遺伝子発現を補正したng^⊿7ch/fg，12番染色体のみ発現を補正したng^⊿12ch/fg，そして双方において遺伝子発現を補正したng^⊿Double/fgの各二母性胚とWT胚の遺伝子発現をマイクロアレイによって解析し，2倍以上の発現差がある遺伝子をピックアップした。次に，それらについて，JF/Ms(J)およびC57BL/6N(B)系統間で多型を調べ，J×BおよびB×J間のF1胎齢12.5日胚の発現遺伝子について多型解析を実施し，発現アリルを決定した。【結果および考察】全タイプの二母性胚とWT胚において遺伝子発現差を比較し，発現差があり，かつ，発現の増加および低下の傾向が同じ遺伝子を調べた結果，35遺伝子が確認された。これらの遺伝子のうち多型が検出された33遺伝子について発現アリル調べた結果，全て両アリル発現を示すことが明らかとなった。そのため，全身性発現を示す父性メチル化インプリント遺伝子は既知4領域のみであることが示唆された。今後，標的組織を絞って組織特異的な発現を比較していく必要があると考えられる。

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【目的】人工多能性幹細胞（iPS細胞）にはリプログラミングレベルが不完全なものがあることが知られている。iPS細胞の質を計る基準として，外来遺伝子の発現に用いるレトロウイルスプロモーターのサイレンシング（不活性化）がある。一般に良いiPS細胞はLTRプロモーターがリプログラミングの過程において高い割合でサイレンシングされている。本実験はiPS細胞に誘導した際に生じるサイレンシングの状態を，細胞破壊せず簡便に検出できる実験系の樹立を目的とした。【方法】HPV由来のE6/E7遺伝子を用いて不死化したマウス胎児由来線維芽細胞（MEF E6/E7）を用いた。MEF E6/E7にカイアシ類由来の分泌型ルシフェラーゼ（MetLuc）・緑色蛍光たん白質（copGFP）・薬剤耐性たん白質（Neo^r）を自己消化性ペプチド（P2A，T2A）で連結したレポーターカセット（MetLuc-copGFP-Neo^r）をレトロウイルスにて導入した。さらに，この細胞をiPS細胞へ誘導し，その前後でのレポーターカセットの発現量を様々な実験で比較した。またiPS細胞の指標となる未分化マーカーの発現を免疫蛍光染色にて検出した。【結果】MetLuc-copGFP-Neo^rカセットを導入したマウス線維芽細胞は高いルシフェラーゼ活性，蛍光たん白質の発現，薬剤耐性を示し高率での遺伝子導入を確認した。その後に山中4因子を導入し4株のiPS細胞株を得た。得られた株は免疫蛍光染色によってOct4，Nanog，SSEA-1陽性を示した。樹立したiPS細胞株では分泌型ルシフェラーゼの値が，iPS化する以前の線維芽細胞と比較して，1/100程度に大きく低下していた。Real-Time PCRならびにウェスタンブロットを用いてmRNA及びたん白質レベルで同様の結果が得られることを確認した。以上の結果から，本実験系はiPS細胞化の過程で生じるLTRプロモーターのサイレンシング状態を細胞破壊を伴わずに，培養上清から簡便に検出できることを示すものである。

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【目的】抗SPACA1抗体での処理により，ヒト精子は透明帯除去ハムスター卵子への侵入能力が抑制されると報告されている。しかし，ヒト精子におけるSPACA1の機能の詳細は不明である。本研究では，ヒト精子の受精能力・正常な胚発生を導く能力とSPACA1との関係を明らかにするために，射出精子先体でのSPACA1の検出パターンと，体外受精成績の相関性を検討した。 【方法】インフォームドコンセントの得られた一般的な体外受精（C-IVF）の施行患者を対象とした。連続密度勾配法とSwim up 法を併用して回収した運動精子を性状検査の後に，37℃で3時間前培養して体外受精に供した。また余剰精子を，抗SPACA1抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）に供した。媒精19時間目に受精の有無を確認し，5日目に良好胚盤胞発生率を調べた。なお，体外受精成績については，GnRH法で卵巣刺激を施行した40歳未満の患者で，回収胚が5個以上の症例を対象とした。 【結果】精子先体におけるIIFでは，A）先体主部（主部）と赤道節の両方で強く検出される精子，B）赤道節では強く，主部では弱く検出される精子，およびC）赤道節では強く検出されるが，主部では検出されない精子の3種類のパターンが観察された。また各パターンを示す精子の割合には個体差が認められたが，各個体での割合に前培養前後で有意な変化は見られなかった。他方，体外受精の受精率および良好胚盤胞発生率は，それぞれ0～88.9％，0～26.3％と患者間で大きく変動したが，これらの値と精子奇形率との間に有意な相関は認められなかった。また受精率はSPACA1のいずれの染色パターンの割合とも有意な相関を示さなかったが，良好胚盤胞発生率はパターンAを示す精子の割合と有意な正の相関を示した(R²=0.860 P=0.0003)。 【考察】ヒト精子先体でのSPACA1の分布状態には個体差が存在し，その分布状態が精子の正常な胚発生を導く能力に関与すると推察された。

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【目的】宮崎大学フロンティア科学実験総合センターではマウス(Mus属)やラット(Rattus属)とは異なる分類群であるApodemus属の1種，ヨーロッパモリネズミ(Apodemus sylvaticus)を飼育維持している。本種は高脂血症を自然発症し，さらには高コレステロール飼料給与によりアテローム性動脈硬化が誘導される個体や，Ⅱ型糖尿病様の病態を呈する個体が存在することから新たな病態モデル動物候補として特性評価研究を進めている。本研究では自然交配により維持している本種のコロニーを効率的に管理するために必要な，卵子および胚の凍結保存法開発に向けた知見の集積を目的として，卵子および2細胞期胚の水と耐凍剤の膜透過性を評価することによって凍結保存の可能性を検討した。【材料・方法】排卵誘起処理後M-II期卵子と，雄との自然交配を経て得た2細胞期胚を回収し，15℃および25℃でスクロースおよび5種類の耐凍剤（グリセロール，DMSO，エチレングリコール，プロピレングリコール，アセトアミド）添加PB1液に曝露し，経時的な相対体積変化から水透過性（μm/min/atm:Lp）および耐凍剤透過性(×10^–3cm/min:Ps）を算出した。【結果・考察】25℃での卵子および2細胞期胚のLpは，15℃の値よりも2倍以上高かった。　また卵子および2細胞期胚のPsは，グリセロールで0.01～0.05と非常に低く，その他の耐凍剤で0.23～2.26を示し，また15℃よりも25℃で高い値を示した。このことから水と耐凍剤は温度依存的に膜を透過していると考えられた。これらの結果は，マウスで報告されている値と非常に近似しているため，本種における卵子および2細胞期胚の凍結保存法はマウスと同様の手法が適用できる可能性がある。今後はさらに発生の進んだ胚のLpおよびPsを測定するとともに，これらの凍結保存を試みたい。

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【目的】琵琶湖には多くの貴重な固有種が生息しているが，近年それら固有種の個体数が激減している。琵琶湖では，ノニルフェノール（NP）やビスフェノールA（BPA）などの内分泌かく乱物質が検出されており，魚類繁殖性への影響が懸念される。本研究では，琵琶湖に生息する固有魚類の細胞を用い，それら化学物質が固有種に与える影響を検出，解析することが可能な実験系の確立を目的とした。【方法】ホンモロコより精巣を摘出し，細切・酵素処理後，種々の成長因子を含む培養液中（28℃）で培養し，細胞の形態に変化が見られなくなるまで継代を行い，細胞株を樹立した。次に，その細胞へ，ルシフェラーゼ遺伝子の上流にMMTVプロモーター（アンドロジェンおよびプロジェステロンレセプター応答エレメントを持つ）を組込んだベクターを安定導入した。反応性の良好な細胞株を選抜（RMT2-MMTV-Luc#7）し，雄性ホルモン（11-ケトテストステロン：11-KT，テストステロン：T，メトリボロン：R1881），黄体ホルモン（プロジェステロン：P4，17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン：DHP）およびNP，BPAに対する反応性を，48時間暴露後におけるルシフェラーゼ活性により測定した。【結果・考察】遺伝子解析および免疫染色の結果，樹立細胞株がSertoli細胞由来であることが確認された。本細胞株は生理的な濃度下において，魚類特異的な11-KTおよびDHPに反応性を示す一方，TやP4には反応性を示さず，魚類体内でのSertoli細胞と類似したホルモン応答性を示した。また，NPおよびBPAの抗雄性および抗黄体ホルモン作用を調べた結果，NPが抗雄性ホルモン作用を示す事が明らかとなった。魚類ではNPの生物濃縮率が高いことから，体内において，NPがSertoli細胞に直接影響を及ぼしている可能性が示唆された。本研究により，特定魚類におけるホルモンおよび内分泌かく乱物質の作用を，細胞レベルで検出，解析が可能な実験系が確立できたと考えられる。

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【目的】アンドロジェンは一般的に精巣で生成され，前立腺の機能と形態は活性の高いDihydrotestosterone(DHT)により維持されている。マストミスは雌でも発達した前立腺を有する。しかしマストミス雌前立腺は血中アンドロジェン濃度が低いにも関わらず前立腺のDHT濃度は雄と同程度である。近年前立腺内でのアンドロジェン合成の増加が去勢抵抗性前立腺癌の進行要因の一つと示唆されている。従って雌マストミスは前立腺癌モデルとして有用であると考えられる。アンドロジェン合成経路には齧歯類で見られる⊿4経路とヒトなどで見られる⊿5経路が存在する。本研究ではマストミスにおけるアンドロジェン合成経路を明らかにするため以下の実験を行った。【材料と方法】マストミス精巣ホモジネートに¹³C標識コレステロール基質を添加し産生された¹³C-プロジェステロン（P4），¹³C-アンドロステンジオン（A4），¹³C- Dehydroepiandrosterone(DHEA)をLC-MS/MSで測定した。【結果】¹³C-コレステロールを基質とする¹³C-P4，¹³C-A4の産生が認められた一方で¹³C- DHEAはほとんど産生されていなかった。【考察】⊿4経路はコレステロールからP5に変換された後，P4に変換され，その後テストステロンが合成される。⊿5経路はコレステロールからプレグネノロンに変換された後DHEAに変換され，その後テストステロンが合成される。マストミスの精巣において¹³C-P4，¹³C-A4の産生は認められたものの¹³C-DHEAの産生はほとんど認められなかったことから，マストミスにおけるアンドロジェン合成経路はDHEAを介していない⊿4経路であることが示唆された。

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【目的】G-protein-coupled receptor 120 (GPR120) は血中遊離脂肪酸をリガンドとするGタンパク共役型受容体である。これまでに当研究室では，マウス精子の頭部にGPR120 mRNAが発現していることを明らかにしている。本研究では，精子における長鎖脂肪酸受容体の局在ならびにその役割を解明する目的で実験を行った。【方法】実験にはICRマウスの精巣上体尾部より採取した精子を用いた。RT-PCR法により長鎖脂肪酸受容体GPR40とGPR120 のmRNA発現，免疫組織化学法により，GPR120タンパク質の局在を観察した。さらに，長鎖脂肪酸に暴露した精子をライブイメージングシステムでモニタリングし，鞭毛の打頻度等を指標にして運動性を調べた。 【結果】RT-PCRの結果，精子においてGPR120 mRNA発現は観察されたが，GPR40 mRNA発現は観察されなかった。蛍光染色の結果，GPR120タンパク質は精子頭部と中片部で観察された。精子を0.1mMの長鎖脂肪酸に20分間暴露した結果，飽和脂肪酸であるパルミチン酸に暴露した時，鞭毛の打頻度が減少した。以上より，マウス精子においてGPR120 mRNAは頭部に存在し，タンパク質は頭部と中片部に局在することが明らかとなった。また，長鎖脂肪酸は精巣上体尾部に貯留する精子の運動性に影響を与えることが示された。現在，長鎖脂肪酸受容体のアゴニストGW9508とアンタゴニストGW1100を用いて実験を行っている。

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Background: P450scc, 3βHSD, P450c17 and P450arom are responsible for steroid biosynthesis, which are mainly produced in Leydig cells in testes. Testes are also the source of many cell growth factors, including inhibins and activins. In mammalian species, apart from their action on FSH secretion, inhibins and activins have been shown to exert paracrine/autocrine effects within the gonads. The purpose of this study was to investigate the cellular immunolocalization of P450scc, 3βHSD, P450c17, P450arom and inhibin/activin subunits in the adult male African elephant testis. Materials and Methods: Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe testicular tissues of the African elephant. The sections of testis were immunostained using polyclonal antisera raised against bovine adrenal P450scc, human placental 3βHSD, porcine testicular P450c17, human placental P450arom, porcine inhibin α, porcine inhibin/activin β_A and β_B. Results: Histologically, all types of spermatogenic cells including mature-phase spermatozoa in seminiferous tubules were found in African elephant testis. P450scc, 3βHSD, P450c17 and P450arom were all detected in cytoplasm of Leydig cells. In addition, positive immunostaining for inhibin a and inhibin/activin (β_A and β_B) subunits was also observed in Sertoli and Leydig cells in the African elephant testis. Conclusions: These results suggest that Leydig cells of adult African elephant testis have the ability to synthesize progestin, androgen, estrogen, and Sertoli and Leydig cells are the major source of inhibin secretion in male African elephants.

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【目的】げっ歯類のオスでは，メスとは異なり，高濃度のエストロジェンを投与しても黄体形成ホルモン (LH)サージは誘起されない。これは，誕生前後のオスの精巣から分泌されるアンドロジェンがエストロジェンに変換された後に前腹側室周囲核 (AVPV)に作用し，AVPVでのキスペプチン発現を不可逆に抑制するためであると考えられる。新生児メスマウスを用いてエストロジェン投与によって変化する視床下部内の遺伝子発現をマイクロアレイ法によって網羅的に解析した結果，プロスタグランジンD2の合成酵素遺伝子 (ptgds)の発現がエストロジェンによって減少することが示された。そこで，本研究ではプロスタグランジンに着目し，げっ歯類のLHサージ発生機構に性差をもたらすメカニズムを解明することを目的とした。【方法】出生後0日の雌雄のWistar-Imamichi系ラット(n=5)から，AVPVを含む視床下部前部と視床下部内側基底部を含む視床下部後部を採取した。これら組織片におけるプロスタグランジン合成酵素遺伝子 (ptgs2，ptgds，ptges，ptgfs，ptgis，およびtbxas)の発現を半定量RT-PCRにより解析した。【結果】メスラットの視床下部前部におけるptgds発現量は，オスよりも有意に高かった。一方，視床下部後部におけるptgdsの発現量に雌雄差は認められなかった。その他のプロスタグランジン合成酵素遺伝子の発現量には，視床下部前部および後部ともに雌雄差は認められなかった。ptgdsによりコードされるPTGDSによって合成されるプロスタグランジンD2は，神経保護作用を有することが報告されている。本研究の結果から，発達期のげっ歯類メスの視床下部前方で高発現するプロスタグランジンD2の神経保護作用が，LHサージ発生機構の性差の形成に関与する可能性が示唆された。

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【目的】交尾排卵動物であるスンクス（Suncus murinus）の雌では，交尾刺激が脳の視索前野に存在するキスペプチンニューロンを活性化することによって，排卵制御に関わるキスペプチンや性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）の分泌を刺激し，排卵を誘起することが明らかになっている。しかしながら，交尾刺激がどのような神経回路を経て脳へと伝わり，視索前野のキスペプチンニューロンの活性化に繋がるのかは不明である。我々はこれまでに，スンクスでは第2仙骨神経（S2）および第3仙骨神経（S3）由来の知覚神経が主体となって交尾刺激を膣から受容することを明らかにしたが，これは交尾刺激を伝達する神経回路の一部を見出したにすぎない。そこで本研究では，視索前野に投射する神経細胞を逆行性トレーサー法によって明らかにし，S2，S3の知覚神経へとつながる経路を解明することで，交尾刺激を伝達する神経回路の全貌を明らかにすることを目的とした。【方法】4％PFAで固定した雌スンクスの脳を使用し，視索前野に神経トレーサーであるDiIの結晶を埋め，4％PFAに浸漬し，暗所37℃にて約2ヵ月間インキュベートした。その後，マイクロスライサーにて70 μmの横断切片を作製し，蛍光顕微鏡下で観察を行った。【結果】扁桃体内側基底核および扁桃体内側核，中脳水道周囲灰白質腹外側部，青斑核，孤束核など，様々な領域で標識された神経細胞体を確認することができた。哺乳類では古くから扁桃体から分界条を経て視床下部に投射する経路が知られており，スンクスにもこの経路が存在すると考えられた。また，哺乳類では触覚などの一般体性感覚が脊髄から上記の4領域へ伝達される経路も知られているため，膣で受け取られた交尾刺激が伝達される際には，S2，S3の知覚性脊髄神経から脊髄，さらに今回標識のあった扁桃体や中脳水道周囲灰白質，青斑核，孤束核などの領域を介して視索前野まで伝達される可能性が示唆された。

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【目的】脳室を裏打ちするグリア細胞の一種である上衣細胞は，近傍のニューロンの栄養支持細胞として機能することが知られている。これまで我々は，ラット第4脳室へのケトン体投与によりパルス状LH分泌が抑制されること，またラット後脳上衣細胞におけるケトン体輸送担体（Slc16a1)のタンパク質が発現することを報告した。これらの結果から，後脳上衣細胞はケトン体を低栄養シグナルとして感知し，後脳上衣細胞は摂食行動や性腺機能を制御するエネルギーセンサー細胞であるとの仮説を立てた。そこで本研究では，後脳上衣細胞におけるエネルギーセンシングの細胞内メカニズムをin vitroにて解析するため，上衣細胞の可視化を目指し，同細胞特異的に蛍光タンパク質（Venus）を発現するトランスジェニック（Tg）マウスの作出を目指した。また，このTgマウスの後脳上衣細胞を用いて，ケトン体感知を担うと考えられるSlc16a1遺伝子発現を解析した。【方法】上衣細胞特異的マーカーであるヴィメンチン遺伝子（Vim）のプロモーター（Vim上流3.2 kb）制御下で，Venusを発現するTgマウスを作出した。TgマウスのF2世代を用いて，脳室周囲のVenusの蛍光を観察した。また，Tgマウスの後脳脳室周囲の細胞を単離し，セルソーティング法を用いて分取したVenus陽性細胞500個を用いて，RT-PCR法にて後脳上衣細胞における遺伝子発現を解析した。【結果】5系統のVim-Venus始祖系統が得られ，その内1系統において，側脳室，第3脳室，中脳水道，第4脳室，および中心管の上衣細胞に明瞭なVenusの蛍光が検出され，上衣細胞を可視化したTgマウスが樹立された。また，分取したVenus陽性細胞におけるRT-PCR の結果，上衣細胞のマーカーであるVim，Slc16a1のmRNA発現が検出された。これらのことから，後脳上衣細胞において，ケトン体の感知によるエネルギーセンシングシステムがある可能性が示された。

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【目的】近年，前腹側室周囲核（AVPV）および弓状核（ARC）に局在するキスペプチン（Kp）ニューロンがそれぞれGnRHのサージ状分泌とパルス状分泌を制御することが示唆されている。ARCのKpニューロンはニューロキニンB(NKB)およびダイノルフィン（Dyn）を共発現することからKNDyニューロンと呼ばれている。NKBはGnRH/LHパルスに対して促進的に，Dynは抑制的に作用することが報告されている。本研究では GnRHニューロン，KNDyニューロンおよびAVPVのKpニューロンに発現する受容体遺伝子を解析することにより，Kp，NKB，およびDynの作用点を同定することを目的とした。【方法】GnRHもしくはKpを蛍光タンパクにより可視化した遺伝子改変ラットからGnRHおよびKpニューロンを採取し，Gnrh，Gpr54（Kp受容体遺伝子）， Tacr3（NKB受容体遺伝子），Oprk1 (Dyn受容体遺伝子)，Kiss1（Kp遺伝子），Tac2 (NKB遺伝子)および Pdyn (Dyn遺伝子)がGnRHおよびKpニューロンに発現するかを解析した。【結果】GnRHニューロンにはGnrh および Gpr54が検出されたがTacr3 および Oprk1は検出されなかった。ARCのKNDyニューロンにはKiss1，Tac2，Pdyn および Tacr3 が検出されたが，Gpr54 および Oprk1は検出されなかった。AVPVのKpニューロンにおいては Kiss1 発現のみが認められ，他の遺伝子は検出されなかった。ポジティブコントロールとして用いたラット視床下部組織では，上記全ての遺伝子の発現が確かめられた。以上より，KNDyニューロンから分泌されるNKBは近傍のKNDyニューロンに作用し，Dynは近傍のnon-KNDyニューロンを介してKNDyニューロンの活動を制御し，KpはGnRHニューロンに発現するGPR54を介してGnRH分泌を制御すると考えられる。

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【目的】キスペプチン−10（Kiss10）は性腺刺激ホルモン放出ホルモン分泌を促進することにより，黄体形成ホルモン（LH）分泌を刺激することが知られている。本研究では黄体期のヤギにKiss10を投与し，LHおよびプロジェステロン（P₄）分泌に及ぼす影響を検討した。【方法】正常な発情周期を営む雌シバヤギ3頭を反復供試した。超音波画像診断装置を用いて排卵日（Day 0）を特定し，黄体期（Day8～13）に処置を行った。頚静脈に留置したカテーテルを介して処置群にはKiss10（530㎍/5ml）を単回投与し，対照群には溶媒5mlを投与した。投与前2時間から投与後4時間まで10分間隔の頻回採血を行い，LHおよびP₄の血中濃度推移を観察した。また，次回排卵まで隔日もしくは連日採血を行い，同時に超音波画像検査により卵巣の変化を観察した。【結果】処置群において，Kiss10投与後速やかな血中LH濃度の上昇が観察された。投与前後の6時間における血中LH濃度を2時間毎の平均値として解析したところ，処置前2時間，処置後0～2時間および処置後2～4時間における血中LH濃度は，それぞれ0.16±0.06ng/ml，0.61±0.13ng/mlおよび0.18±0.01ng/mlであった。処置後2～4時間のLH濃度は，処置前2時間に比べて有意に高かったが（P<0.05），処置後2～4時間では低下し，処置前に比べて有意な差は認められなかった。一方，血中P₄濃度は処置前2時間，処置後0～2時間および処置後2～4時間において，それぞれ7.08±1.64ng/ml，8.95±2.15ng/mlおよび8.90±1.08ng/mlであり，処置後0～2時間および処置後2～4時間の血中P₄濃度は処置前2時間に比べて有意に高かった（P<0.05）。【考察】ヤギの黄体期におけるKiss10投与によりLHおよびP₄分泌が促進されることが示され，黄体期におけるKiss10単回投与は黄体機能を刺激する効果があることが示唆される。

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【目的】われわれは以前，黄体期初期の成熟雌ウシにおいてウシ全長キスペプチン（Kp-53）の末梢投与が第1卵胞発育波主席卵胞の発育およびLH分泌を刺激することを報告した（第104回本大会）。この結果から，キスペプチンの卵胞発育刺激効果がウシの発情行動の強化および排卵促進に利用できるのではないかと考えた。本研究では，卵胞期のウシを用いて，キスペプチンの末梢投与が性腺刺激ホルモン分泌，発情行動および排卵におよぼす効果を検討することを目的とした。【方法】黒毛和種経産雌ウシを用い，Presynch-Ovsynch法（Moreira et al., J. Dairy Sci., 86, 1646–59, 2001）を一部改変して適用し，プロスタグランジンF_2α（PG）-PG-GnRH-PGの順にそれぞれ11日，10日および7日間隔で筋肉内投与して卵胞期を誘導した。最後のPG投与から24時間後，Kp-53（2 nmol/kg, n=6）または生理食塩水（n=4）を静脈内投与した。Kp-53投与時から，2時間間隔で経時的に採血を行い，血漿中LH濃度を測定するとともに，4時間おきに30分間の行動観察を実施した。また，超音波画像診断装置により，Kp-53投与の24時間前から排卵を確認するまで6時間おきに主席卵胞の直径を測定した。【結果および考察】本実験では，Kp-53または生理食塩水投与時に存在していた主席卵胞が排卵した個体（グループ1，それぞれn=2およびn=3）と，同主席卵胞が閉鎖した後に新たに選抜された主席卵胞が排卵した個体（グループ2，それぞれn=4およびn=1）が観察された。両グループともに，Kp-53または生理食塩水投与の時間を基準として，LHサージのピーク，スタンディング発情の開始および排卵が観察された時間が，生理食塩水投与群と比較して，Kp-53投与群において早くなる傾向がみられた。これらの結果から，卵胞期におけるキスペプチンの末梢投与は，発情および排卵のタイミングを早める可能性が示唆された。また，Presynch-Ovsynch法において，最後のPG投与時に存在する主席卵胞の半数がすでに閉鎖する運命にある可能性が示された。

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【背景】キスペプチン誘導体であるTAK-683は去勢雄ヤギにおいて黄体形成ホルモン（LH）分泌を小さい振幅で長時間刺激することが示されている。本研究ではヤギの卵胞期にTAK-683を投与し，卵巣活動および性ホルモン分泌に及ぼす影響を検討した。【材料と方法】予備実験として卵巣摘出ヤギ（OVX）3頭を供試した。TAK-683（50 μg/頭）を静脈内に投与し，6分間隔6時間の頻回採血を行い，LH分泌動態を観察した。本実験では正常な発情周期を営む雌ヤギ（Intact）5頭を反復供試した。排卵日をDay0(第1回排卵)とし，Day10にプロスタグランジンF_2α(PGF_2α) 2mg/頭を筋肉内投与して黄体退行を誘起し，その12時間後に処置群(n=4)にはTAK-683（50 μg/頭），対照群(n=4)には生理食塩液を静脈内に一回投与した。採血は，Day0からPGF_2α投与後に観察された排卵（第2回排卵）に続く排卵(第3回排卵)まで連日もしくは隔日，さらにPGF_2α投与直前(0時間)から96時間は6時間間隔で行い，血漿中LH，卵胞刺激ホルモン（FSH），プロジェステロン（P₄）およびエストラジオール-17β（E₂）濃度を測定した。また超音波画像検査をDay0から第3回排卵まで隔日または連日で行い，卵胞および黄体の変化を観察した。【結果】OVXおよびIntactともに，TAK-683投与後LH濃度の上昇が観察されたが，上昇の振幅はIntactにおいて個体差が大きかった。本実験において，TAK-683投与後6時間の処置群における平均LHおよびFSH濃度は対照群に比べ有意に高かった。一方，処置群における血中E₂濃度は対照群に比べて投与後有意に低下した。第2回排卵において，処置群の排卵卵胞の最大直径は対照群に比べて有意に小さく，さらに処置群では第2回排卵後の黄体期における血中P₄濃度の低下が観察された。【結論】卵胞期におけるTAK-683の投与は性腺刺激ホルモン分泌を刺激し，未成熟卵胞の排卵につながることが推測された。

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This study was carried out to determine whether hypoxia is associated with luteinization. We examined the influence of hypoxia in progesterone (P4) production and protein expression of key steroidogenic factors in P4 biosynthesis; steroidogenic acute regulatory protein (StAR), cytochrome P450 side-chain cleavage (P450scc) and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) in cultured bovine luteinizing granulosa cells. Granulosa cells were obtained from small antral follicles (≤ 6 mm in diameter). To induce luteinization, the cells were treated for 24 h with insulin (2 µg/ml), forskolin (10 µM) or insulin (2 µg/ml) in combination with forskolin (10 µM). The treatments increased the P4 production in 24 h compared to untreated control. The cells were then incubated in 10% of O₂ as a hypoxic condition or 20% of O₂ as a normoxic condition for 24 h. Interestingly, P4 production by non-luteinizing granulosa cells (control) was not affected by hypoxia, while P4 production by granulosa cells treated with insulin and insulin in combination with forskolin significantly increased under hypoxic condition. Since hypoxia only affected P4 production by luteinizing granulosa cells, hypoxia seems to support but not to induce the luteinization. The protein expression of P4 key steroidogenic factors tended to increase under hypoxic condition with a significant increase only in StAR protein expression in granulosa cells treated with insulin in combination with forskolin. The overall results suggest that hypoxia plays a role during completing luteinization by enhancing P4 production through increasing StAR protein expression in bovine luteinizing granulosa cells.

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Hippo シグナルは細胞の増殖およびアポトーシスを調節することにより，器官サイズをコントロールすること，また細胞密度が hippo シグナルを調節する一つの因子であることが明らかにされてきた。最近，我々は hippo シグナルの構成因子である YAP1 がウシ黄体に発現すること，さらに YAP1 の核内発現が黄体初期に高く，黄体退行期に向かって減少していくことを見出した。YAP1 は細胞密度の低い時に核内に局在することが知られていることから，ウシ黄体は黄体初期には低密度であり成長に従い密度の高くなることが示唆される。しかし，ウシ黄体機能と細胞密度の関係については明らかにされていない。黄体は妊娠の成立に必須のプロジェステロン (P4) だけでなくエストラジオール (E2) も分泌することが知られている。そこで本研究ではウシ黄体機能に及ぼす細胞密度の影響を調べる目的で，1) 発情周期を通じたウシ黄体組織における P4 および E2 分泌を検討すると共に，2) 培養黄体細胞の P4 および E2 分泌に及ぼす細胞密度の影響についても検討した。P4 および E2 分泌は共に黄体初期に高く，退行期に向かうに従って減少した。P4 分泌は細胞密度に関わらず一細胞当たりの分泌量に変化は認められなかった。一方，E2 は低密度培養において高密度培養と比較して一細胞当たりの分泌量が高くなった。卵胞からの E2 は子宮内膜上皮細胞の増殖を促すことから，黄体の E2 は黄体内の細胞の増殖に関与するかもしれない。次に低密度培養が E2 分泌を上昇させる機構を調べるために，3) E2 分泌に必須の aromatase 発現に及ぼす細胞密度の影響を検討ところ，aromatase mRNA 発現に差は認められなかった。　本研究の結果より，E2 分泌は細胞密度の低い黄体期初期で高いこと，低密度で培養することにより E2 分泌の増加することが示され，この E2 分泌が黄体期初期における黄体の成長に寄与する可能性が示された。

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【目的】排卵後の卵巣に形成される黄体は妊娠の成立と維持に必須の内分泌器官であり，妊娠が成立しなかった際には子宮由来のprostaglandin F2α(PGF)により黄体が退行することで次の発情が回帰する。黄体から分泌されるprogesterone(P4)は胚の着床や排卵周期の調節に関わることが知られている。様々な動物種においてP4がoxytocin(OT)receptor発現を抑制することでOTによるPGF産生を抑制することが報告されている。我々は以前，ウシ子宮内膜間質細胞(STR)においてP4がglucocorticoid(GC)receptor発現を誘導することでGCによるPGF産生抑制作用を間接的に強める可能性を示した。一方，ウシにおいてP4はウシ子宮内膜上皮細胞(EPI)におけるPGF産生を刺激すること，ヒツジの子宮内膜においてP4がcyclooxygenase-2(COX-2)発現を刺激することが報告されており，P4によるPGF調節機構に関しては情報が錯綜している。P4には核内レセプター(nuclear P4 receptor; nPR)に結合し，標的遺伝子の転写を活性化するgenomic effectの他に，細胞膜レセプター(membrane P4 receptor; mPR)より開始されるnon-genomic effectの存在することが示されている。本研究では，PGF産生に及ぼすP4の作用機序を明らかにするために，ウシ子宮内膜におけるgenomic/ non-genomic経路を介したP4の影響を調べた。【方法】黄体初期の子宮内膜から得た子宮内膜細胞にP4(1–100 nM)およびP4-BSA(1–100 nM)を添加し24時間培養後に細胞および培養上清を回収した。その後1)EIAによりPGF濃度を2)定量的RT-PCR法によりPG合成酵素群のmRNA発現量を測定した。【結果】1)P4はEPIにおいてPGF産生を刺激する一方でSTRにおいてPGF産生を抑制した。P4-BSAはEPIにおいてPGF産生を刺激したが，STRでは影響を及ぼさなかった。2) P4はEPIにおいて各遺伝子発現に影響を及ぼさなかった。一方でP4はSTRにおいてPG合成酵素群のmRNA発現を抑制した。本研究より，P4はEPIにおいてnon-genomic経路を介してPGF産生を刺激し，STRにおいてgenomic経路を介してPGF産生を抑制することが示された。

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【目的】4ヶ月齢時に安息香酸エストラジオール製剤（EB）投与後，血中インスリン様成長因子（IGF）-1濃度の増加率の高い乳用雌子牛は，初産時の分娩前後のエネルギー状態が低く，卵巣機能回復が遅いが，乳量の多いことを報告した（第101，103回本大会）。しかし，4ヶ月齢時のEB投与による血中IGF-1濃度の増加率に個体差が認められた。そこで，IGF-1産生に不可欠な成長ホルモン受容体（GHR）の一塩基多型（SNP）が，EB投与によるIGF-1反応性に関与するのかについて，哺乳期間の発育状況も踏まえて検証した。【方法】2010–2012年に出生したホルスタイン種雌子牛71頭を供試した。出生直後および哺乳期間に週1回体重測定した。4ヶ月齢時に成牛の1/5量相当の400mgEBを投与し，投与前（0h）と24時間後（24h）の血液から，血中GHとIGF-1濃度および代謝物濃度を測定した。また血液からゲノムDNAを抽出後，PCR産物を制限酵素（NsiI）で処理しGHR-SNPを同定した。統計解析は，GHR-SNPの型によりGG群（n=54）とAG群（n=17）の2群で行った。【結果】出生時体重と哺乳日数，離乳時体重はGG群とAG群で差がなかった。また，EB投与前の血中代謝物濃度は両群間に差はなかった。EB投与0hと24hの血中IGF-1濃度は群間で差がなかったが，GG群ではEB投与により血中IGF-1濃度が増加したことに対し（0h；64 vs. 24h；73ng/ml，P＜0.01），AG群では変化しなかった（0h；61 vs. 24h；65ng/ml）。また，AG群において24hの血中GH（32 vs. 26 ng/ml，P=0.09）およびNEFA濃度（112 vs. 86 μEq/l，P=0.08）はGG群よりで高い傾向があった。以上より， NsiI制限酵素で同定されるGHR-SNP型の相異は，出生時および離乳時体重などの哺乳期の発育に影響を与えないが，EB投与によるIGF-1反応性には強く影響する可能性が示唆された。

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［目的］LHサージ後の顆粒膜細胞の黄体化に伴い増加するCyp11a1(P450scc)遺伝子発現変化にepigeneticな制御機構が関与するかを検討した。
［方法］3週齢SD系雌ラットにeCG 15 IUを皮下注し，その48時間後にhCG 15 IUを皮下注することで排卵誘発を行った。1) hCG投与後4，8，12hの卵巣から顆粒膜細胞を回収し，Cyp11a1 mRNAの発現変化を検討した。hCG未投与を0hとした。2) 0，4，12hから回収した顆粒膜細胞を用いてCyp11a1のpromoter領域について，①ChIP assayを用いたヒストン修飾(H3K4me3，H3K9me3，H3K27me3)の解析，②Bisulfite sequencing法を用いたDNAメチル化の解析，③DNase I chromatin accessibility assayを用いたクロマチン構造変化の解析を行った。
［結果］1) Cyp11a1 mRNAはhCG投与後増加し，4hにピークとなり，以後12hまで0hと比較し高値を維持した。2) ①promoter領域(−23bp～−206bp)では，転写活性に働くH3K4me3は12hに向かい有意に増加し，逆に転写抑制に働くH3K9me3とH3K27me3は12hに向かい有意に減少した。②promoter領域(約-500bpまで)の5 CpG部位のDNAは低メチル化であり，hCG投与後も有意な変化は認めなかった。③promoter領域(−23bp～−206bp)のクロマチン構造は0hと比較し，12hに向かい弛緩する方向に変化した。
［結語］顆粒膜細胞の黄体化に伴い増加するCyp11a1 mRNAの発現変化には，ヒストン修飾によるクロマチン構造の変化を介した転写調節が関与していることが考えられる。

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Background: Expression and the function of genes generating circadian rhythms in the ovary have not been fully examined from proestrous stage to estrous stage in spite of the interest for the involvement of the circadian clock on ovulation. Here, the circadian clock network and the involvement of one of its regulators, RevErba, in the expression of Cox2, the inducer of ovulation in ovaries, were examined. Results: Coordinated, rhythmic expression was found for main circadian regulatory genes, suggesting that the ovarian circadian clock is functional from proestrous to estrous stage. Because the expression level of RevErba was the lowest at the time of occurrence of LH surge but increased immediately after that, we hypothesized that the duration of the transient rise of Cox2 expression induced by LH surge is adjusted by the suppressive effect of REVERBa on Cox2 expression. Using cultured granulosa cells and a linker-scan mutagenesis screen of the potential regulatory region of Cox2, we identified REVERBa binding sites (RORE). Luciferase reporter vectors containing the promoter region of Cox2 with and without RORE (pGLR and pGLdR) were transfected into cultured mouse granulosa cells. Agreeing with our hypothesis, dose-dependent expression of RevErba into the culture cells suppressed the induction of pGLR by forskolin, which mimicks the LH surge in vitro. Contrarily, over-expression of RevErba did not affect expression of pGLdR. Finally, binding of REVERBa was detected to this regulatory region in phase of the beginning repression of endogenous Cox2. Conclusion: Our results suggest that RevErba is involved in fine-tuning of Cox2 expression, which is important for the efficiency of ovulation.

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【目的】哺乳類の卵母細胞の正常な発達には，周囲の顆粒膜細胞（卵丘細胞：CC，壁顆粒膜細胞：MG）が重要であり，一方で顆粒膜細胞の分化・機能制御には卵母細胞が分泌する増殖因子（卵因子）が大きな役割を果たす。一般に，細胞の分化・機能制御には，小分子非コードRNAであるマイクロRNA（miRNA）の関与が知られる。しかし，卵因子が顆粒膜細胞の分化・機能を制御する過程にmiRNAが関与しているのか，それどころか，顆粒膜細胞内において，卵因子による発現制御を受けるmiRNAが存在するのかさえ不明である。そこで本研究では，顆粒膜細胞において卵因子によって発現制御を受けるmiRNAを同定することを目的とした。【方法】CCとMGは卵母細胞との距離が異なることから，CC・MG間で発現差のあるmiRNAは卵因子の制御を受けている可能性がある。そこで，妊馬血清性性腺刺激ホルモンで刺激した3週齢B6D2F1雌マウスよりCC，MGを採取し，miRCURY LNA miRNA ArrayシステムによるmiRNAの網羅的発現比較を行った。また，卵母細胞との共培養（2 個/ μl）がMGにおけるmiRNA発現に与える影響を，リアルタイムPCRで解析した。【結果】マイクロアレイ解析により，CC・MG間で発現差の示唆されるmiRNAが複数同定された。これらについてリアルタイムPCRで発現を解析した結果，miR-322-5p（以下322）についてMGでCCの約10倍の発現が確認された（P<0.05）。また，卵母細胞との共培養によって，MGにおける322の発現は有意に抑制された（P<0.05）。これらのことは，卵因子がCCにおける322の発現を抑制することによって，CCとMG間で322の発現差が生じていることを示唆している。本研究では，CCとMGにおいて発現差のあるmiRNAが存在すること，そして，その発現差に卵因子が関わっている可能性を初めて明らかにした。

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【目的】卵子の発育は顆粒層細胞とのギャップ結合を介した物質交換やそれぞれが分泌する物質による相互作用の下行われる。卵子を裸化処理して顆粒層細胞と共培養すると，卵子と顆粒層細胞の間にギャップ結合を再構築する。さらに異種間においても卵子と顆粒層細胞が複合体を再構成する。しかし体外培養系にて複合体の再構成が卵子発育へ及ぼす影響を検証した例はない。本研究ではブタ初期胞状卵胞由来卵子を裸化処理し，培養期間中の卵子と顆粒層細胞の再凝集率と卵子発育を観察した。【方法】ブタ卵巣表面の初期胞状卵胞(直径500~700 µm)より卵子顆粒層細胞複合体(OGCs)を採取した。試験区は細胞を卵胞より分離して，さらに分散させた後添加したものをPiece区とし裸化卵子と再凝集させた。そして未処理のOGCs(Control区)とそれぞれ14日間個別培養を行った。培養期間中にOGCsの形態維持率と腔形成率，培養終了後に卵子の直径，支持細胞数，卵子核内のクロマチン形態，そして卵子の体外成熟率について観察した。【結果】培養期間中の形態維持率は差が見られなかった。また培養終了後の卵子直径は，培養開始時(90~100 µm未満)に比べて増大し(ControlおよびPiece区：113.3±1.3 µm，および113.4±1.3 µm)，差は見られなかった。さらに細胞数，核小体へのクロマチンの凝集についても試験区間で差はなかった。体外成熟培養後，MII期に達した卵子の割合は，Piece区で有意に低くなった。腔形成のタイミングはPiece区において2日程度遅れることが観察された。そこでPiece区の培養期間の延長をして核成熟率が補償されるのかについて検討したところ，14日より16日において成熟率が高くなった。このことから，体外で再構築したOGCsも,腔形成が遅延するものの卵子の発育支持能力を回復することが示唆された。本研究はJSPS科研費 25450400の助成を受けたものです。

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【目的】ウシの初期胞状卵胞から卵子顆粒層細胞複合体（OGCs）を取り出し，体外培養すると顆粒層細胞が卵子を取り巻くようにドーム状の腔を形成する。この腔形成は卵子の発育と密接な関係がある。本実験では96穴プレートを用いた場合，底の形状の違いが腔形成や卵子の発育にどのように影響するのかについて検討した。【方法】未発育卵子の体外培養にはBecton Dickinson社の96穴プレートで底の形状が平底（平底区），丸底（丸底区）を用いた。ウシ卵巣を食肉センターより持ち帰り，そこから採取した初期胞状卵胞（400–700 μm）より卵子顆粒層細胞複合体（OGCs）を採取した。採取したOGCsを20個ずつ平底区，丸底区でそれぞれ16日間個別培養した（OGCs/200 µl:1穴）。そして培養期間中4日おきに培地交換を行った。培養16日後，腔形成している卵子のみ選抜し体外成熟培養（5%FCS添加199培地中で23時間）に供した（OGCs/10 µl）。体外成熟培養後，核成熟率を観察した。次に体外成熟後，体外受精，体外発生（5%FCS添加合成卵管液）に供した（卵子/1 µl）。【結果】体外培養中の腔形成は培養4日目より開始し，培養8日目では平底区38.5%，丸底区50.3%が腔形成し，有意に丸底区の腔形成が早いことが明らかになった。その後16日目では平底区74.1％および丸底区74.4%となり最終腔形成率には差が見られなかった。次に成熟率は丸底区で高かったが，χ二乗検定では有意な差が認められなかった（25.8% vs 46.4%）。体外発育した卵子を体外成熟後，受精処理を施し胚盤胞期胚への発生率を比較したところ両区において分割率及び発生率間では差が認められなかった（平底 vs 丸底：分割率，31.7% vs 27.7%，発生率，2.8% vs 1.4%）。本研究では，培養開始時の腔形成は培養底面の形状に大きく影響されることが示された。

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【目的】原始卵胞の活性化を促すPTEN抑制剤と卵胞刺激ホルモン併用による新しいマウスの排卵誘起法が有望であることを第54回日本卵子学会にて報告した。本研究ではPTEN抑制剤の投与によるマウス卵巣の組織学的変化を観察した。【方法】本研究では誘起排卵低反応系統のA/J系マウスを使用した（平均排卵数9.5個）。PTEN抑制物質のDipotassium Bisperoxo(picolinato)oxovanadate (V)（bpV(pic)，Enzo）の用量と作用時間を調べるため，28日齢雌マウスに1個体当たり3 μg，30 μgの2用量および対照量（0 μg）をリンゲル液に溶かして投与後，1，2，3，4日目に2匹ずつ，安楽殺後に卵巣を採取した。10％中性緩衝ホルマリンで固定後，常法により卵巣のヘマトキシリンエオジン染色切片を作成した。顕微鏡下で組織像を観察した。【結果】コントロール群の卵巣では，徐々に胞状卵胞数が減少する傾向が見られた。3 μg投与群では1日目は胞状卵胞が少ないが，2日目に増加傾向にあり，その後徐々に数が減っていくようであった。30 μg投与群では，全ての期間で小さめの胞状卵胞が一定数存在するが，2日目には減少傾向が見られた。【考察】前回の報告では30 μgのbpV(pic)を投与後，2日目にPMSG，4日目にhCGを投与した場合，誘起排卵数がコントロールに比べ低かった。これは組織学液観察からもbpV(pic)投与後2日目の胞状卵胞数の少なさと小ささによるものと思われた。一方，3 μg投与群では3日目か4日目をPMSGの時期としたが，組織学的にはむしろ2日目の方で胞状卵胞数が多く，より早い時期にPMSGを開始すべきと思われた。このようにPTEN阻害剤は数的にも質的にも卵胞発育を変化させることから，PMSGとhCGの投与タイミングを調整することに，より卵胞発育が向上すると思われた。

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【目的】加齢ウシから採取した初期胞状卵胞由来卵子のGSH含量が若齢ウシに比べて少なくなること，初期胞状卵胞の顆粒層細胞では，抗酸化関連の遺伝子発現が低調になっていることを我々は示している。そこで抗酸化作用のあるN-アセチル-L-システイン（NAC）が加齢ウシ初期胞状卵胞由来卵子の体外発育能力に及ぼす影響を検討した。【方法】食肉センター由来の老齢ウシ（120か月以上）卵巣の表面を薄く剥離し，初期胞状卵胞（卵子直径90–99 μm）を採取した。そこから卵子顆粒層細胞複合体を30個採取した。これらをTCM-199基礎培地でNAC 1.2 mMを添加したNAC添加区および非添加区で16日間個別培養を行った。実験1では体外発育した卵子の体外成熟を行いNACが成熟率に及ぼす影響を観察した。実験2では体外発育卵子に対して体外受精処理を行いNACが受精率に及ぼす影響を観察した。実験3では体外発育した卵子を用いて胚盤胞期胚までの発生率を対象に観察を行った。【結果】NAC添加は初期胞状卵胞由来卵子のROS含量を培養2日目及び4日目ともに低下させる傾向が観察された。実験1：体外発育卵子の核成熟率はNAC添加区で63.9 %，非添加区で68.0 %となり，NAC添加は核成熟率に影響を及ぼさなかった。実験2：体外発育卵子の受精率については，正常受精がNAC添加区39.2 %，非添加区40.5 %となり，多精子受精はNAC添加区が 35.1 % 非添加区が 28.4 %となり，NACの効果は観察されなかった。ただしこの多精子受精率は，前実験として若齢のウシを用いた場合の多精子受精率に比べても非常に高い値であった。実験3：体外発育した卵子の受精後の分割率は，NAC添加区67.2 %，非添加区45.3 %であり，より分割の進んだ胚が添加区に多い傾向が認められたが，有意な効果は観察されず，胚盤胞期胚は非添加区においてのみ観察された。本実験ではNAC添加により，加齢個体から採取した初期胞状卵胞卵子の胚盤胞期胚までの発生率を改善することができなかった。本研究はJSPS科研費 25450400の助成を受けたものです。

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【目的】糖尿病は卵子の成熟や胚の質の劣化を招くことが知られている。一方で，体外での卵子発育を用いて卵子の質と高グルコースの関係について調べた報告はない。本研究では，高グルコース濃度条件下がブタ初期胞状卵胞由来卵子顆粒層細胞複合体（OGCs）の体外発育能力に及ぼす影響について検討した。【方法】屠場由来ブタ卵巣から初期胞状卵胞（500–700 μm）由来OGCsを採取し，卵子直径が90–100 μmのものを12日間の個別培養に供試した。体外発育培養はαMEMを基礎培地（グルコース5.5 mM；Control区）とし，高グルコース濃度区（Glu区）は，最終グルコース濃度が11 mMとなるように調整した。Glu区は，一般に糖尿病と診断される血中グルコース濃度（7 mM以上）を参考に設定した。これら2区間における腔形成率，卵子直径，体外成熟率および胚発生率を観察した。さらに，培養期間中のグルコース消費量および卵胞腔液のグルコース濃度を測定した。【結果】培養12日目におけるGlu区の培地中グルコース濃度は8.8 mMであり，OGCsを高グルコース濃度で暴露できていることが示された。グルコースの消費量は腔を形成したOGCsで高く，Glu区で有意に高い値となった（Control区 vs. Glu区；2.3 mM vs. 3.1 mM，p<0.05）。しかしながら，培養期間中の腔形成率に差は認められず，また得られた卵子の直径，クロマチン凝集形態および体外成熟率はGlu区でやや高い傾向が示された。また，体外発育後の卵子のH4K12におけるアセチル化状態およびmTORリン酸化状態においても差は認められず，両区共に同程度の単為発生胚が得られた。これらの結果より，本研究に用いたグルコース濃度条件下では卵子の発育への影響は観察されなかった。現在，高グルコースが卵子に大きな影響を与えない背景を明らかとするため，体外で腔を形成したOGCsの腔液中に含まれるグルコース濃度を検証している。

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［目的］げっ歯類の卵巣において，時計遺伝子であるBmal1およびPer2が性周期中に周期的な発現振動(概日リズム)を繰り返していることが知られている。しかし，性周期中に起こる卵胞発育および排卵過程におけるゴナドトロピンと時計遺伝子との関係を詳細に検討した研究は少ない。そこで本研究は，内分泌環境が極めて未発達な未成熟マウスに妊馬性性腺刺激ホルモン(eCG)およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を投与して誘導した卵胞発育および排卵過程において，Bmal1およびPer2の発現振動を検証した。［方法］供試動物は，未成熟(3週齢)マウスを用いた。(実験1)卵胞発育を誘導するため，腹腔内にeCG(5IU)を投与し(0時)，投与後24時まで4時間おきに卵巣および肝臓を採取した。(実験2)eCG投与後48時に排卵を誘導するためhCGを投与し(0時)，投与後24時まで4時間おきに卵巣および肝臓を採取した。採取した各臓器からRNAを抽出し，逆転写反応によりcDNAを作製した。各臓器におけるBmal1およびPer2遺伝子の発現推移は，リアルタイムPCRにより測定した。［結果および考察］ポジティブコントロールとして採取した肝臓におけるBmal1およびPer2遺伝子の発現振動は，eCG処理の有無に関わらず明瞭な周期性が認められた。このことは，肝臓がゴナドトロピンの投与に関係なく独立した明瞭な周期性をもつことを示している。(実験1)卵巣におけるBmal1およびPer2遺伝子の発現はeCG処理の有無に関わらず周期性は認められなかった。(実験2)hCG処理の有無に関わらず，Per2遺伝子は明瞭な周期性が認められた。また，Bmal1遺伝子は対照区のみ周期性が認められた。以上の結果から，ゴナドトロピンは卵巣における時計遺伝子の周期的な概日リズムに関与しない可能性が示唆された。このことは，卵巣における時計遺伝子は周期性というよりはむしろ，時計遺伝子の機能が重要であるかもしれないことを示唆している。

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